盧芳芳，況　燕，徐朝歡，王　旗，李美儀

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，南寧 530021)

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NDY1 shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及其在卵巢癌A2780細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)*

盧芳芳，況燕△，徐朝歡，王旗，李美儀

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，南寧 530021)

[摘要]目的構(gòu)建NDY1 shRNA真核表達(dá)載體，并獲得穩(wěn)定表達(dá)shNDY1質(zhì)粒的卵巢癌A2780細(xì)胞。方法根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的NDY1基因核苷酸序列，設(shè)計(jì)并合成靶向干擾NDY1基因的小發(fā)夾RNA(shRNA)序列，插入表達(dá)載體獲得重組質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-shNDY1。重組質(zhì)粒測序鑒定正確后，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染A2780細(xì)胞，經(jīng)G418篩選及有限稀釋法獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-qPCR)和蛋白免疫印跡法分別檢測A2780穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞NDY1 mRNA及蛋白表達(dá)。結(jié)果重組質(zhì)粒測序正確，轉(zhuǎn)染shNDY1后，A2780細(xì)胞mRNA及蛋白表達(dá)水平分別下降(72.89±4.83)%及(55.85±4.84)%，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論成功構(gòu)建pGPU6/GFP/Neo-shNDY1真核表達(dá)質(zhì)粒，并獲得shNDY1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的卵巢癌A2780細(xì)胞，為細(xì)胞水平研究NDY1與卵巢癌的關(guān)系奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]卵巢腫瘤；NDY1；質(zhì)粒構(gòu)建；A2780細(xì)胞

組蛋白去甲基化酶NDY1(not dead yet-1,NDY1)是一種重要的表觀調(diào)控因子。它屬于包含JmjC 結(jié)構(gòu)域的組蛋白去甲基化酶(JmjC domain-containing histone demethylase，JHDM)家族成員,能夠特異性催化H3K36me2和H3K4me3脫甲基[1]，并在細(xì)胞增殖，細(xì)胞周期，干細(xì)胞自我更新及腫瘤轉(zhuǎn)化等過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)功能[1-3]。NDY1異常表達(dá)可促使細(xì)胞增殖失控，導(dǎo)致腫瘤表型表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌、乳腺癌、急性白血病等惡性腫瘤中NDY1高表達(dá)，并與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、臨床預(yù)后密切相關(guān)[4-6]。對鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)的研究表明，NDY1通過逆轉(zhuǎn)microRNA let-7b對癌基因EZH2 mRNA的轉(zhuǎn)錄后抑制，誘導(dǎo)MEFs永生化。目前已有研究提示NDY1具有促癌功能，而NDY1與卵巢癌的關(guān)系則未見報(bào)道。為探明二者的關(guān)系，本研究構(gòu)建表達(dá)NDY1 shRNA的真核表達(dá)質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-shNDY1，轉(zhuǎn)染卵巢癌A2780細(xì)胞后獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，從而為進(jìn)一步研究NDY1和卵巢癌的關(guān)系奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料人上皮性卵巢癌細(xì)胞A2780獲贈(zèng)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院婦瘤實(shí)驗(yàn)室。質(zhì)粒載體pGPU6/GFP/Neo購自上海吉瑪公司，質(zhì)粒中量抽提試劑盒購自杭州愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司，DNA內(nèi)切酶(BpiⅠ、PstⅠ、BamHⅠ)、DNA連接酶及DNA mark均購自Fermentas公司，DNA凝膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司，LipofectamineTM2000、G418購自Invitrogen公司，RNA提取試劑盒購自Axygen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Takara公司，SYBR Green Real Time PCR Master Mix購自Roche公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，RPMI 1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司，細(xì)胞質(zhì)蛋白及核蛋白抽提試劑盒購自碧云天公司，兔抗人NDY1多克隆抗體購自Millipore公司，兔抗人LaminB1抗體購自Abcam公司，辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體購自CST公司，引物由Takara公司合成。

1.2方法

1.2.1NDY1 shRNA序列的設(shè)計(jì)及合成根據(jù)GenBank提供的NDY1基因序列(序列號(hào)：NM_032590.4)，由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)并合成針對NDY1 的特異性RNAi序列，NDY1-S:5′-CAC CGG GCA AAG ATT TCA ACT ATG ATT CAA GAG ATC ATA GTT GAA ATC TTT GCC CTT TTT TG-3′;NDY1-AS:5′-GAT CCA AAA AAG GGC AAA GAT TTC AAC TAT GAT CTC TTG AAT CAT AGT TGA AAT CTT TGC CC-3′；相應(yīng)陰性對照(nagtive control,NC)序列如下，NC-S:5′-CAC CGT TCT CCG AAC GTG TCA CGT CAA GAG ATT ACG TGA CAC GTT CGG AGA ATT TTT TG-3′,NC-AS:5′-GAT CCA AAA AAT TCT CCG AAC GTG TCA CGT AAT CTC TTG ACG TGA CAG TTC GGA GAA C-3′。

1.2.2pGPU6/GFP/Neo-NDY1質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定在PCR儀上進(jìn)行NDY1 shRNA單鏈退火反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min;85 ℃ 5 min;75 ℃ 5 min;70 ℃ 5 min。退火處理后得到NDY1 shRNA 模板用于連接反應(yīng)。將pGPU6/GFP/Neo載體用BpiI、BamHI 37 ℃酶切1 h，瓊脂糖電泳估算濃度并回收。在連接反應(yīng)體系中加入線性化的載體及NDY1 shRNA 模板，T4連接酶22 ℃反應(yīng)1 h，用于構(gòu)建pGPU6/GFP/Neo-NDY1真核表達(dá)質(zhì)粒。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)Top10細(xì)菌，取 200 μL轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布于含 50 μg/mL卡那霉素的LB 平板上，37 ℃培養(yǎng)16 h，從每塊平板上挑取5個(gè)菌落，接種到含 50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床振搖16 h；使用堿裂解法抽提質(zhì)粒，所得質(zhì)粒用BamHⅠ,PstⅠ分別酶切鑒定，挑選兩個(gè)酶切結(jié)果正確的質(zhì)粒送至上海英駿公司測序。

1.2.3卵巢癌A2780細(xì)胞株的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染選擇處于對數(shù)生長期的A2780細(xì)胞，以每孔1.5×105個(gè)細(xì)胞接種于24孔板中，每孔添加含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基500 μL，并置于37 ℃ 含5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%，按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書將pGPU6/GFP/Neo-shNDY1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A2780細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)染pGPU6/GFP/Neo-shNC作為陰性對照，以未轉(zhuǎn)染A2780作為空白對照。轉(zhuǎn)染24 h后，細(xì)胞以1∶10比例傳代并接種于另一塊24孔板，次日加入終濃度為300 μg/mL的G418進(jìn)行篩選。2周后用有限稀釋法挑取單個(gè)陽性克隆細(xì)胞接種于96孔板，待其長滿后逐漸傳入24孔板，6孔板、最后移入培養(yǎng)瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.4RT-qPCR檢測NDY1 mRNA的相對表達(dá)采用Axygen公司RNA提取試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA，按照Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成相應(yīng)cDNA，用于定量PCR的NDY1引物序列如下，上游引物：5′-CTC ACT GCT GTT GGC ACC AC-3′，下游引物：5′-TGC TTG CAG TAC CTC AGG TCA ATA-3′；以β-actin作為內(nèi)參，上游引物序列：5′-CAG GCA CCA GGG CGT GAT-3′，下游引物序列：5′-TAG CAA CGT ACA TGG CTG GG-3′，擴(kuò)增反應(yīng)在ABI 7300熒光定量PCR儀上完成。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后用2-△△Ct法計(jì)算各組細(xì)胞NDY1/β-actin比值，本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5Western blot 檢測NDY1蛋白表達(dá)試劑盒法提取細(xì)胞核蛋白，BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品煮沸變性5 min，取20 μg核蛋白置于含10%分離膠的SDS-PAGE中電泳；隨后200 mA，2 h轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%BSA封閉液封閉2 h；加入兔抗人NDY1一抗(1∶500)及兔抗人LaminB1(1∶10 000)一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔熒光二抗(1∶8 000)避光孵育1 h，TBST洗膜3次，采用Odyssey紅外熒光掃描系統(tǒng)識(shí)別并拍照；本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，多組間的均值比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SLD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1pGPU6/GFP/Neo-shNDY1真核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定如圖1所示，分別用DNA內(nèi)切酶PstⅠ、BamHⅠ酶切鑒定重組質(zhì)粒，經(jīng)PstⅠ處理后質(zhì)粒不能被切開；經(jīng)BamHⅠ酶切后，在5 175 bp處出現(xiàn)條帶；結(jié)果表明：合成目的片段正確插入pGPU6/GFP/Neo載體預(yù)期位點(diǎn)。經(jīng)上海英駿公司測序結(jié)果證實(shí)質(zhì)粒測序結(jié)果正確，pGPU6/GFP/Neo-sh NDY1真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖2)。

M：Lamda/Eco130I DNA Marker；1(a)、2(a)：pGPU6/GFP/Neo-sh NDY1質(zhì)粒1，2的PstⅠ酶切鑒定結(jié)果；1(b)、2(b)：pGPU6/GFP/Neo-sh NDY1質(zhì)粒1，2的BamHⅠ 酶切鑒定結(jié)果。

圖1pGPU6/GFP/Neo-shNDY1酶切鑒定結(jié)果

圖2　pGPU6/GFP/Neo-shNDY1質(zhì)粒測序圖譜

2.2shNDY1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的A2780細(xì)胞株篩選重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h后，熒光顯微鏡下可見表達(dá)綠色熒光蛋白的A2780細(xì)胞；經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)以及G418篩選2周后，顯微鏡下可見陽性克隆細(xì)胞團(tuán)形成，轉(zhuǎn)染效率達(dá)90%(圖3)。

A：shNDY1-A2780細(xì)胞熒光源成像；B：shNDY1-A2780細(xì)胞普通光源成像；C：shNC-A2780細(xì)胞熒光源成像；D：shNC-A2780細(xì)胞普通光源成像。

圖3pGPU6/GFP/Neo-shNDY1在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的A2780細(xì)胞中的表達(dá)(×100)

2.3A2780細(xì)胞NDY1 mRNA的相對表達(dá)RT-qPCR結(jié)果顯示，以未轉(zhuǎn)染的A2780細(xì)胞NDY1 mRNA表達(dá)水平為100%，shNDY1-A2780細(xì)胞mRNA表達(dá)水平較未轉(zhuǎn)染組下降(72.89±4.83)%(P=0.001)，較shNC組亦有明顯下調(diào)(P=0.001)；而與未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞相比，shNC組NDY1 mRNA相對表達(dá)量下降約(5.34±8.79)%，二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明所構(gòu)建的質(zhì)粒能明顯抑制A2780細(xì)胞NDY1 mRNA表達(dá)(圖4)。

圖4　RT-qPCR檢測各組細(xì)胞NDY1 mRNA表達(dá)情況

2.4A2780細(xì)胞NDY1蛋白表達(dá)變化以未轉(zhuǎn)染A2780細(xì)胞的NDY1蛋白表達(dá)水平為100%，shNDY1-A2780細(xì)胞的NDY1蛋白表達(dá)下調(diào)(55.85±4.84)%(P=0.027)，與shNC-A2780組相比亦有明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而shNC-A2780組蛋白表達(dá)水平為(111.20±2.84)%,與未轉(zhuǎn)染組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.581)。表明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，能有效降低NDY1蛋白表達(dá)(圖5)。

圖5　Western blot檢測各組細(xì)胞NDY1蛋白表達(dá)情況

3討論

表觀遺傳學(xué)是近年腫瘤研究領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，其包括DNA甲基化、染色質(zhì)重塑、組蛋白修飾、非編碼RNA在內(nèi)的多種調(diào)控形式。研究表明，表觀遺傳機(jī)制參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、干細(xì)胞更新以及腫瘤耐藥等多種生理病理過程[7-10]。Rebbani等[11]發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞癌組織中抑癌基因位點(diǎn)DNA甲基化異常增加；對卵巢癌的研究證實(shí)，miR-130a、miR-374a在卵巢癌耐藥細(xì)胞中高表達(dá)，并通過調(diào)節(jié)MDR1 進(jìn)而影響細(xì)胞耐藥性[12]。

NDY1是一種重要的表觀調(diào)控因子，其編碼產(chǎn)物包含具有去甲基化酶活性的JmjC結(jié)構(gòu)域，通過催化組蛋白H3K36me2和H3K4me3去甲基化進(jìn)而影響靶基因轉(zhuǎn)錄過程[1,3-4]?，F(xiàn)已證實(shí)，NDY1在胰腺癌、乳腺癌、急性髓細(xì)胞白血病中呈現(xiàn)高表達(dá)，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，因此被認(rèn)為是一種促癌基因[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)，NDY1通過下調(diào)p15Ink4b加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)鼠胚胎成纖維(MEF)細(xì)胞增殖[13]。骨髓細(xì)胞NDY1上調(diào)能誘導(dǎo)Nsg2表達(dá)，干擾幼稚造血細(xì)胞的發(fā)育成熟，促進(jìn)髓系及B淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)生[14-15]。在胰腺癌中，過表達(dá)的NDY1與KrasG12D協(xié)同促進(jìn)腫瘤的進(jìn)程，且NDY1的表達(dá)水平與腫瘤分級(jí)、分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；而沉默NDY1表達(dá)則能逆轉(zhuǎn)胰腺癌細(xì)胞的致瘤性[4]，提示NDY1可能成為惡性腫瘤治療的新靶點(diǎn)。

盡管已有研究表明NDY1的異常表達(dá)可以影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但NDY1和卵巢癌的關(guān)系卻尚未見報(bào)道。為了探索NDY1對卵巢癌發(fā)病的影響，尋找臨床治療卵巢癌的新靶點(diǎn)，本研究構(gòu)建表達(dá)shNDY1的真核表達(dá)載體pGPU6/GFP/Neo-shNDY1，經(jīng)酶切鑒定及DNA測序檢測證實(shí)目的質(zhì)粒構(gòu)建成功。脂質(zhì)體法將目的質(zhì)粒導(dǎo)入卵巢癌細(xì)胞A2780，經(jīng) G418加壓篩選成功獲得穩(wěn)定表達(dá)shNDY1的陽性單克??；RT-qPCR檢測轉(zhuǎn)染后NDY1 mRNA的抑制率達(dá)(72.89±4.83)%，其相應(yīng)蛋白表達(dá)亦明顯下調(diào)。

綜上所述，本研究構(gòu)建的真核表達(dá)載體能夠成功抑制卵巢癌細(xì)胞內(nèi)源性NDY1基因表達(dá)，并在細(xì)胞水平為研究NDY1與卵巢癌的關(guān)系以及探索以NDY1為治療靶點(diǎn)的卵巢癌臨床治療新方法奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Construction of NDY1 shRNA eukaryotic expression plasmid and its stable expression in ovarian cancer cell line A2780*

Lu Fangfang,Kuang Yan△,Xu Chaohuan,Wang Qi,Li Meiyi

(Department of Obstetrics and Gynecology,First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning，Guangxi 530021,China)

[Abstract]ObjectiveTo construct NDY1 shRNA eukaryotic expression plasmid and to obtain shNDY1-stably expressed ovarian cancer cell line A2780 cell.MethodsBased on the NDY1 gene nucleotide sequence provided by GenBank database,a short hairpin RNA (shRNA) targeted NDY1 gene was designed and synthesised,and the expression vector was inserted for obtaining recombination plasmid pGPU6/GFP/Neo-shNDY1.After identification by sequencing,then liposome mediated transfection to A2780 cell was conducted,stable transfected cells were obtained through G418 selection and limited dilution.NDY1 mRNA and protein expression level were detected by the real time quantitive RT-qPCR and Western blot,respectively.ResultsThe sequencing of recombinant plasmid was correct.After shNDY1transfection,mRNA and protein expression level of A2780 cells were decreased by(72.89±4.83)% and (55.85±4.84)%,the difference in the comparison with the control group was statistically significant.ConclusionEukaryotic expression plasmid pGPU6/GFP/Neo-shNDY1 is successfully constructed,and the stably transfected A2780 cell line is obtained,which lays the foundation for studying the relation of NDY1 ovarian cancer in cellular level.

[Key words]ovarian neoplasms;NDY1;plasmid construction;A2780 cell

doi:論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.08.002

* 基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81360389)；廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2012GXNSFAA053086)；廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳自籌經(jīng)費(fèi)科研課題資助項(xiàng)目(Z2013026)；2013年廣西研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃資助項(xiàng)目(YCSZ2014101)。

作者簡介：盧芳芳(1990-)，在讀碩士，主要從事婦科腫瘤方面的研究?！魍ㄓ嵶髡?E-mail:kuangyan2004@sina.com。

[中圖分類號(hào)]R737.31

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)08-1012-04

(收稿日期：2015-10-19修回日期：2015-12-10)