白治苗，盧玉鳳，楊　眉，李望舒，哈春芳

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院婦產(chǎn)科/寧夏生育力保持重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004)

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OPN干預(yù)子宮內(nèi)膜異位癥腺上皮細(xì)胞中NF-κBp65表達(dá)及其對細(xì)胞侵襲性的影響*

白治苗1，盧玉鳳1，楊眉1，李望舒1，哈春芳2△

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院婦產(chǎn)科/寧夏生育力保持重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004)

[摘要]目的探討子宮內(nèi)膜異位癥(EMS)患者在位內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中骨橋蛋白(OPN)對核因子κB(NF-κB)p65表達(dá)的影響及其與細(xì)胞侵襲的關(guān)系。方法原代分離培養(yǎng)12例EMS患者在位內(nèi)膜原代腺上皮細(xì)胞。采用OPN siRNA干擾細(xì)胞24 h后收集，Western blot、RT-PCR方法分別檢測干預(yù)前、后細(xì)胞中OPN、NF-κBp65蛋白及其mRNA表達(dá)情況；Transwell試驗(yàn)檢測干預(yù)前、后細(xì)胞侵襲性的變化。采用相同劑量的無RNA酶水干預(yù)EMS患者在位內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞作為未干預(yù)組。結(jié)果與干預(yù)前比較，OPN siRNA干擾后細(xì)胞中OPN蛋白、mRNA的表達(dá)明顯下降(t1=7.92，t2=9.87，P<0.05)；與未干預(yù)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；OPN siRNA干擾后細(xì)胞中NF-κBp65蛋白及mRNA的表達(dá)明顯減弱(t1=-2.13,t2=- 8.61,P<0.05)，與未干預(yù)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。OPN siRNA干擾后原代腺上皮細(xì)胞的侵襲性明顯降低(t=2.38,P<0.05)，與未干預(yù)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。OPN、NF-κBp65在EMS患者在位內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)呈明顯的正相關(guān)(r=0.87)。結(jié)論OPN siRNA沉默EMS患者腺上皮細(xì)胞中的OPN后OPN、NF-κBp65的表達(dá)及細(xì)胞的侵襲性均明顯降低，且二者呈明顯正相關(guān)，揭示二者極有可能在異位細(xì)胞的侵襲中發(fā)揮同步協(xié)調(diào)作用。

[關(guān)鍵詞]子宮內(nèi)膜異位癥；骨橋蛋白質(zhì)；核因子-κBp65

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMS)簡稱內(nèi)異癥，是指具有活性的子宮內(nèi)膜組織(腺體和間質(zhì))出現(xiàn)于子宮內(nèi)膜以外的部位，導(dǎo)致臨床上常見的痛經(jīng)或慢性盆腔痛、不孕等為主要臨床癥狀的疾病，目前病因及發(fā)生機(jī)制尚不十分明了，因而臨床缺乏有效的根治性治療方法，是婦科醫(yī)生亟待解決的難題之一[1-2]?；A(chǔ)和臨床研究顯示EMS是一種子宮內(nèi)膜活性增高所致的內(nèi)膜異常性基因疾病，與內(nèi)膜細(xì)胞的異地黏附和侵襲性增強(qiáng)有關(guān)[3]。EMS的黏附、侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及術(shù)后易復(fù)發(fā)等特性類似于惡性腫瘤。腫瘤學(xué)研究顯示，骨橋蛋白(osteopontin，OPN)通過與其受體結(jié)合后激活依賴MAPK/PI3K通路的核因子-κB(NF-κB)通路，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞中尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMPs)的分泌,介導(dǎo)細(xì)胞侵襲過程與細(xì)胞遷移，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移[4]。因此國內(nèi)外很多學(xué)者將血管生長因子或黏附分子OPN、MMP9及NF-κB等與EMS的發(fā)生、發(fā)展聯(lián)系起來，并揭示了這些因子可能與內(nèi)膜的異位黏附、侵襲性相關(guān)[5-6]。但二者的相關(guān)性及其與細(xì)胞侵襲性的確切機(jī)制不清。故本研究旨在通過OPN siRNA干擾原代腺上皮細(xì)胞探討OPN、NF-κBp65與EMS發(fā)病及細(xì)胞侵襲性的關(guān)系。

1資料與方法

1.1一般資料

1.1.1標(biāo)本獲取收集2013年12月至2014年12月于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院婦產(chǎn)科因EMS行子宮全切術(shù)患者12例，用棉拭子將宮腔內(nèi)的黏液蘸掉，用手術(shù)刀的刀背刮取內(nèi)膜，快速于低溫下轉(zhuǎn)移至細(xì)胞間,進(jìn)行原代細(xì)胞分離培養(yǎng)。

1.1.2納入標(biāo)準(zhǔn)所有研究對象的年齡20～45歲，平均(32.41±5.43)歲，患者手術(shù)前月經(jīng)周期均正常(28～35 d)，均處于Ⅱ期(按照1985年AFS提出的修正EMS分期法)，近3個月均未接受過激素類藥物的治療，無生殖道炎癥及其他婦科疾病，無慢性肝炎、糖尿病、腫瘤等慢性疾病史。

1.2方法

1.2.1原代腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)選取EMS患者行子宮全切術(shù)術(shù)后的子宮，術(shù)后用棉拭子蘸除黏液，手術(shù)刀刀背刮取內(nèi)膜，置于含10 mL培養(yǎng)液的滅菌小瓶中，內(nèi)含1%胎牛血清、DMED/F12(Penicillin及鏈霉素各100 U/mL)，冰浴快速轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞間,用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗掉新鮮的子宮內(nèi)膜組織中的血液成分，用眼科剪將內(nèi)膜剪成約1 mm3大小的組織塊，加入含有0.25%膠原酶/dispase(終濃度為1 mg/mL)的培養(yǎng)液中，于37 ℃用一次性吸管吹打消化3次，每次10 min，加入含血清的培養(yǎng)液終止消化，500 r/30 s離心，取上清液重復(fù)離心5次，沉淀中加入培養(yǎng)液，制成細(xì)胞懸液。細(xì)胞計數(shù)后，均勻?qū)⒓?xì)胞接種于60 mm培養(yǎng)皿中，置于37 ℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2OPN siRNA干擾待上述原代細(xì)胞融合度為70%～90%時，進(jìn)行siRNA干擾。分別用500 μL Opti-MEM無血清培養(yǎng)基稀釋10 μL TransLipid HL,500 μL Opti-MEM無血清培養(yǎng)基稀釋10 μL OPN特異性siRNA及干擾siRNA(稀釋前的siRNA濃度20 μM),于室溫靜置5 min后，將稀釋好的OPN特異性siRNA(OPN siRNA干預(yù)組)及干擾siRNA(siRNA干預(yù)組)與TransLipid HL輕柔混合后室溫靜置20 min后，將混合物分別加入含5 mL Opti-MEM無血清培養(yǎng)液的60 mm培養(yǎng)皿中，其中一組加入相同劑量無RNA酶水干預(yù)的培養(yǎng)液作為空白對照組(未干預(yù)組)。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h后更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.3RT-PCR總RNA的提取直接在60 mm培養(yǎng)皿中加入600 μL裂解液RZ裂解細(xì)胞并反復(fù)抽打至溶液透明，將勻漿樣品室溫放置5 min，加入150 μL氯仿，劇烈震蕩15 s后室溫放置3 min，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，將水相轉(zhuǎn)移至新的Ep中。加入150 μL無水乙醇，混勻后將溶液轉(zhuǎn)入吸附柱CR3中，再次離心，棄掉收集管中的廢液，向吸附柱CR3中加入500 μL去蛋白液RD，離心，棄廢液，將CR3放回收集管中，再次向吸附柱CR3中加入500 μL漂洗液RW，室溫靜置2 min，離心，棄廢液，將吸附柱放入2 mL收集管中，離心去掉殘余液體，最后將吸附柱CR3轉(zhuǎn)入一個新的1.5 mL離心管中，加30 μL無酶的雙蒸水，室溫放置2 min，4 ℃ 12 000 r/min離心2 min后于BioTek ELx808酶標(biāo)儀上行RNA純度及濃度的測定。

1.2.4Western blot檢測按照凱基蛋白質(zhì)說明書提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，并于酶標(biāo)儀中進(jìn)行蛋白定量。根據(jù)待測蛋白分子的大小制備適宜濃度的SDS分離膠及濃縮膠，插入相應(yīng)大小的梳子，加入相應(yīng)分組中蛋白樣品及標(biāo)準(zhǔn)蛋白標(biāo)志物，電泳分離蛋白質(zhì)后，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白于硝酸纖維素膜；載有蛋白的硝酸纖維素膜經(jīng)5% 脫脂牛奶封閉后，加入NF-κBp65、OPN及內(nèi)參照β-actin等一抗4 ℃過夜，經(jīng)TBST換洗1次(5 min),5次后加相應(yīng)二抗孵育2 h，增強(qiáng)型ECL顯影，于BIO-RAD成像儀中曝光成像并測定各蛋白條帶光密度值，計算相應(yīng)的光密度比值。

1.2.5穿膜實(shí)驗(yàn)(transwell)待預(yù)先培養(yǎng)于60 mm培養(yǎng)皿中的EMS原代腺上皮細(xì)胞以及OPN siRNA干擾24 h后的細(xì)胞融合至80%～90%時，用0.25%的胰酶將其消化，采用無血清培養(yǎng)液將其制成細(xì)胞懸液，用一次性吸管吸取1滴進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)后，將懸液加入小室中(細(xì)胞數(shù)目大約為105)，于小室的下室中加入有血清的培養(yǎng)液后置于37 ℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，洗掉培養(yǎng)液，用棉拭子將小室正面的細(xì)胞輕輕擦掉后PBS沖洗2～3次，用無水乙醇固定30 min后PBS沖洗2～3次，0.4%臺盼藍(lán)染色10 min后，將小室的膜固定于載玻片上在顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。

1.2.6結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)(1)Western blot結(jié)果分析：采用BIO-RAD成像儀掃描滴加DAB顯色劑后的蛋白條帶，成像并保存圖片，采用軟件Quality One進(jìn)行灰度值掃描。(2)RT-PCR結(jié)果分析：用BIO-RAD凝膠掃描系統(tǒng)分析攝像，用Roche-Lightcycler 96對產(chǎn)物進(jìn)行半定量分析。(3)Transwell結(jié)果：0.4%臺盼藍(lán)染色10 min后，將小室膜刮下貼于載玻片上，滴加二甲苯，蓋上蓋玻片封片，置于Leica DC 300F正置顯微鏡下固定選取16個視野于10倍鏡下進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。

1.3主要試劑OPN siRNA、干擾siRNA(上海Invitrogen貿(mào)易有限公司)；TransLipid HL Transfection Reagent(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；細(xì)胞全RNA提取試劑盒(上海田根有限公司)；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermol公司)；免疫熒光定量試劑盒(Thermol公司)；兔抗人NF-κBp65、OPN多克隆抗體分別由北京中杉生物工程公司、美國Abcam生物公司生產(chǎn)(稀釋濃度分別為1∶100、1∶80)。

2結(jié)果

2.1OPN siRNA干擾前后OPN、NF-κBp65蛋白表達(dá)比較與siRNA干預(yù)組比較，OPN siRNA干擾EMS患者在位內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞后OPN蛋白及mRNA明顯下降(OPN蛋白3.10±0.26 vs. 0.40±0.07，t1=7.92；OPN mRNA 2.80±0.25 vs. 0.30±0.08,t2=9.87，均P<0.05)。siRNA干預(yù)組與未干預(yù)組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖1～3、表1。

A:未干預(yù)組；B:siRNA干預(yù)組；C:OPN siRNA干預(yù)組。

圖1OPN siRNA干擾前后OPN、NF-κBp65蛋白在腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)

a:P<0.05，與OPN siRNA干預(yù)組比較。

圖2OPN siRNA干擾前后OPN蛋白、mRNA蛋白在腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)

2.2OPN siRNA干擾前后NF-κBp65蛋白、mRNA的表達(dá)比較與siRNA干預(yù)組比較，OPN siRNA干擾后細(xì)胞中NF-κBp65蛋白及mRNA的表達(dá)明顯減弱，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(NF-κBp65蛋白2.90±0.26 vs. 1.20±0.09，t1=-2.13,mRNA 3.50±0.28 vs. 1.30±0.10，t2=-8.61,均P<0.05)。siRNA干預(yù)組與未干預(yù)組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖1、3、4、表1。

圖3　OPN siRNA干擾前后OPN、NF-κBp65

2.3OPN siRNA干擾前后細(xì)胞侵襲性比較與siRNA干預(yù)組比較，OPN siRNA干擾后原代腺上皮細(xì)胞的侵襲性明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(65.0±3.78 vs.24.0±1.56,t=2.38,P<0.05),siRNA干預(yù)組與未干預(yù)組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖5、6、表1。

a:P<0.05，與OPN siRNA干預(yù)組比較。

圖4OPN siRNA干擾前后NF-κBp65蛋白、mRNA在腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)

圖5　3組顯微鏡下圖像

a:P<0.05，與OPN siRNA干預(yù)組比較。

圖6OPN siRNA干擾前后原代腺上皮細(xì)胞的侵襲性比較

圖7　　OPN、NF-κBp65在腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)關(guān)系

2.4OPN、NF-κBp65在細(xì)胞中的表達(dá)關(guān)系OPN、NF-κBp65在EMS患者在位內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)呈明顯的正相關(guān)(r=0.87)，見圖7。

表1　OPN siRNA干擾前后OPN、NF-κBp65蛋白、mRNA積極細(xì)胞侵襲性的變化

3討論

OPN是從骨組織中分離出來的一種磷酸化糖蛋白，組成結(jié)構(gòu)中富含精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸序列。有研究表明，OPN與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，它通過與其受體avβ3結(jié)合后激活依賴MAPK/PI3K通路的NF-κB通路，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞中尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)和MMPs的分泌,介導(dǎo)細(xì)胞侵襲過程、MMPs的降解和重塑、細(xì)胞遷移、宿主免疫細(xì)胞的逃逸和新生血管的形成及發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤血管的生成及腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生[7-9]。NF-κB是Sen與Baltimore于1986年首次在成熟的淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子,它是NF-κB/Rel蛋白家族成員之一,以最常見的p50/p65異源性二聚體形式存在于細(xì)胞核中參與許多基因轉(zhuǎn)錄的起始調(diào)節(jié)，如眾多的細(xì)胞因子、黏附分子、蛋白酶類及炎癥因子[10]。在人體的正常情況下，NF-κB存在于細(xì)胞質(zhì)并與其抑制蛋白(IkB)結(jié)合,當(dāng)受到外界異常刺激時,使IkB 磷酸化并被水解使NF-κB與抑制劑分離從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核參與細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[11]。近幾年，NF-κB在EMS中的研究頗受關(guān)注。本課題組的前期試驗(yàn)已經(jīng)在EMS患者及大鼠EMS模型的組織及細(xì)胞水平證實(shí)OPN、NF-κBp65在EMS的在位、異位內(nèi)膜中高表達(dá)且呈正相關(guān)，且二者與細(xì)胞的侵襲性明顯相關(guān)，通過雌孕激素及其激活劑、抑制劑干預(yù)EMS患者在位內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，OPN、NF-κBp65的表達(dá)及細(xì)胞的侵襲性也相應(yīng)增加及減弱[12]。國內(nèi)孫群燕[13]建立小鼠EMS模型并給予基因NF-κBp50敲除后發(fā)現(xiàn)與雌激素介導(dǎo)的痛覺過敏和炎癥性疼痛密切相關(guān)的PKCepsilon因子的表達(dá)明顯減弱，與激素類藥物緩解EMS患者癥狀的機(jī)制相符,進(jìn)一步驗(yàn)證了NF-κB在EMS的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，與本課題組前期試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

EMS在病理上雖為良性疾病但其有著與惡性腫瘤相似的特征，如異地黏附、侵襲、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)等，EMS的治療手段很有限，主要以手術(shù)治療為首選,但手術(shù)常難以清除所有藥物治療病灶[14-15]。國內(nèi)有學(xué)者通過構(gòu)建OPN-siRNA的慢病毒載體,發(fā)現(xiàn)可以明顯抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞、胃癌細(xì)胞系GC9811的增殖，進(jìn)而為惡性腫瘤的治療奠定了基礎(chǔ)[16-17]。故本試驗(yàn)通過探索導(dǎo)致EMS的關(guān)鍵因子進(jìn)而通過阻斷其表達(dá)來達(dá)到EMS的靶向治療。本研究在前期試驗(yàn)結(jié)果OPN、NF-κB于EMS患者在位、異位內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中高表達(dá)的基礎(chǔ)上，通過質(zhì)粒構(gòu)建OPN 特異性siRNA干擾EMS患者在位內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞后經(jīng)Westen blot、RT-PCR及穿膜實(shí)驗(yàn)等方法檢測發(fā)現(xiàn)OPN、NF-κBp65蛋白、mRNA的表達(dá)明顯下降，且腺上皮細(xì)胞的侵襲性也相應(yīng)降低。因此，本研究結(jié)果提示，OPN可能是通過NF-κB通路促進(jìn)uPA、MMPs的分泌，加速細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜降解，促進(jìn)異位內(nèi)膜的黏附、種植和生長，進(jìn)而誘導(dǎo)EMS的發(fā)生。但是確切的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。因此，筆者認(rèn)為NF-κB極有可能是OPN誘導(dǎo)EMS發(fā)生的關(guān)鍵樞紐，也是EMS藥物靶向治療的關(guān)鍵點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

[1]Zhang J,Leng J,Dai Y,et al.Significance of symptom and physical sign to diagnosis of deeply infiltrating endometriosis[J].Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi，2014,49(8):599-603.

[2]Brown J,Farquhar C.An overview of treatments for endometriosis[J].JAMA,2015,313(3):296-297.

[3]Kobayashi H,Higashiura Y,Shigetomi H,et al.Pathogenesis of endometriosis:the role of initial infection and subsequent sterile inflammation[J].Mol Med Rep,2014,9(1):9-15.

[4]Riku D,Subha PD,Ganapati H,et al.Osteopontin:it′s role in regulation of cell motility and nuclear factorκB-mediated urokinase type plasminogen activator expression[J].Iubmb Life,2005,57(6):441-447.

[5]劉玉鋒,哈春芳,馬遠(yuǎn).OPN與MMP-9在子宮腺肌癥內(nèi)膜上皮細(xì)胞的表達(dá)和意義[J].寧夏醫(yī)學(xué)雜志，2014,36(7)：580-581.

[6]楊眉,蔣春樊,年妍，等.雌激素對子宮內(nèi)膜異位癥內(nèi)膜OPN與MMP-9表達(dá)及腺上皮細(xì)胞侵襲性的影響[J].寧夏醫(yī)學(xué)雜志，2014,36(7):577-579.

[7]Xiao Y,Li T,Xia E,et al.Expression of integrin β3 and osteopontin in the eutopic endometrium of adenomyosis during the implantation window[J].Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol,2013,170(2):419-422.

[8]Xu ST,Guo C1,Ding X,et al.Role of osteopontin in the regulation of human bladder cancer proliferation and migration in T24 cells[J].Mol Med Rep,2015,11(5):3701-3707.

[9]Liu J,Liu Q,Wan Y,et al.Osteopontin promotes the progression of gastric cancer through the NF-kappaB pathway regulated by the MAPK and PI3K[J].Int J Oncol，2014,45(1):282-290.

[10]Wei W,Yuan YH,Gao YN,et al.Polygalasaponin F inhibits secretion of inflammatory cytokines via NF-κB pathway regulation[J].J Asian Nat Prod Res，2014,16(8):865-875.

[11]Heyninck K,Lahtela-Kakkonen M,Van der Veken P,et al.With aferin A inhibits NF-kappaB activation by targeting cysteine 179 in IKKβ[J].Biochem Pharmacol，2014,91(4):501-509.

[12]哈春芳,肖成明,張晟寧,等.開放法大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型的建立與評價[J].山東大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版,2011,49(1):1671-1675.

[13]孫群燕.NF-kappaB p50 基因敲除小鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型的建立及其研究[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2012,24(6):243-245.

[14]Vercellini P,Vigano P,Somigliana E,et al.Endometriosis:pathogenesis and treatment[J].Nat Rev Endocrinol，2014，10(5):261-275.

[15]Anborgh PH,Mutrie AB,Chambers AF.Role of the metastasis-promoting protein osteopontin in the tumour microenvironment[J].J Cell Mol Med，2010,14(8):2037-2044.

[16]唐紅衛(wèi),潘陽林,聶勇戰(zhàn)，等.Osteopontin特異性siRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在GC9811胃癌細(xì)胞中沉默效應(yīng)的鑒定[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2005,26(3):202-205.

[17]邢譯文,白靜,范維寧,等.OPN siRNA慢病毒載體的構(gòu)建及其對大腸癌細(xì)胞增殖的抑制作用[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2014,34(3):350-354.

Expression of NF-κBp65 in glandular epithelial cells of endometriosis after OPN intervention and its influence on cell invasiveness*

Bai Zhimiao1,Lu Yufeng1,Yang Mei1,Li Wangshu1,Ha Chunfang2△

(1.Ningxia Medical University,Yinchuan,Ningxia 750004,China;2.General Hospital of Ningxia Medical University/Key Labroatory of Fertility Preservation and Maintenance of Ningxia,Yinchuan 750004,China)

[Abstract]ObjectiveTo explore the influence of OPN in eutopic glandular epithelial cells of endometriosis on the NF-κBp65 expression and its relationship with the cell invasion.MethodsThe eutopic primary glandular epithelial cells in 12 cases of endometriosis were performed the primary isolation and culture.The cells were collected after 24 h OPN siRNA intervention.Western blot and RT-PCR methods were adopted to detect the expressions of OPN,NF-κBp65 protein and its mRNA before and after intervention.The Transwell experiment was used to detect the change of cell invasiveness before and after intervention.ResultsThe expression of OPN protein and mRNA after interfering primary glandular epithelial cells by OPN siRNA was significantly decreased,and the difference was statistically significant (t1=7.92,t2=9.87,P<0.05).the expression of NF-κB p65 protein and mRNA after OPN siRNA interfering primary glandular epithelial cells was obviously weakened,the difference was statistical significant(t=2.38,P<0.05).the invasiveness of primary glandular epithelial cells after OPN siRNA intervention was significantly decreased,the difference was statistically significant(t=2.38,P<0.05).The expression of OPN and NF-κBp65 had a significantly positive correlation in eutopic endometrial glandular epithelial cells (r=0.87).ConclusionThe expression of OPN and NF-κBp65 is significantly decreased after OPN siRNA interfering eutopic endometrial glandular epithelial cells,therefore OPN most likely lead to the occurrence and development of endometriosis via the NF-κB pathway.

[Key words]endometriosis;osteopontin;NF-κBp65

doi:論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.09.004

* 基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81160078)。

作者簡介：白治苗(1991-)，碩士，住院醫(yī)師，主要從事婦科腫瘤方面的研究?！魍ㄓ嵶髡?E-mail：hachunfang@163.com。

[中圖分類號]R574

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)09-1163-04

(收稿日期：2015-10-08修回日期：2015-12-22)