饒冬東　張福輝　薛曉光等

[摘要] 目的 探討流式細(xì)胞術(shù)所獲得血小板微顆粒計(jì)數(shù)與其功能間的關(guān)系。 方法 選取本院2012年9月～2014年9月的100例健康孕產(chǎn)婦及患有合并癥孕產(chǎn)婦患者的血液樣本作為研究對(duì)象，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)計(jì)數(shù)分析及三種功能分析，探討其相關(guān)性。 結(jié)果 流式細(xì)胞術(shù)獲得的乳黏素蛋白促凝血的微粒體計(jì)數(shù)與Zymuphen MP活性呈弱相關(guān)（r=0.5370，P<0.01）；與內(nèi)在凝血酶潛力ETP呈正相關(guān)（r=0.7444，P<0.01）；與STA磷脂（PPL）促凝分析呈負(fù)相關(guān)（r=-0.7872，P<0.01）。膜聯(lián)蛋白V+及促凝血的血小板源性微顆粒的含量水平與功能分析一致。 結(jié)論 血小板微顆粒的促凝功能與流式細(xì)胞術(shù)絕對(duì)計(jì)數(shù)值密切相關(guān)，多參數(shù)的使用將會(huì)提供更多的生物學(xué)信息。

[關(guān)鍵詞] 流式細(xì)胞術(shù)；血小板；源性微顆粒

[中圖分類號(hào)] R331.1+43 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2015）05（c）-0114-03

[Abstract] Objective To explore the relationship between the number of platelet-derived microvesicle sorted by flow cytometry cell sorting and their function. Methods 100 copies of blood samplesobtained from healthy maternal women or maternal women with complications from September 2012 to September 2014 in our hospital were selected as the research object.The number of platelet microvesicles were calculated by flow cytometry cell sorting，and their functions were recorded by three function analysis.Their relationship was explored. Results The number of platelet microvesicles was slightly correlated with Zymuphen MP activity （r=0.5370，P<0.01） and positively correlated with ETP （r=0.7444，P<0.01），while negatively correlated with STA PPL （r=-0.7872，P<0.01）.Membrane associated protein V+ was related to the number of coagulation of platelet microvesicles，which was helpful for function analysis. Conclusion The coagulation of platelet microvesicles is closely related to their number counted by flow cytometry cell sorting and the application of multiple parameters will provide valuable biological information.

[Key words] Flow cytometry cell sorting；Platelet；Derived microvesicles

近年來胞外膜泡逐漸受到細(xì)胞生物學(xué)及臨床研究關(guān)注，隨著對(duì)其形態(tài)大小、表型及微粒體（MVs）計(jì)數(shù)研究的進(jìn)展，其對(duì)機(jī)體生理及病理的生物學(xué)作用逐漸被了解。流式細(xì)胞術(shù)是最常采用的微粒體分析技術(shù)，其檢測(cè)的最低范圍為0.2～0.5 μm。納米粒子跟蹤分析（NTA）及原子粒顯微鏡（AFM）技術(shù)已證實(shí)絕大多數(shù)胞外膜泡直徑<0.3 μm，提示流式細(xì)胞術(shù)所能檢測(cè)到的微粒體可能只是“冰山一角”[1]。新一代的流式細(xì)胞術(shù)通過改善聚光角度提高了微粒體的分辨率，最小可達(dá)0.1 μm，在分散時(shí)改變了聚光，增加了檢測(cè)微小粒子的敏感度[2-3]。高敏感度的流式細(xì)胞術(shù)擁有較高的FSc分辨率、較低的背景噪聲，能夠檢測(cè)的微粒體數(shù)目是常規(guī)流式細(xì)胞術(shù)的8～20倍。研究顯示，不同臨床表現(xiàn)的患者其微粒體大小比例不同，提示微粒體的大小可能包含更多的生物學(xué)信息[4]。本研究旨在比較3種現(xiàn)存的檢測(cè)血小板微顆粒促凝功能的方法，結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)獲得的血小板微顆粒絕對(duì)計(jì)數(shù)，分析血小板微顆粒的絕對(duì)計(jì)數(shù)與微粒體的功能間是否存在一定的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年9月～2014年9月入住本院的100例孕產(chǎn)婦樣本作為研究對(duì)象，其中53例無特殊既往病史及服藥史，BMI指數(shù)在正常范圍內(nèi)，平均BMI指數(shù)為22.5。其余47例中，28例（59.6%）患有妊娠期高血壓，11例（23.4%）存在高脂血癥，8例（17.0%）患有2型糖尿病，平均BMI指數(shù)為33.4。提取2.7 ml血液至含有0.3 ml3.2%枸櫞酸鈉緩沖液的真空采血管中，廢棄第一只采血管以避免內(nèi)皮來源的微粒體干擾。取血15 min內(nèi)，1550×g、20℃、離心20 min，獲得去血小板血漿（PPP），提取離心管上層PPP，迅速于-80℃冰凍，儲(chǔ)存12個(gè)月。

1.2 流式細(xì)胞術(shù)分析血小板微顆粒絕對(duì)計(jì)數(shù)

250 μl PPP室溫下解凍，樣本于18000×g、30 min離心2次，微粒體重新懸浮于100 μl 0.32%枸櫞酸PBS中，膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素及FITC乳黏蛋白用于微粒體凝集前染色。0.10 μg/ml的CD31-藻紅蛋白及0.013 μg/ml的CD41-藻紅蛋白-Cy5用于區(qū)分血小板源性的微粒體（PMVs，CD31+CD41+）及內(nèi)皮源性的微粒體（EMVs，CD31+CD41-）；4.17 μg/ml 的CD144-PE、0.42 μg/ml的CD62E-PE-Cy5及 0.21 μg/ml CD106-PE-Cy5 用于標(biāo)記EMVs；0.069 μg/ml的血型糖蛋白A（CD235a）-PE用于染色紅細(xì)胞來源的微粒體；CD45-別藻藍(lán)蛋白0.21 μg/ml作為白細(xì)胞來源的微粒體的標(biāo)志物；0.10 μg/ml的CD66B-FITC用來標(biāo)記粒細(xì)胞源性微粒體；0.42 μg/ml CD-14PE用來標(biāo)記單核細(xì)胞源性微粒體。樣本在室溫下與合適的單克隆抗體培育30 min，避光，同時(shí)添加900 μl PBS構(gòu)櫞酸用于控制膜聯(lián)蛋白。

1.3 微粒的功能分析

1.3.1 Zymuphen MP ELISA 該Zymuphen ELISA是對(duì)PPP中微粒體凝聚活性的功能性分析，磷脂酰絲氨酸（PS）及微粒體連結(jié)于微孔板上并暴露其磷脂面，促使促凝血球蛋白復(fù)合體將凝血素分成凝血酶，微粒體的磷脂凝集與凝血酶的產(chǎn)生直接相關(guān)。PPP樣本及控制盒經(jīng)鈣、Ⅹa因子（FⅩa）及凝血酶稀釋至1∶20，稀釋的對(duì)照及樣本添加至ELISA板中37℃培育1 h。洗板5次，添加100 μl FⅩa-FⅤa及50 ul凝血素，37℃培育10 min；后添加50 μl凝血酶基底物37℃培育3 min；最后添加50 μl終止液，405 nm下讀板。

1.3.2 STA磷脂（PPL）促凝分析 通過凝集時(shí)間評(píng)估微粒體促凝活性。凝結(jié)時(shí)間取決于樣本的促凝磷脂，凝結(jié)時(shí)間縮短提示促凝磷脂的增加。PPP樣本置于STA自動(dòng)分析儀上分析，利用STA促凝磷脂試劑盒檢測(cè)。為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，采用2個(gè)控制盒，樣本中促凝磷脂的添加及檢測(cè)均自動(dòng)進(jìn)行， 凝集僅取決于血漿樣本中的凝集磷脂水平。

1.3.3 內(nèi)在凝血酶潛力ETP分析 PRP試劑包含1 pmol/L組織因子（TF）及少量磷脂，被最初添加誘發(fā)凝血酶產(chǎn)生，固定時(shí)間間隔取出樣本，凝血酶的產(chǎn)生有助于樣本中促凝微粒體的凝集。80 μl PPP添加至96孔板內(nèi)，板孔添加20 μl PRP試劑及20 μl凝血酶校準(zhǔn)液后，37℃培育置板于Fluoroskan Ascent FL儀器上分析相關(guān)熒光強(qiáng)度、滯后時(shí)間（min）、最高值時(shí)間（min）、最高值時(shí)凝血酶產(chǎn)生量（nmol/L）及凝血酶產(chǎn)生曲線下的面積（nmol/L×min）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以x±s表示，3種分析方法間行Spearman相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血小板微顆粒促凝功能3種方法分析間的相關(guān)性分析

Zymuphen ELISA檢驗(yàn)PPP結(jié)果為（5.72±1.01）%，磷脂促凝分析結(jié)果為（5.39±1.21）%，ETP分析-ETP為（4.96±1.75）%，最高值為6.71%。ETP分析中，ETP（nmol/L×min）及最高值（nmol/L）與預(yù)期的結(jié)果一致，兩者間呈正相關(guān)（r=0.9852，P<0.01）。Zymuphen MP-ELISA與STA磷脂（PPL）促凝分析結(jié)果呈負(fù)相關(guān)，Zymuphen MP-ELISA與ETP分析及其最高值呈正相關(guān)，磷脂促凝分析與ETP分析及其最高值呈負(fù)相關(guān)（表1）。

2.2 血小板微顆粒促凝功能與血小板微顆粒絕對(duì)計(jì)數(shù)間的相關(guān)性

膜聯(lián)蛋白V+微粒體、乳黏蛋白+微粒體、CD31+CD41+PMVs的平均培養(yǎng)計(jì)數(shù)分別為41.76±19.43、12.11±2.73、241.96±69.43。Zymuphen MP-ELISA結(jié)果分析顯示，膜聯(lián)蛋白V+、乳黏蛋白+及血小板源性的微粒體與流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果呈中度正性相關(guān)。STA磷脂（PPL）促凝分析結(jié)果顯示，以上三者與流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果呈負(fù)相關(guān)。ETP分析及其最高值與其呈正相關(guān)（表2）。

3 討論

本研究中，Zymuphen MP-ELISA結(jié)果分析與ETP分析及其最高值結(jié)果呈弱性正相關(guān)，與STA磷脂促凝分析結(jié)果呈中度負(fù)相關(guān)。相對(duì)于其他2種方法而言，Zymuphen MP-ELISA與流式細(xì)胞術(shù)所獲得的微粒體絕對(duì)數(shù)結(jié)果也呈中度正相關(guān)關(guān)系，這與相關(guān)研究結(jié)果基本一致，相關(guān)的因素可能為微小微粒體上的磷酸酰絲氨酸能夠被ELISA檢測(cè)到而被流式細(xì)胞術(shù)忽略[5-6]。STA磷脂促凝分析結(jié)果與ETP分析及其最高值呈負(fù)相關(guān)，并且與Zymuphen MP-ELISA結(jié)果呈中度負(fù)相關(guān)，磷脂凝集時(shí)間的縮短提示樣本中促凝磷脂水平的上升；結(jié)果同時(shí)與血小板源性的促凝微粒體呈顯著負(fù)相關(guān)，提示量化結(jié)果與微粒體的凝集潛能相關(guān)。ETP分析及其最高值與血小板微顆粒呈正相關(guān)，再次驗(yàn)證了微粒體功能與流式細(xì)胞量化分析間的相關(guān)關(guān)系，這與目前的研究結(jié)果一致。研究顯示，STA磷脂促凝分析與ETP分析相比較于微粒體的磷脂酰絲氨酸濃度能夠更好地與流式細(xì)胞術(shù)所獲得的絕對(duì)計(jì)數(shù)一致[7-8]，這可能是由于絕大多數(shù)的凝集及凝血酶產(chǎn)生取決于大微粒體，而磷脂酰絲氨酸的產(chǎn)生則主要取決于小微粒體[9-10]。

功能分析能夠較好地檢測(cè)促凝血微粒體彼此關(guān)聯(lián)性，但與其他內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞等來源的微粒體則無明顯關(guān)系[11-12]。功能分析能夠檢測(cè)到更小的微粒體，并且相對(duì)快捷和便宜，但是不能給出絕對(duì)計(jì)數(shù)并且無法提供細(xì)胞來源信息[13-14]。在本研究中，健康孕產(chǎn)婦和患有合并癥的孕產(chǎn)婦間的微粒體功能分析及流式細(xì)胞術(shù)計(jì)數(shù)分析存在差異，合并癥組BMI更高且相關(guān)的合并癥接受藥物治療。目前也有研究顯示，患有合并癥患者擁有更高水平的促凝血血小板微顆粒并且受藥物治療影響[15-17]。

本研究初步證實(shí)了流式細(xì)胞術(shù)獲得的血小板微顆粒絕對(duì)計(jì)數(shù)與其促凝功能相一致，多種分析方法的同時(shí)使用能夠更全面地體現(xiàn)血小板微顆粒在健康與疾患間的生理、病理性作用。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 易正山，馮茹，孟凡義，等.流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定血小板功能活性的初步體會(huì)[J].微循環(huán)學(xué)雜志，2003，13（3）：62-64.

[2] 叢玉隆，李綿洋，鄧新立，等.流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定血小板聚集探討[J].臨床檢驗(yàn)雜志，2003，7（5）：147-149.

[3] 包承鑫.血小板功能檢測(cè)及其臨床應(yīng)用[J].血栓與止血學(xué)，2009，12（4）：214-215.

[4] Tocchetti EV，F(xiàn)lower RL，Lloyd JV.Assessment of in vitro-generated platelet microparticles using a modified flow cytometric strategy[J].Thromb Res，2001，103（1）：47-55.

[5] 熊麗麗，魏文寧.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板微顆粒的方法學(xué)探討[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)·醫(yī)學(xué)版，2006，35（6）：834-837.

[6] 黎慶梅，韋建瑞，洪介民，等.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板活化的影響因素分析[J].中國(guó)病理生理雜志，2009，9（3）：139-141.

[7] Amabile N，Guerin AP，Tedgui A，et al.Predictive value of circulating endothelial microparticles for cardiovascular mortality in end-stage renal failure：a pilot study[J].Nephrol Dial Transplant，2012，27（5）：1873-1880.

[8] 馬文新，崔巍，侯百東，等.采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板微粒及其臨床應(yīng)用的初探[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2000，6（5）：56-59.

[9] 蘇冰.血栓性心腦血管疾病血小板微顆粒及其膜功能蛋白表達(dá)關(guān)系的研究[D].廣州：第一軍醫(yī)大學(xué)，2006.

[10] Orozco AF，Lewis DE.Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma[J].Cytometry A，2010，77（6）：502-514.

[11] Densmore JC，Signorino PR Ou J，Hatoum OA，et al.Endothelium-derived microparticles induce endothelial dysfunction and acute lung injury[J].Shock，2006，26（5）：464-471.

[12] Dignat-George F，Camoin-Jau L，Sabatier F，et al.Endothelial microparticles：a potential contribution to the thrombotic complications of the antiphospholipid syndrome[J].Thromb Haemosta，2004，91（4）：667-673.

[13] Lacroix R，Sabatier F，Mialhe A，et al.Activation of plasminogen into plasmin at the surface of endothelial microparticles：a mechanism that modulates angiogenic properties of endothelial progenitor cells in vitro[J].Blood，2007，110（7）：2432-2439.

[14] Abid Hussein MN，Meesters EW，Osmanovic N，et al.Antigenic characterization of endothelial cell-derived microparticles and their detection ex vivo[J].J Thromb Haemost，2003，1（11）：2434-43.

[15] 陳瀟，吳麗娟.抗凝劑、標(biāo)本保存溫度和保存時(shí)間對(duì)流式T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)的影響[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2012，33（2）：146-150.

[16] 黃春梅，郭野，陳倩，等.不同流式細(xì)胞分析系統(tǒng)對(duì)外周血淋巴細(xì)胞亞群分析結(jié)果的影響[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011，34（5）：403-408.

[17] 余憲，張晶.流式細(xì)胞分析中細(xì)胞預(yù)處理方法的改進(jìn)[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2005，28（7）：752-753.

（收稿日期：2015-01-21 本文編輯：祁海文）