劉　帥，曹　征，張曉飐，岳保紅

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，鄭州 450052)

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流式細(xì)胞術(shù)分析骨髓增生異常綜合征小巨核細(xì)胞的初步研究*

劉帥，曹征，張曉飐，岳保紅△

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，鄭州 450052)

[摘要]目的建立基于巨核細(xì)胞糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(CD41a)和碘化丙啶(PI)雙標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析骨髓小巨核細(xì)胞的方法，并研究其在骨髓增生異常綜合征(MDS)診斷中的意義。方法采用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的單克隆抗體標(biāo)記CD41a，PI標(biāo)記巨核細(xì)胞DNA，用FCM分析巨核細(xì)胞倍體分布。結(jié)果42例MDS患者，F(xiàn)CM檢測小巨核細(xì)胞陽性率為90.5%，瑞氏-姬姆薩染色和免疫組織化學(xué)方法檢測陽性率分別為54.8%和64.3%，三者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.640，P=0.001)；FCM檢測MDS低危組和高危組小巨核細(xì)胞陽性率分別為81.8%和100%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.019，P=0.045)。結(jié)論FCM檢測MDS小巨核細(xì)胞檢出率高，且高?；颊咝【藓思?xì)胞檢出率更高，有助于MDS的早期診斷和預(yù)后評估。

[關(guān)鍵詞]流式細(xì)胞術(shù)；骨髓增生異常綜合征；巨核細(xì)胞；DNA倍體；CD41a

巨核細(xì)胞(megakaryocyte)是人體骨髓中唯一的多倍體細(xì)胞[1]，擔(dān)負(fù)著生成血小板和參與止血、凝血的重要功能，其分化發(fā)育及倍體分布的情況與血小板生成的質(zhì)與量緊密相關(guān)[2-3]。正常巨核細(xì)胞的體積較其他細(xì)胞系更大，通過骨髓涂片很容易識別，然而骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome,MDS)患者的骨髓中通常會出現(xiàn)一種大小與淋巴細(xì)胞相似的小巨核細(xì)胞(micromegakaryocyte)，該類細(xì)胞不能增殖成熟形成多倍體化，亦不能完成正常巨核細(xì)胞的功能[4]。僅通過細(xì)胞形態(tài)很難準(zhǔn)確識別這種小巨核細(xì)胞，且受個(gè)人主觀因素影響，很難獲得真實(shí)的骨髓巨核細(xì)胞增生情況和與增殖相關(guān)的DNA倍體數(shù)，因此單純的形態(tài)學(xué)檢查會影響MDS的診斷，建立一種客觀、準(zhǔn)確、特異的方法來識別和鑒定小巨核細(xì)胞對MDS的診斷具有重要價(jià)值。本研究利用單克隆抗體與抗原特異性結(jié)合的特性，以及碘化丙啶(PI)檢測DNA倍體的特性，可以準(zhǔn)確地識別巨核細(xì)胞并獲得巨核細(xì)胞的倍體數(shù)，進(jìn)而為臨床提供更為可靠、準(zhǔn)確的小巨核細(xì)胞數(shù)量、倍體和性質(zhì)的數(shù)據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料收集42例MDS初診患者，其中男25例，女17例，年齡19～83歲，中位年齡56歲。所有病例均符合MDS臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。按照WHO標(biāo)準(zhǔn)將其分為低危組(包括MDS-RA，RCMD和5q-)22例和高危組(包括MDS-RAEB-1和RAEB-2)20例。所有患者均選取髂后上棘作為骨髓穿刺部位，取約5 μL骨髓液推片，另取1～2 mL骨髓液用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝。

1.2方法

1.2.1主要儀器和試劑FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；LD5-2A型低速離心機(jī)(北京雷郣爾公司)；異硫氰酸熒光素標(biāo)記的巨核細(xì)胞糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(CD41a)單克隆抗體(3199548，CD41a-FITC，美國BD公司)；PI(美國Sigma公司)；標(biāo)準(zhǔn)微球(340486，CaliBRITE 3，美國BD公司)；Percoll 細(xì)胞分離液(美國GE公司)；細(xì)胞透膜液(PERM，美國BD公司)；RNA酶(RNase，美國Sigma公司)；巨核細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色試劑盒(10342，北京賽馳生物科技有限公司)；Olympus顯微鏡等。

1.2.2試驗(yàn)方法

1.2.2.1瑞氏-姬姆薩染色用瑞氏-姬姆薩染液對骨髓涂片進(jìn)行染色，在光學(xué)顯微鏡下識別有無小巨核細(xì)胞。

1.2.2.2免疫組織化學(xué)染色按照免疫組織化學(xué)染色試劑盒說明書對骨髓涂片進(jìn)行染色，在光學(xué)顯微鏡下識別有無小巨核細(xì)胞。

1.2.2.3巨核細(xì)胞分離富集用等滲的Percoll細(xì)胞分離液和磷酸鹽緩沖液(PBS)將骨髓中有核細(xì)胞數(shù)量調(diào)整至20×106個(gè)，并將其Percoll密度調(diào)至1.020 g/mL。將配好的1.020 g/mL骨髓液緩緩加在2 mL密度為1.056 g/mL Percoll分離液上方，然后再加入2 mL PBS。400 g離心20 min，吸取Percoll分離液上面的灰白色細(xì)胞層，加入1.5倍體積的PBS，300 g離心10 min，棄上清液。留取細(xì)胞沉淀待用。

1.2.2.4巨核細(xì)胞的免疫熒光染色將富集好的巨核細(xì)胞懸液用PBS調(diào)成(2～3)×106個(gè)/mL。加入透膜液500 μL，混勻，室溫放置10 min。加入2 mL PBS，400 g離心5 min，棄上清液。加入CD41a-FITC 10 μL，混勻，避光，室溫下放置20 min。加2 mL PBS，100 g離心7 min，棄上清液。加入RNase100 μL，放入37 ℃水浴箱孵育30 min。將細(xì)胞懸液調(diào)整至500 μL左右，加入5 mg/mL PI染色。用200目尼龍網(wǎng)過濾后上流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.2.5流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)微球校準(zhǔn)流式細(xì)胞儀光路、電壓及補(bǔ)償。采用雙激發(fā)光，波長分別為488 nm和633 nm，進(jìn)行4色熒光分析。共獲取500 000～1 000 000個(gè)細(xì)胞。以CD41a/SSC設(shè)門，圈定巨核細(xì)胞(R1)；在CD41a/PI雙坐標(biāo)圖中，分析各個(gè)巨核細(xì)胞DNA倍體分布情況。選擇未表達(dá)CD41a骨髓細(xì)胞(R2)的DNA倍體2N峰作為參考標(biāo)準(zhǔn)，見圖1。

A:采用CD41a/ SSC設(shè)門，富集后骨髓巨核細(xì)胞的獲取散點(diǎn)圖；B:采用CD41a/ SSC設(shè)門，富集后骨髓巨核細(xì)胞的分析圖，其中R1門內(nèi)為巨核細(xì)胞，R2門內(nèi)為陰性對照細(xì)胞；C:采用CD41a/PI 雙坐標(biāo)圖中，富集后骨髓巨核細(xì)胞的CD41a表達(dá)及在各倍體百分率分析圖。圖中R3、R4、R5、R6、R7分別表示巨核細(xì)胞的2、4、8、16、32 N；D:巨核細(xì)胞各倍體分布直方圖，M1、M2、M3、M4、M5分別表示巨核細(xì)胞的2、4、8、16、32 N；E:陰性對照細(xì)胞DNA 2N峰。

圖1FCM分析巨核細(xì)胞DNA倍體

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，組間采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1FCM、瑞氏-姬姆薩染色及免疫組織化學(xué)方法檢測小巨核細(xì)胞陽性率的比較42例MDS患者，3種檢測方法檢測小巨核細(xì)胞的陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.640，P=0.001)，F(xiàn)CM檢測陽性率高于其他兩種方法，見表1。

表1　3種方法檢測42例MDS患者骨髓小巨核細(xì)胞

2.2高危組和低危組小巨核細(xì)胞陽性率比較FCM檢測小巨核細(xì)胞，高危組陽性率高于低危組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.019，P=0.045)，見表2。

表2　FCM方法檢測高危組和低危組MDS病例小巨核

3討論

病態(tài)巨核細(xì)胞尤其是淋巴樣小巨核細(xì)胞是MDS鑒別于其他血液疾病的一項(xiàng)重要參考依據(jù)，其數(shù)量多少可以反映巨核細(xì)胞系病態(tài)造血的嚴(yán)重程度[6-9]。亦有研究表明，小巨核細(xì)胞對于MDS診斷特異性為100%[10]。

瑞氏-姬姆薩化學(xué)染色方法、免疫組織化學(xué)染色方法、FCM分別是3種不同水平的細(xì)胞檢測方法。瑞氏-姬姆薩染色方法經(jīng)典且實(shí)用，但存在病態(tài)造血時(shí)細(xì)胞形態(tài)常發(fā)生異常改變，加上主觀因素及制片等因素影響，必然遺漏許多病態(tài)小巨核細(xì)胞，目前多采用巨核細(xì)胞酶標(biāo)染色(APAAP)法檢測巨核細(xì)胞，結(jié)果明顯優(yōu)于瑞氏-姬姆薩染色方法[10-11]，但也受到實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)、觀察細(xì)胞數(shù)量有限等因素的影響，仍有局限性。而FCM則以計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量多、易標(biāo)記細(xì)胞、快速分析為其特點(diǎn)，尤其在分析低比例含量的細(xì)胞方面，更能客觀反映該細(xì)胞在骨髓中的真實(shí)情況。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)CM檢測小巨核細(xì)胞陽性率明顯高于其他兩種方法檢測的陽性率，結(jié)果精確、可靠，充分體現(xiàn)了FCM檢測巨核細(xì)胞的優(yōu)勢。

MDS患者通常巨核細(xì)胞總數(shù)不減少，但血小板數(shù)量卻明顯減少，說明巨核細(xì)胞DNA倍體數(shù)與血小板的產(chǎn)生直接相關(guān)。本研究建立了FCM檢測小巨核細(xì)胞的方法，利用CD41a特異性單克隆抗體和特定激發(fā)光下發(fā)射熒光且可以插入到DNA雙聯(lián)的PI染液，以CD41a/SSC設(shè)門細(xì)胞，既可區(qū)分出巨核細(xì)胞，又能確定巨核細(xì)胞DNA倍體數(shù)。因巨核細(xì)胞內(nèi)DNA呈指數(shù)增加，PI染色后DNA熒光強(qiáng)度理論上應(yīng)是連續(xù)成倍增加，本研究結(jié)果中巨核細(xì)胞DNA分布直方圖上可以看到各個(gè)DNA倍體組PI染色的平均熒光強(qiáng)度也正是連續(xù)成倍增加，說明這些峰群反映的正是巨核細(xì)胞DNA的倍性分布，而不是細(xì)胞隨機(jī)凝集原因所致。另外，在這些峰群間未見到由于細(xì)胞隨機(jī)凝集所致的其他倍體峰群(6、10、12 N等)。因此，通過FCM檢測巨核細(xì)胞DNA倍體分布從而準(zhǔn)確識別出MDS患者骨髓中的低倍體巨核細(xì)胞這一方法是可行的，對MDS的診斷有極大的幫助。

王小衛(wèi)等[12]對MDS病態(tài)巨核細(xì)胞所作的FISH研究發(fā)現(xiàn)，二倍體占據(jù)絕對優(yōu)勢，此類二倍體巨核細(xì)胞既代表了形態(tài)上的不成熟，也隱含了功能上的缺陷。該研究結(jié)果和本課題用FCM分析巨核細(xì)胞的倍體分布相一致。張海燕等[13]通過FCM對特發(fā)性血小板減少性紫癜患者巨核細(xì)胞DNA倍體和糖蛋白表達(dá)水平的變化進(jìn)行了研究，同樣顯示出可行性和優(yōu)勢性。

單因素分析顯示有淋巴樣小巨核細(xì)胞為MDS不良預(yù)后因素[14]。劉娟等[15]對38例初診的MDS患者、8例再生障礙性貧血患者及17例健康對照的骨髓進(jìn)行免疫表型檢測，結(jié)果顯示CD41陽性的淋巴樣小巨核細(xì)胞在MDS組中較特異出現(xiàn)，且以RCMD組出現(xiàn)率最高。邱燕等[16]研究表明，健康組和良性血液病組未見淋巴樣小巨核細(xì)胞，而MDS及其他惡性血液病均可見病態(tài)巨核細(xì)胞，淋巴樣小巨核細(xì)胞在MDS中最為明顯，提示淋巴樣小巨核細(xì)胞的存在意味著骨髓惡性增生程度呈遞增趨勢。

本試驗(yàn)對42例MDS患者進(jìn)行了分組，高危組2N巨核細(xì)胞檢出率明顯高于低危組，提示隨病情進(jìn)展，小巨核細(xì)胞檢出率隨之增高，該結(jié)果與上述觀點(diǎn)一致。多篇關(guān)于FCM識別骨髓病態(tài)造血的試驗(yàn)數(shù)據(jù)亦顯示，準(zhǔn)確的巨核細(xì)胞倍體數(shù)對于MDS的診斷和預(yù)后評估有極其重要的作用[17-18]。

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Study on micromegakaryocytes of patients with myelodysplastic syndrome by flow cytometry*

LiuShuai,CaoZheng,ZhangXiaozhan,YueBaohong△

(DepartmentofCytologyLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou,Henan450052,China)

[Abstract]ObjectiveTo setup a measurement of human bone marrow micromegakaryocyte which based on CD41a and PI double-labeled flow cytometric analysis，and study the significance in the diagnosis of MDS.MethodsIn 42 cases of MDS patients,their bone marrow megakaryocytes were obtained by Percoll density gradient separation medium.The megakaryocyte glycoprotein Ⅱb/Ⅲa(CD41a)were marked with fluorescein isothiocyanate through its corresponding monoclonal antibody,and their DNA were marked with PI.Then the megakaryocyte ploidy was analyzed by flow cytometry(FCM).ResultsThe method for micromegakaryocyte identification and analysis was established.In 42 patients with MDS,the detection rate of micromegakaryocyte was 90.5 percent by FCM analysis,but only 54.8 percent by Wright-Giemsa staining test and 64.3 percent by immunohistochemistry,the difference among them was statistically significant(χ2=13.640，P=0.001).The 42 patients with MDS were divided into two groups(low-risk group and high-risk group).The detection rates of micromegakaryocyte were 81.8 percent in low-risk group and 100 percent in high-risk group separately by FCM analysis,the difference was statistically significant(χ2=4.019，P=0.045).ConclusionThe detection rate of micromegakaryocyte by FCM with CD41a and PI double marker is higher than that by cytochemical staining.The detection rate of micromegakaryocyte in the high-risk group is higher than that of the low-risk group,which shows that the detection of micromegakaryocyte is of great significance for MDS prognosis assessment.

[Key words]flow cytometry;myelodyplastic sydrome;megakaryocyte;DNA ploidy;CD41a

doi:論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.03.020

*基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81271911)；河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)項(xiàng)目(201002006)。

作者簡介：劉帥(1980-)，主管技師，碩士，主要從事白血病發(fā)病機(jī)制及實(shí)驗(yàn)診斷研究?！魍ㄓ嵶髡?，E-mail：ybh2002@163.com。

[中圖分類號]R551.3

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)03-0351-03

(收稿日期：2015-08-08修回日期：2015-10-16)