王甲甲，張　娟，王智斌，黃文芳

(四川省醫(yī)學科學院/四川省人民醫(yī)院檢驗科，成都 610072)

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CTLA-4基因多態(tài)性與肝細胞癌易感性的相關分析*

王甲甲，張娟△，王智斌，黃文芳

(四川省醫(yī)學科學院/四川省人民醫(yī)院檢驗科，成都 610072)

[摘要]目的分析細胞毒T淋巴細胞抗原4(CTLA-4)基因多態(tài)性-318 T/C、CT60 G/A與肝細胞癌(HCC)易感性之間的相關性。方法選取于2012年9月至2014年8月就診于四川省人民醫(yī)院的277例HCC患者及306例健康體檢者作為研究對象，所有研究對象均為漢族人。抽取各研究對象外周血5 mL，離心分離血清，采用化學發(fā)光法檢測血清中甲胎蛋白(AFP)的水平；采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法檢測血清中白細胞介素(IL)-2、IL-4、轉化生長因子-β(TGF-β)的水平。抽提全血基因組DNA，PCR擴增后直接測序法檢測CTLA-4 -318 T/C、CT60 G/A基因多態(tài)性的分布。結果CTLA-4 -318 T/C，CT60 G/A的3種基因型均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。CTLA-4 -318 CC和CT60 AA與降低HCC的風險有關，CTLA-4 CT60 G/A不同基因型與血清AFP水平有明顯相關性(χ2=12.779，P=0.012)。攜帶CTLA-4 -318 T、CT60 G等位基因的HCC患者血清中IL-2、IL-4水平明顯降低，TGF-β水平顯著升高，且CTLA-4 -318 T與HCC的分級有明顯的相關性。結論CTLA-4 -318 TT能夠促進HCC的發(fā)生、發(fā)展，這可能與下調Th1/Th2型細胞因子，上調Th3型細胞因子有關。

[關鍵詞]細胞毒T淋巴細胞抗原4；基因多態(tài)性；肝細胞癌；細胞因子

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，我國肝癌的年死亡率達20/10萬，在惡性腫瘤的死亡率中高居第2位，對社會帶來了巨大的負擔[1]。乙型肝炎病毒(B type hepatitis virus,HBV)是公認的肝癌發(fā)病的高危因素，大多數肝癌為肝細胞型，然而并非所有感染HBV的患者均會發(fā)展成肝癌，環(huán)境因素和免疫學因素可能在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中起關鍵作用[2]。細胞毒T淋巴細胞相關抗原4(cytotoxic T lymphocyte antigen 4，CTLA-4)基因位于染色體2q33上，能夠通過與CD28競爭結合B7-1/B7-2，發(fā)揮其負向調節(jié)T細胞增殖、激活的作用，下調T細胞反應和外周耐受[3]。CTLA-4基因有多個單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)位點及重復序列，SNP的存在可從不同的方面影響CTLA-4基因的表達，目前，已有實驗證據表明CTLA-4 -318 T/C、CT60 G/A與宮頸癌、肺癌、淋巴瘤等的遺傳易感性有關[4-6]，而CTLA-4 -318 T/C、CT60 G/A是否與肝癌的發(fā)病有關仍未見報道。本研究對CTLA-4 -318 T/C、CT60 G/A與肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的易感性進行研究，以期為肝癌的治療及風險預測提供理論依據。

1資料與方法

1.1一般資料選取2012年9月1日至2014年8月31日本院確診的HCC患者共277例(HCC組)，年齡24～73歲，平均(53±12)歲，男235例，女42例，且經病理學、影像學及肝臟穿刺活檢證實，所有患者血清均在未做任何治療前采集。對照組選擇本院體檢中心無血緣關系的健康體檢者306例，年齡22～70歲，平均(51±13)歲，男 266例，女40例。HCC組和對照組均為四川漢族人群，組間年齡及性別構成比相匹配，并排除糖尿病、甲狀腺功能亢進、類風濕關節(jié)炎等自身免疫疾病史，無傳染病史、免疫疾病治療史或其他惡性腫瘤病史。HCC的診斷參照《中華肝臟病雜志》新的HCC診斷標準并經病理學確診[7]。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，臨床資料及標本采集均獲患者知情同意。

1.2方法

1.2.1標本的收集采集空腹外周靜脈血5 mL分別置于紅色無抗凝劑干燥管和乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)紫色抗凝管(美國BD公司)。干燥管室溫靜置15 min，待其自然凝固后，以1 500 g離心5 min，收集血清用于甲胎蛋白(AFP)、白細胞介素(IL)-2、IL-4、轉化生長因子-β(TGF-β)水平的檢測?？鼓捎萌蚪M小量抽提試劑盒(北京三博遠志生物公司)提取全血DNA作為聚合酸鏈反應(PCR)模板，操作步驟按試劑盒說明書進行。分離的血清及抽提的基因組DNA均置于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2血清AFP水平的檢測血清AFP水平的檢測均采用化學發(fā)光法。所有標本依次用全自動化學發(fā)光儀i2000SR(美國雅培公司)進行測定。

1.2.3細胞因子的測定血清中細胞因子IL-2、IL-4、TGF-β水平的檢測采用酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)。應用人IL-2、IL-4、TGF-β ELISA試劑盒(美國R&D公司)進行檢測，具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.2.4PCR擴增及測序分析用紫外分光光度計檢測DNA的濃度，并用去離子水調整其濃度至 5 ng/μL。PCR引物用Primer premier 5.0軟件設計，由上海生物工程公司合成。CTLA-4 -318 T/C，CT60 G/A的引物分別如下，-318 T/C (F:AGGATGGTGCTTCACAGAT;R:AGCCAATCCATGGAT GGA)，產物長度為341 bp；CT60 G/A (F:TGCAAGTCATTCTTGGAAG;R:CTGTGATAGTT GAGCTGA),產物長度為395 bp。PCR反應體系20 μL：基因組DNA 2 μL(約0.2 μg)，10×PCR Buffer 2 μL，25 mM MgCl2溶液2 μL，10 mmol/L dNTPs 2 μL，1 U/μL Taq DNA聚合酶(Fermentas中國公司)2 μL和5 μmol/L上、下游引物各1 μL，滅菌ddH2O 8 μL。反應參數：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 再延伸5 min。反應結束后取PCR產物3 μL進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，確定PCR產物為目的片段，且無非特異性擴增后，直接送上海生物工程公司測序。

2結果

2.1兩組臨床及生化指標的比較對HCC組和對照組的基本情況進行統(tǒng)計，結果表明，兩組間年齡、性別之間基本無差異(P>0.05)。86.6%的HCC患者均能檢測到HBV感染呈陽性。根據癌細胞的分化程度，將肝細胞癌分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4級，以中分化型HCC(Ⅱ、Ⅲ)最為多見，見表1。

表1　兩組對象臨床及生化指標比較[n(%)]

-：此項無數據。

2.2不同組別基因型和等位基因頻率分析CTLA-4 -318 T/C，CT60 G/A的3種基因型均符合Hardy-Weinberg 平衡(P>0.05)。CTLA-4 -318 CC和CT60 AA與降低HCC的風險有關(P=0.000，OR：0.579，95%CI：0.449～0.747；P=0.000，OR=0.453，95%CI：0.351～0.586)。與對照組相比，攜帶CTLA-4 -318 T，CT60 G等位基因的HCC患者明顯增加(P<0.05),見表2。

表2　不同組別CTLA-4 SNPs的分布情況[n(%)]

-：此項無數據。

2.3CTLA-4 -318 T/C，CT60 G/A不同基因型與AFP濃度的相關性對攜帶CTLA-4 -318 T/C，CT60 G/A不同基因型的HCC患者血清AFP濃度進行檢測，結果見表3。按AFP水平的高低共分為<20 ng/mL(低)、20～200 ng/mL(中)、>200 ng/mL(高)3個等級，對攜帶不同基因型的HCC患者的AFP水平進行分類，結果表明，CTLA-4 -318 T/C不同基因型與血清AFP水平無明顯相關性(P>0.05)，而CT60 G/A不同基因型與血清AFP水平有明顯相關性(χ2=12.779，P=0.012)。

2.4CTLA-4 -318 T/C，CT60 G/A不同基因型與細胞因子的關系見表4，對照組攜帶CTLA-4 -318 T/C，CT60 G/A不同等位基因與血清IL-2、IL-4、TGF-β水平均無明顯相關關系(P>0.05)。在HCC組，與攜帶-318 C、CT60A等位基因的患者相比，攜帶-318 T、CT60 G等位基因的患者血清中IL-2、IL-4、TGF-β水平均有明顯變化，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表3　CTLA-4 不同基因型與AFP濃度的相關性[n(%)]

表4　CTLA-4 基因多態(tài)性與血清細胞因子水平的關系±s)

CTLA-4 -318 TT與TC+CC，CT60 GG與AG+AA相比較。

2.5CTLA-4 -318 T/C，CT60 G/A與臨床病理學分級之間的相關性隨著HCC惡性程度的增加，CTLA-4 -318的基因型發(fā)生了從CC到TT的轉變，CT60的基因型發(fā)生了從AA到GG的轉變。通過比較發(fā)現，CTLA-4 -318基因型在不同分級HCC患者中的分布差異有統(tǒng)計學意義(χ2=34.448，P<0.05)，而CTLA-4 CT60基因型在各分級HCC患者中分布差異無統(tǒng)計學意義(χ2=11.137，P>0.05)，見表5。

表5　CTLA-4 -318、CT60不同基因型在HCC患者中的分布

3討論

CTLA-4是一種很重要的免疫抑制分子，CTLA-4與T細胞表達的CD28共同競爭結合于抗原提呈細胞B7分子，發(fā)揮免疫抑制作用[8]。CTLA-4基因有多個SNP存在，單堿基的變化可影響氨基酸的改變，進而造成蛋白表達的異常，影響其和配體的結合，其中，位于CTLA-4基因啟動子區(qū)的-318及非翻譯區(qū)的CT60 SNP位點的變異被證實與哮喘、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、Graves病等自身免疫性疾病的發(fā)生有關[9-11]，也有研究對CTLA-4 -318、CT60 SNPs與宮頸癌、肺癌等多種腫瘤的關系作了探討[4-5]，但仍未有關于CTLA-4 -318、CT60 SNPs與肝癌相關性的報道。

本研究旨在探討CTLA-4 -318、CT60 SNPs與HCC的相關性，由于HBV感染是導致肝細胞癌的高危因素，所有參與對象均需進行常規(guī)的HBV檢測，結果發(fā)現，86.6%的HCC患者HBV檢測呈陽性，這與其他研究報道結果基本一致[12]。對各參與者CTLA-4 -318 T/C,CT60 G/A基因多態(tài)性進行檢測，結果顯示，CTLA-4 -318 CC和CT60 AA與降低HCC的風險有關，-318 T和CT60 G等位基因均與HCC的發(fā)生有明顯關系。

長期以來，AFP 被認為是診斷肝癌最好的腫瘤標志物，特異性較高，但其敏感度僅為40%～65%，仍有近1/3的肝癌患者血清AFP呈陰性或低濃度，有相當高的漏診率[13]。在本研究中，對所有HCC患者的AFP水平進行檢測，結果發(fā)現，AFP<20 ng/mL的患者占15.2%，20～200 ng/mL的患者占18.4%，而AFP>200 ng/mL的患者占66.4%，其中，AFP陰性或低濃度的HCC患者占33.6%，與國內其他研究報道相一致[13]。對攜帶CTLA-4 -318 T/C，CT60 G/A不同基因型的HCC患者血清AFP濃度進行檢測，結果發(fā)現，CTLA-4 -318 T/C不同基因型與血清AFP水平無明顯相關性，而CT60 G/A不同基因型與血清AFP水平有明顯相關性(χ2=12.779，P=0.012)。目前，仍沒有HCC患者CTLA-4 -318 T/C，CT60 G/A不同基因型與血清AFP水平相關性方面的研究，因此，該結論仍需進一步通過擴大標本量進行驗證。

CTLA-4目前被認為是調節(jié)性T細胞的標志物，能夠分泌TGF-β，IL-10兩種細胞因子(Th3型細胞因子)，抑制CD4+Th細胞和CD8+細胞毒性T細胞的作用，下調抗腫瘤免疫反應[14]。因此，筆者推測，CTLA-4 SNPs可能通過激活細胞因子通路調節(jié)HCC發(fā)生的敏感性。在本研究中，分別對不同CTLA-4基因型與血清Th1型細胞因子IL-2、Th2型細胞因子IL-4、Th3型細胞因子TGF-β 水平之間的相關性進行檢測，結果顯示，攜帶CTLA-4-318 TT和CT60 GG的HCC患者血清中IL-2、IL-4水平均較低，而TGF-β水平較高。這些研究結果初步證實，CTLA-4-318 T和CT60 G等位基因在HCC的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，其可能是通過下調Th1/Th2型細胞因子的表達，上調Th3型細胞因子的表達來實現的。

對CTLA-4 -318 T/C、CT60 G/A與臨床病理學分級的相關性進行分析，結果發(fā)現，隨HCC惡性程度的增加，CTLA-4 -318、CT60的主要基因型分別發(fā)生了從CC到TT，AA到GG的轉變。不同CTLA-4 -318基因型的HCC分級有明顯統(tǒng)計學差異，而CTLA-4 CT60基因型在各分級HCC患者中分布無統(tǒng)計學差異。該實驗進一步證實了CTLA-4 -318T在HCC發(fā)生、發(fā)展中的作用。

綜上所述，CTLA-4 -318 T/C、CT60 G/A均與HCC的發(fā)生有密切關系，其可能與下調Th1/Th2型細胞因子，上調Th3型細胞因子有關，且-318 T/C與HCC的進展有明顯相關關系，而CT60 G/A與HCC的進展無關。從遺傳學的角度認為攜帶-318T、CT60G等位基因存在肝癌遺傳易感性，但腫瘤的發(fā)病是多基因遺傳與多環(huán)境因素共同作用的結果，故該結果可能仍存在一定的局限性。因此，今后應在擴大樣本量的基礎上對CTLA-4基因多態(tài)性與肝癌之間的關系進行深入研究，以進一步明確其在肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。

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Analysis on correlation between cytotoxic T lymphocyte antigen 4 gene polymorphisms and susceptibility to hepatocellular carcinoma*

Wang Jiajia,Zhang Juan△,Wang Zhibin,Huang Wenfang

(Department of Clinical Laboratory,Sichuan Provincial Academy of Medical Sciences/Sichuan Provincial People′s Hospital,Chengdu Sichuan 610072,China)

[Abstract]ObjectiveTo analyse the correlation between cytotoxic T-lymphocyte antigen-4 (CTLA-4) gene polymorphism -318 T/C,CT60 G/A and the susceptibility of hepatocellular carcinoma (HCC).MethodsTotally 277 cases of HCC and 306 healthy controls in our hospital from September 2012 to September 2014 were selected as the research subjects,all subjects were Han nationality.The peripheral blood (5 mL) in each case was collected for separating serum,the AFP level was detected by chemilunescent method,the serum IL-2,IL-4 and TGF-β levels were detected by ELISA.Genomic DNA was extracted,after PCR amplification,the CTLA-4 -318 T/C,CT60 G/A gene polymorphism distributions were detected by the direct sequencing method.ResultsThe CTLA-4 -318 CC and CT60 AA genotypes all conformed to the Hardy-Weinberg equilibrium(P>0.05).CTLA-4 -318 CC and CT60 AA were related with the HCC risk decrease,different genotypes of CTLA-4 CT60 G/A had obvious relation with serum AFP level(χ2=12.779，P=0.012).The serum IL-2 and IL-4 levels in the HCC patients carrying CTLA-4 -318 T and CT60 G allele were significantly decreased,while the TGF-β level was significantly increased,moreover CTLA-4 -318 had obvious relation with the HCC grading.ConclusionCTLA-4 -318 TT could promote the occurrence and progression of HCC,which might be related with the down-regulation of Th1/Th2 type cytokines,and up-regulation of Th3 type cytokine.

[Key words]cytotoxic T lymphocyte antigen 4;genetic polymorphisms;hepatocellular carcinoma;cytokines

doi:論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.09.011

* 基金項目：四川省衛(wèi)生和計劃生育委員會基金資助項目(140071)。

作者簡介：王甲甲(1984-)，博士，主管技師，主要從事腫瘤免疫學方面的研究。△通訊作者，E-mail：xywjj08@163.com。

[中圖分類號]R735.7

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)09-1186-04

(收稿日期：2015-09-15修回日期：2015-12-13)