林志雄，殷靜雯△，冼君定，顏海鋒，鄒曉波

(1.廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院精神心理科，廣東湛江 524001；2.廣東醫(yī)學(xué)院，廣東東莞 523808)

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血漿纖溶酶原與BDNF在抑郁模型大鼠海馬區(qū)的表達(dá)及相關(guān)性研究*

林志雄1，殷靜雯1△，冼君定2，顏海鋒1，鄒曉波1

(1.廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院精神心理科，廣東湛江 524001；2.廣東醫(yī)學(xué)院，廣東東莞 523808)

[摘要]目的探討血漿纖溶酶原和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)與抑郁癥的相關(guān)性，加深對(duì)抑郁癥發(fā)病分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為抑郁癥的診斷和治療提供新的思路。方法建立慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激大鼠抑郁模型，檢測大鼠快感缺乏，行為活動(dòng)減少，體質(zhì)量減輕等抑郁樣癥狀。采用蛋白免疫印跡法分析大鼠海馬組織血漿纖溶酶原和BDNF蛋白表達(dá)情況。結(jié)果血漿纖溶酶原和BDNF在對(duì)照組和觀察組大鼠海馬區(qū)表達(dá)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。血漿纖溶酶原與BDNF的變化呈明顯正相關(guān)(r=0.65,P<0.01)，線性回歸分析表明二者之間存在明顯的依存關(guān)系(r2=0.423),回歸方程為：YBDNF=0.750X血漿纖溶酶原+0.201。結(jié)論應(yīng)激可影響神經(jīng)細(xì)胞的生長和存活，導(dǎo)致大鼠抑郁樣行為的發(fā)生。同時(shí)檢測到血漿纖溶酶原和BDNF的表達(dá)下降，BDNF與血漿纖溶酶原的表達(dá)呈正相關(guān)，提示血漿纖溶酶原和BDNF共同參與抑郁癥的發(fā)病機(jī)制。

[關(guān)鍵詞]抑郁癥；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；血漿纖溶酶原

抑郁癥是臨床最常見的精神疾病之一，但是其發(fā)病機(jī)制尚未明確。近年有學(xué)者提出了抑郁癥的神經(jīng)營養(yǎng)假說(neurotrophin hypothesis of depression)，認(rèn)為多種應(yīng)激(壓力)能夠降低海馬中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的信號(hào)調(diào)節(jié)作用(降低BDNF的表達(dá))，使神經(jīng)細(xì)胞突觸數(shù)量減少和神經(jīng)細(xì)胞凋亡而引起抑郁；抗抑郁藥物能夠增強(qiáng)BDNF信號(hào)調(diào)節(jié)的作用(增強(qiáng)BDNF的表達(dá))，提高突觸的可塑性和促進(jìn)神經(jīng)元的生存來發(fā)揮治療抑郁的效果[1]，更進(jìn)一步的研究提示，BDNF 表達(dá)又受到血漿纖溶酶原(plasminogen)的調(diào)節(jié)[2]。故此，推測血漿纖溶酶原可以通過調(diào)節(jié)BDNF來參與抑郁癥的發(fā)病與治療。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Sprague-Dawley(SD)大鼠24只，雄性，10周齡，體質(zhì)量(200±50)g。每籠4只，室溫(20±2)℃，光照12 h(6:00 ～18：00)和黑暗12 h(18:00～6:00)環(huán)境飼養(yǎng)，適應(yīng)環(huán)境1周。采用區(qū)組隨機(jī)化分組方法，以體質(zhì)量作為配伍因素，分為對(duì)照組和觀察組，每組12只。

1.2方法

1.2.1大鼠抑郁模型采用慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激抑郁模型(chronic unpredictable mild stress，CUMS)。觀察組大鼠共接受21 d各種不同的隨機(jī)安排的應(yīng)激刺激，包括：冰水游泳、室溫游泳、夾尾、整夜光照、潮濕墊料，采用無放回的抽簽法安排每周刺激，每天1種。

1.2.2行為學(xué)測驗(yàn)以糖水消耗量，體質(zhì)量和曠場試驗(yàn)作為行為學(xué)評(píng)分方法。分別在實(shí)驗(yàn)處理前1天和造模第21天于隔音、安靜的房間施測。糖水消耗量測驗(yàn)要求在訓(xùn)練動(dòng)物適應(yīng)1%蔗糖24 h后，測定2 h內(nèi)糖水消耗量。曠場實(shí)驗(yàn)：采用自制50 cm×50 cm×40 cm周邊不透明立方體敞箱，底面黑色并用白線劃分為25個(gè)面積相等的方格(10 cm×10 cm)。均在9：00～10:30進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。室內(nèi)隔音并保持安靜，恒定光源，操作者將大鼠放入曠場正中格內(nèi)，用攝像設(shè)備記錄大鼠在5 min內(nèi)行為變化，包括水平運(yùn)動(dòng)(穿越格子數(shù))、垂直運(yùn)動(dòng)(站立次數(shù))、停留時(shí)間，四只爪子均進(jìn)入一格記錄水平運(yùn)動(dòng)1次，兩前爪騰空或攀附墻壁記錄垂直運(yùn)動(dòng)1次。

表1　各組大鼠行為學(xué)評(píng)分

1.2.3標(biāo)本采集及Western blot檢測采用脊椎脫臼法處死大鼠，將大鼠放置于冰上，快速剪毛、開顱，取出兩側(cè)海馬組織，液氮快速冷凍于-80 ℃冰箱儲(chǔ)存。將大鼠海馬組織研磨至組織完全裂解。將組織裂解液高速離心(4 ℃，10 000 r/min，15 min)；取淡黃清亮的蛋白上清液。BCA法測定蛋白濃度并調(diào)平，用移液槍將15 μL蛋白樣品液體和mark緩慢加入樣品孔中。用60 v進(jìn)行濃縮膠電泳，30 min后再轉(zhuǎn)成恒壓120 v在分離膠中電泳，時(shí)間90 min。冰浴下，用恒流300 mA電流轉(zhuǎn)膜50 min，PBS-T浸洗。將膜用密封袋裝好，依次加入5%封閉蛋白、一抗封閉液，二抗封閉液，以上每一步后均放入0.5‰PBS-T中，用搖床揺洗5次，每次5 min，速率為90 r/min。全暗房內(nèi)曝光，將曝光好的膠片放入37 ℃烘箱中烤干。

2結(jié)果

2.1行為學(xué)評(píng)分應(yīng)激前，兩組大鼠糖水消耗量、體質(zhì)量、曠場試驗(yàn)水平運(yùn)動(dòng)得分、垂直運(yùn)動(dòng)得分和停留時(shí)間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。試驗(yàn)處理后，兩組糖水消耗量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，對(duì)照組體質(zhì)量增長率顯著高于觀察組(P<0.05)，觀察組水平運(yùn)動(dòng)得分和垂直運(yùn)動(dòng)得分顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，觀察組停留時(shí)間顯著長于對(duì)照組(P<0.01)，見表1。

圖1　Western blot法檢測大鼠海馬組織血漿纖溶酶原和BDNF的表達(dá)

表2　Western blot檢測血漿纖溶酶原、BDNF在大鼠海馬組織中的表達(dá)±s)

2.2Western blot檢測血漿纖溶酶原和BDNF的表達(dá)對(duì)照組和觀察組大鼠海馬區(qū)血漿纖溶酶原和BDNF表達(dá)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) ，見表2、圖1、2。血漿纖溶酶原和BDNF在大鼠海馬區(qū)的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.67,P=0.51)。通過對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)與回歸分析顯示，血漿纖溶酶原與BDNF的變化呈明顯正相關(guān)(r=0.65,P<0.01)，它們之間存在明顯的依存關(guān)系，回歸方程為：YBDNF=0.750X血漿纖溶酶原+0.201。

*：P<0.01，與對(duì)照組比較。

圖2Western blot 檢測BDNF、血漿纖溶酶原蛋白在大鼠海馬組織中的表達(dá)

3討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：應(yīng)激可影響神經(jīng)細(xì)胞的生長和存活并出現(xiàn)快感缺失，行動(dòng)能力減弱，體質(zhì)量減輕等一系列與抑郁相關(guān)的癥狀。同時(shí)檢測到血漿纖溶酶原和BDNF的表達(dá)明顯下降，且兩者的表達(dá)呈正相關(guān)，提示血漿纖溶酶原和BDNF共同參與抑郁癥的發(fā)病機(jī)制。

3.1BDNF與抑郁癥相關(guān)評(píng)價(jià)試驗(yàn)證實(shí)抑郁模型已經(jīng)造模成功后，檢測對(duì)照組和觀察組大鼠海馬中BDNF的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，本研究結(jié)果支持此結(jié)果，小鼠經(jīng)受21 d慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激后BDNF表達(dá)較對(duì)照組明顯減少。表明BDNF與抑郁相關(guān)，BDNF具有促進(jìn)突觸生長、維持神經(jīng)元生存的作用。Taliaz等[3]通過RNA干擾技術(shù)進(jìn)行BDNF基因敲除的小鼠研究還發(fā)現(xiàn)，海馬齒狀回部位BDNF表達(dá)下降直接減少了神經(jīng)細(xì)胞的生成，小鼠出現(xiàn)了抑郁樣行為。尸檢發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者腦內(nèi)海馬區(qū)BDNF較健康對(duì)照組顯著下降[4]。并且，腦內(nèi)BDNF水平上升可以產(chǎn)生抗抑郁效果。Hoshaw等[5]對(duì)兩種抑郁癥行為(強(qiáng)迫游泳和習(xí)得性無助)小鼠的中腦和海馬部位直接灌注外源性BDNF，發(fā)現(xiàn)其海馬部位會(huì)迅速且持久地產(chǎn)生類似抗抑郁作用。

BDNF通過維持神經(jīng)元的生存而防止抑郁癥的發(fā)生?？赡艿臋C(jī)制為：BDNF與酪氨酸蛋白激酶B(tyrosine kinase B,TrkB)結(jié)合后可激活多條信號(hào)傳導(dǎo)通路，其中絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase,MAPK/Erk)通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)最為重要[6]。首先Erk的激活在突觸可塑性調(diào)節(jié)中起著重要的作用[7]；其次，MAPK/Erk通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)調(diào)控使cAMP反應(yīng)性元件結(jié)合蛋白(cAMP response elementbinding protein,CREB)磷酸化，從而增加B淋巴瘤細(xì)胞-2 (B-cell lymphoma 2,Bcl-2)的合成，可抑制細(xì)胞凋亡[8-9]。

也有學(xué)者對(duì)BDNF與抑郁癥的關(guān)系提出質(zhì)疑。Pawlak等[10]對(duì)野生型C57/BL6小鼠連續(xù)施加21 d，每次6 h束縛性應(yīng)激后(用金屬絲束縛頭部和夾尾)，檢測到神經(jīng)元的突觸減少，但BDNF的表達(dá)較對(duì)照組沒有顯著改變。這提示可能有多重途徑調(diào)節(jié)突觸神經(jīng)元的可塑性和存活。BDNF并不是惟一的調(diào)節(jié)因子[10]。

3.2血漿纖溶酶原與抑郁癥本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抑郁模型造模成功后，血漿纖溶酶原在海馬區(qū)的表達(dá)較對(duì)照組顯著減少，提示其含量與抑郁癥密切相關(guān)。Pawlak等[10]認(rèn)為N-甲基-D-天冬氨酸受體 (N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDA)在神經(jīng)突觸可塑性中起著重要的作用，并且通過檢測生長相關(guān)蛋白(growth-associated protein,GAP-43)的表達(dá)和高爾基染色法觀察神經(jīng)元突觸的生長，在對(duì)血漿纖溶酶原(-/-)小鼠施加慢性束縛性刺激的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了血漿纖溶酶原向廣譜蛋白血漿纖溶蛋白酶(plasmin)轉(zhuǎn)換的過程是應(yīng)激后NMDA受體減少的重要因素。另有學(xué)者的研究也證實(shí)血漿纖溶酶原可能通過其他分子通路調(diào)節(jié)抑郁癥。

3.3BDNF、血漿纖溶酶原與抑郁癥應(yīng)激可以引起大腦，特別是海馬內(nèi)一系列的生化反應(yīng)。長期應(yīng)激引起的大腦結(jié)構(gòu)、功能、分子機(jī)制的改變，可導(dǎo)致認(rèn)知、情緒和行為的改變。本研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)激可影響神經(jīng)細(xì)胞的生長和存活并出現(xiàn)快感缺失，行動(dòng)能力減弱，體質(zhì)量減輕等一系列與抑郁相關(guān)的癥狀。同時(shí)檢測到血漿纖溶酶原和BDNF的表達(dá)下降，二者的表達(dá)呈線性相關(guān)，表明血漿纖溶酶原與BDNF的表達(dá)均受到應(yīng)激的影響。血漿纖溶酶原可能作為BDNF的上游調(diào)控因子，可能通過對(duì)BDNF水解過程的調(diào)控，參與抑郁癥的發(fā)病的生化過程[11]。血漿纖溶酶原的精氨酸561-纈氨酸562之間的肽鍵可以被t-PA裂解，形成有活性的plasmin[12]。plasmin是一種廣譜蛋白酶，在機(jī)體的凝血和纖溶反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。plasmin可以水解pro-BDNF，將其轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓腂DNF后，與酪氨酸蛋白激酶B(tyrosine kinase B,TrkB)結(jié)合，促進(jìn)突觸的生長、維持神經(jīng)細(xì)胞生存[11]。而另一部分 pro-BDNF與神經(jīng)生長因子受體p75( p75 neurotrophin receptor,p75NTR)結(jié)合后會(huì)抑制突觸的生長，特別是當(dāng)形成pro-BDNF/p75NTR/sortilin三聚體時(shí)，將會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[13-14]。血漿纖溶酶原和BDNF的表達(dá)水平?jīng)Q定著神經(jīng)細(xì)胞的生長和凋亡，與抑郁癥密切相關(guān)。

綜上所述，試驗(yàn)運(yùn)用慢性刺激施加于大鼠，模擬人類抑郁的發(fā)病過程建立抑郁模型后，觀察組大鼠表現(xiàn)出快感缺乏、行為活動(dòng)減少、體質(zhì)量減輕等抑郁癥狀及海馬區(qū)發(fā)生病變，同時(shí)檢測到海馬內(nèi)血漿纖溶酶原和BDNF的表達(dá)較對(duì)照組顯著下降。進(jìn)一步證實(shí)血漿纖溶酶原-BDNF通路維持神經(jīng)細(xì)胞的生長這一過程與抑郁癥相關(guān)。血漿纖溶酶原作為兩條通路的共同因子，可能成為研究抑郁癥發(fā)病機(jī)制和治療抑郁癥新的靶點(diǎn)。血漿纖溶酶原和BDNF的調(diào)控關(guān)系還需要在基因敲除小鼠中進(jìn)一步驗(yàn)證，同時(shí)本實(shí)驗(yàn)中沒有進(jìn)行NMDA受體通路的研究，不能排除NMDA受體通路和BDNF通路是否存在相互作用。有研究發(fā)現(xiàn)血漿纖溶酶原大量存在于人的血液和組織液中，血液中和腦內(nèi)血漿纖溶酶原水平的相關(guān)性可能成為診斷和治療抑郁癥的重要依據(jù)，血漿纖溶酶原將有望成為抑郁癥的診斷標(biāo)記因子。

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Study on plasminogen and BDNF expression in the hippocampus of depression rat mode and its relationship*

Lin Zhixiong1,Yin Jingwen1△,Xian Junding2,Yan Haifeng1,Zou Xiaobo1

(1.Department of Psychiatry，Affiliated Hospital of Guangdong Medical College,Zhanjiang,Guangdong 524001,China; 2.Guangdong Medical College,Dongguan,Guangdong 523808,China)

[Abstract]ObjectiveTo study on the relationship between plasminogen and brain-derived neurotrophic factor(BDNF),and explain the molecular mechanism of depression，then provide new clew for diagnosis and treatment of depression.MethodsThe chronic unpredictable mild depression rat mode was established，then depression symptoms including absence of delight，the decline of actions and activities， and weight reduction of rat were tested.The levels of individual plasminogen and BDNF in hippocampus were determined by Western blot.ResultsThe expression of BDNF and plasminogen in depression rat mode and control group was significantly different(P<0.01),and there was a positive correlation between BDNF and plasminogen(r=0.65,P<0.01).According to the linear-regression analysis ，there was a dependence relationship between them(r2=0.423).The equation of regression was YBDNF=0.750XPlasminogen+0.201.ConclusionStress could affect the growth and survival of nerve cell,which lead to the depression behavior of rats,meanwhile,the decline of plasminogen and BDNF levels，the positive correlation between them illustrate that plasminogen and BDNF take part in the mechanism of depression.

[Key words]depressive disorder;brain-derived neurotrophic factor;plasminogen

doi:論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.09.006

* 基金項(xiàng)目：湛江市科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(2013B01039)。

作者簡介：林志雄(1974-)，學(xué)士，主任醫(yī)師，主要從事抑郁癥的臨床與基礎(chǔ)研究?！魍ㄓ嵶髡?E-mail:amysays@live.cn。

[中圖分類號(hào)]R749.4+1

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)09-1170-03

(收稿日期：2015-09-28修回日期：2015-12-22)