李靜　陳軍　李秀玉

[摘要] 目的 觀察骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）的全細胞抗原（WCAs）對人肺腺癌細胞株A549荷瘤的影響，并探討腫瘤相關(guān)增殖抗原的改變揭示其可能的抑制機制。 方法 全骨髓貼壁法原代培養(yǎng)小鼠MSCs，取3～5代MSCs以15 Gy X線滅活獲取WCAs，將BALB/c小鼠隨機分成實驗組和對照組，每組各24只。實驗組皮下接種WCAs（1 次/3 d，共2周），獲得免疫接種小鼠模型，對照組皮下注射同體積的磷酸緩沖液。觀察兩組小鼠腫瘤生長情況，測量腫瘤直徑、計算腫瘤體積，并于接種后第7（Day7）、30天（Day30）行Western blot及實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測增殖細胞核抗原（PCNA）及Ki-67因子的蛋白及mRNA水平。 結(jié)果 肺腺癌A549細胞皮下移植成功使小鼠荷瘤，實驗組小鼠的腫瘤體積顯著小于對照組（P < 0.05）；實驗組PCNA蛋白水平顯著低于對照組[Day7：（6.42±0.54）比（18.67±0.96），P < 0.01；Day30：（2.12±0.14）比（4.32±0.25），P < 0.05]；PCNA mRNA水平低于對照組[Day7：（11.64±0.28）比（25.18±1.37），P < 0.01；Day30：（2.11±0.18）比5.69±0.41），P < 0.01]；實驗組Ki-67蛋白水平顯著低于對照組[Day7：（1.57±0.51） 比（4.84±0.23），P < 0.05；Day30：（2.75±0.28）比（5.66±0.19），P < 0.01]；Ki-67 mRNA水平也明顯下調(diào)[Day7：（2.12±0.43）比（5.94±1.03），P < 0.01；Day30：（3.71±0.72）比（8.62±0.35），P < 0.01]。 結(jié)論 采用MSCs獲得全細胞抗原進行免疫應(yīng)激可產(chǎn)生抑制腫瘤生長作用，其機制可能與及腫瘤增殖相關(guān)因子PCNA、Ki-67的下調(diào)有關(guān)，其內(nèi)在的免疫分子機制有待深層次的探索。

[關(guān)鍵詞] 骨髓間充質(zhì)干細胞；腫瘤；免疫治療

[中圖分類號] R734.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）08（a）-0004-05

免疫治療不僅能增強機體的主動抗腫瘤能力，識別殺傷腫瘤細胞，同時還避免了傳統(tǒng)治療的毒副作用。腫瘤特異性抗原和相關(guān)抗原能夠激發(fā)機體的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫，從而識別和殺傷腫瘤[1]。最新的理念認為，選取盡可能全面的腫瘤抗原作為應(yīng)激抗原可以最大程度實現(xiàn)腫瘤免疫應(yīng)激，從而激發(fā)抗腫瘤作用。因此，如何獲取最為理想的腫瘤抗原成為腫瘤免疫研究的熱點。當前，全腫瘤細胞抗原（WCAs）、樹突細胞荷載腫瘤全抗原、抗原多重修飾等等研究正初步展開[2-3]；有意思的是，有學者基于腫瘤細胞與干細胞的相似性，提出通過“胚胎類物質(zhì)”或“干細胞”等獲得抗原進行荷瘤免疫，發(fā)現(xiàn)胚胎干細胞的WCAs對大腸癌細胞皮下移植瘤有明顯抑制作用[4]。

目前，對于骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）全抗原對于腫瘤預(yù)防免疫應(yīng)激的研究尚無報道。MSCs屬于成體干細胞，存在于骨髓基質(zhì)中可向三個胚層組織進行誘導分化，取材簡單、培養(yǎng)容易，且其研究及臨床運用均不存在倫理爭議[5]。本研究采用MSCs為目的瘤苗制備WCAs，分次對小鼠進行預(yù)防接種后進行以人肺腺癌A549細胞荷瘤造模，觀察腫瘤生長情況并初步探索分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；熒光定量PCR儀（日本TOYOBO東洋紡定量PCR儀器型號：Bio-red IQ5）；凝膠成像系統(tǒng)（美國ProteinSimple公司）；低溫高速離心機（美國Beckman公司）。

1.2實驗動物與主要試劑

BALB/c野生小鼠（軍事醫(yī)學科學院）；RPMI-1640、低糖型培養(yǎng)基（DMEM）（美國Hyclone公司）；胎牛血清（美國Hyclone公司）；胰白酶干粉（美國Sigma公司）；10×多聚賴氨酸（北京中杉公司）；膠考馬斯亮藍（美國Sigma）；BCA蛋白濃度測定藥盒（PIERCE公司）；丙烯酞胺（美國Sigma）；甲又丙烯酞胺（美國Sigma）；Tris堿（上海生工生物技術(shù)公司）；一抗anti-PCNA，anti- Ki-67（美國Santa）；二抗-辣根（北京中杉公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 MSCs培養(yǎng)、鑒定及A549培養(yǎng) ①MSCs：全骨髓貼壁法培養(yǎng)MSCs，6周小鼠的股骨和脛骨，以10%胎牛血清（FBS）-低糖DMEM沖出骨髓，直接接種在培養(yǎng)瓶里，24～48 h后去懸浮，再接下來的每3～4天換液，直到需要傳代。②人肺腺癌A549細胞：從液氮罐中取出A549細胞凍存管，放入37℃水浴鍋中解凍，1000 r/min離心5 min，PBS吹打清洗重新離心后，以 10%FBS+5% RPMI-1640培養(yǎng)，每2～3天換液，直到需要傳代。

1.3.2 MSCs全細胞抗原制備、免疫應(yīng)激BALB/c小鼠及實驗分組 X線照射裂解法獲得抗原，具體如下調(diào)整3～5代A549細胞密度為1×106，接種于培養(yǎng)皿中行X線照射，照射強度為15 Gy；照射后的抗原4℃保存不超過6 h。獲得WCAs后，根據(jù)是否接受抗原刺激將BALB/c小鼠隨機分成兩組，每組各24只；其中實驗組小鼠每3天接受1次皮下注射瘤苗應(yīng)激（抗原液加PBS共2 mL），2周后（共5次）進行腫瘤荷瘤造模。對照組小鼠每3天接受1次皮下注射2 mL的PBS，同樣2周后行荷瘤造模。

1.3.3 A549皮下移植造模及腫瘤測量 獲得復(fù)蘇后3～4代A549細胞，調(diào)整細胞密度為1×106接種小鼠上肢下方（腋窩下）皮膚，接種后分別于第3、5、7、15、21、30天觀察腫瘤增長情況；處死小鼠后，取下腫瘤組織，測量最長徑與最短徑，計算腫瘤體積，公式為公式V=2πab/6（a為長徑，b為短徑）。

1.3.4 Western blot檢測PCNA、Ki-67蛋白表達 接種后第7、30天，提取細胞總蛋白，紫外分光光度計檢測蛋白濃度后將蛋白上樣，以堆積膠80 V，分離膠120 V，電泳時間90 min；移入玻璃皿中加入Coomassie染色液2 h后脫色；再轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗孵育，一抗的封閉液稀釋為1∶20，同時抗人GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）單克隆抗體作為陽性對照，其封閉液稀釋為 1∶1000。室溫作用2 h，TBST沖洗5 min×4次；辣根酶標記二抗，封閉液稀釋為1∶2000，室溫1 h后TBST沖洗；定影、顯影。結(jié)果用數(shù)碼相機攝取并用NCBI的Melanie Viewer 7.0軟件分析進行圖像分析，測定各個條帶的灰度值，將SIRTI條帶灰度值與其相應(yīng)的GAPDH條帶灰度值相比較，每組所得數(shù)值求均數(shù)。

1.3.5 Real-time PCR檢測PCNA、Ki-67 mRNA表達 接種后第7、30天，提取細胞總RNA提取，所得RNA溶解于DEFC水中；紫外分光光度計測定總RNA濃度 取2 μL總RNA稀釋至600 μL，測260處光密度OD值，RNA濃度（μg/mL）=OD×300×40。加入逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴增反應(yīng)體系。擴增過程：取2 μL模板，在25 μL PCR擴增反應(yīng)體系中先將模板于97℃，2 min，加入Taq DNA聚合酶，循環(huán)儀中循環(huán)35次。PCR擴增條件及引物見表1。反應(yīng)完成后，取10 μL PCR反應(yīng)液在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳分離，EB染色后照相，軟件系統(tǒng)掃描。以目的mRNA擴增帶的平均光密度對GAPDH mRNA擴增帶平均光密度的比值代表組織中目的mRNA的表達水平。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MSCs形態(tài)

原代接種1 d即可見較多貼壁細胞，外觀呈紡錘形和多角形，并可見細胞核，48～72 h后細胞數(shù)量明顯增多，呈現(xiàn)纖維長條樣梭型細胞；圖1示不同放大倍數(shù)下MSCs的形態(tài)，可看到不甚均一的梭型排列的細胞，400倍鏡下可見到有部分細胞細胞核內(nèi)有雙核仁。

在倒置顯微鏡下MSCs多呈紡錘形和多角形，部分細胞呈現(xiàn)纖維長條樣梭型細胞，400倍鏡下可見部分MSCs的細胞核內(nèi)有雙核仁，提示細胞增殖活躍，細胞狀態(tài)良好

2.2 移植瘤體積及其增殖曲線評估

分別對兩組小鼠的腫瘤進行測量，首先評估體內(nèi)腫瘤增殖情況，如圖2所示，實驗組皮下移植腫瘤明顯小于對照組；進一步解剖獲得腫瘤，分別測量兩組腫瘤的最長徑與最短徑計算出其體積，第3天時，對照組移植瘤的短徑及長徑均大于實驗組，但是差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），然而自第5天開始，MSCs抗原進行預(yù)防接種，實驗組其短經(jīng)與長徑都小于對照組（P < 0.05）；第3、5、7、15、21、30天實驗組體積均明顯小于對照組（P < 0.05或P < 0.01），見表2。并進一步獲得其增殖曲線，發(fā)現(xiàn)實驗組的增殖趨勢明顯低于對照組。

2.3 MSCs全細胞瘤苗抗原對PCNA及Ki-67的影響

MSCs作用后，腫瘤組織的PCNA及Ki-67的表達都明顯下調(diào)，本研究檢測了7、30 d的PCNA與Ki-67的表達，可見在蛋白水平及mRNA水平PCNA與Ki-67的表達，實驗組顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。見表3、圖3～4。

3 討論

腫瘤免疫治療源于Burnet提出的“腫瘤免疫監(jiān)視”理論，認為機體的免疫系統(tǒng)能夠通過細胞免疫機制識別并產(chǎn)生免疫應(yīng)答。研究表明，該種免疫應(yīng)答的機制十分復(fù)雜，涉及多種免疫細胞及其分泌的產(chǎn)物，包括T淋巴細胞、NK細胞、NC細胞和巨噬細胞等免疫細胞介導的特異或非特異的細胞免疫，抗體介導的體液免疫以及補體、細胞因子的抗腫瘤作用[6]；因此，探索有效、安全的應(yīng)激源即“識別”是免疫治療的基礎(chǔ)[7]。

腫瘤的胚胎特性的認識由來已久，并且二者在增殖分化、侵襲、血管侵蝕和新生血管形成、免疫逃逸及細胞凋亡等諸多方面具有驚人的相似性[8]：二者表達相同的表面抗原，即癌胚抗原（carcino-embryonic antigens，CEA），在腫瘤狀態(tài)時會使得機體一些機體發(fā)育過程中許多原本“關(guān)閉”的基因激活，可重新生成和分泌這些胚胎期的蛋白如甲胎蛋白、CEA、FSA等[9-10]。正是基于此，研究者開始探索干細胞與腫瘤的關(guān)系。大量研究，在多種實體腫瘤中都存在少數(shù)具有干細胞特性即自我更新能力和多向分化潛能的細胞亞群，這種細胞亞群被稱為腫瘤干細胞，其對腫瘤形成、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及化療耐藥性都有著重要影響[11]。2009年，Li等[4]創(chuàng)新性地發(fā)現(xiàn)以胚胎干細胞體外制作瘤苗可以起到抑制腫瘤增殖的作用，這項研究也使得人們在瘤苗探索的道路上多了新的思路，即干細胞可以作為瘤苗來源。那么，除了胚胎干細胞別的干細胞是否具有類似的作用呢？

本研究首次評估了MSCs作為瘤苗具有腫瘤免疫接種作用。筆者以X線照射MSCs獲得裂解抗原，每周3 d一次給予BALB/c小鼠皮下接種，連續(xù)4周獲得瘤苗應(yīng)激模型；再以GFP-A549皮下注射對其進行荷瘤造模，并設(shè)置第3、5、7、15、21、30天觀察腫瘤增殖情況，本研究發(fā)現(xiàn)瘤苗接種組從第3天開始其腫瘤體積小于對照組，并且隨著時間的延長，其差別愈發(fā)明顯，說明疫苗應(yīng)激產(chǎn)生的抑瘤作用可能是長期的。Li等[4]采用胚胎干細胞系H9獲得疫苗，觀察其免疫刺激后荷瘤的增殖情況，同樣發(fā)現(xiàn)自第3天開始其免疫應(yīng)激的抑瘤作用開始凸顯；又有學者比較胚胎干細胞瘤苗對于不同數(shù)量的腺瘤細胞移植后腫瘤增殖的影響，發(fā)現(xiàn)無論移植初始細胞計量多少，干細胞瘤苗均可以產(chǎn)生明確的抑瘤作用[12]。

PCNA由Miyachi等[13]于1978年在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的血清中首次發(fā)現(xiàn)并命名，因其只存在于正常增殖細胞及腫瘤細胞內(nèi)而得名；Mathews等[14]發(fā)現(xiàn)PCNA與細胞周期蛋白（Cyclin）屬于同一物質(zhì)，并與細胞增殖程度直接相關(guān)；后來人們在乳腺癌、肺癌、肝癌、大腸癌等多種腫瘤中都監(jiān)測到PCNA表達的上調(diào)[15-16]；總之，在不同的調(diào)控通路中，PCNA可以作為多種蛋白的功能轉(zhuǎn)換因子發(fā)揮作用。在細胞增殖、分化及凋亡事件中，PCNA都參與了十分重要的角色，尤其是反映細胞增殖狀態(tài)的良好指標。Ki-67是一種大分子蛋白質(zhì)，存在于細胞核內(nèi)，1993年，學者得出其氨基酸序列[17]，發(fā)現(xiàn)其包含有40個弱的和10個強的PCST區(qū)（富含脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸）；研究顯示，Ki-67與細胞增殖至關(guān)重要，可以用來識別生長中的正常和腫瘤細胞，評估細胞的增殖程度，但對靜止期的細胞無作用，故Ki-67已成為細胞增殖的標志之一；研究者發(fā)現(xiàn)Ki-67的作用是在有絲分裂過程中有維持DNA規(guī)則結(jié)構(gòu)的重要作用，是具有結(jié)合特性的重要的結(jié)構(gòu)蛋白，在細胞增殖過程中不可缺少[18]；研究已經(jīng)證實其在乳腺癌[19]、肺癌[20]、結(jié)直腸癌[21]等幾乎所有的惡性增殖的腫瘤中都高表達。

因此，為了初步評估MSCs瘤苗用于A549的接種的分子機制，本研究檢測了第7、30天接種組和對照組腫瘤增值因子PCNA及Ki-67的蛋白及mRNA表達情況。正如本研究結(jié)果中描述的一樣，瘤苗應(yīng)激刺激后無論蛋白水平和RNA水平，PCNA及Ki-67的表達都顯著下調(diào)，從而推測，瘤苗可能由于免疫狀態(tài)的改變下調(diào)了抑制瘤的增殖活性，從而抑制了移植瘤的增殖。當然，細胞的免疫通路紛繁復(fù)雜，其內(nèi)在的具體的分子通路及免疫機制有待進一步深入研究。

[參考文獻]

[1] Scanlan MJ，Gure AO，Jungbluth AA，et al. Cancer/testis antigens：an expanding family of targets for cancer immunotherapy [J]. Immunological Reviews，2002，188：22-32.

[2] Blattman JN，Greenberg PD. Cancer immunotherapy：a treatment for the masses [J]. Science，2004，305（5681）：200-205.

[3] Nagrath S，Sequist LV，Maheswaran S，et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology [J]. Nature，2007，450（7173）：1235-1239.

[4] Li Y，Zeng H，Xu RH，et al. Vaccination with human pluripotent stem cells generates a broad spectrum of immunological and clinical responses against colon cancer [J]. Stem Cells，2009，27（12）：3103-3111.

[5] Minguell JJ，Erices A，Conget P. Mesenchymal stem cells [J]. Experimental Biology and Medicine，2001，226（6）：507-520.

[6] 張彩，田志剛.腫瘤免疫逃逸機制的研究進展[J].國外醫(yī)學：腫瘤學分冊，2000，27（2）：77-79.

[7] Parish CR. Cancer immunotherapy：the past，the present and the future [J]. Immunology and Cell Biology，2003，81（2）：106-113.

[8] Dick JE. Stem cell concepts renew cancer research [J]. Blood，2008，112（13）：4793-4807.

[9] Wicha MS，Liu S，Dontu G. Cancer stem cells：an old idea—a paradigm shift [J]. Cancer Research，2006，66（4）：1883-1890.

[10] Brabletz T，Jung A，Spaderna S，et al. Migrating cancer stem cells—an integrated concept of malignant tumour progression [J]. Nature Reviews Cancer，2005，5（9）：744-749.

[11] Clevers H. The cancer stem cell：premises，promises and challenges [J]. Nature Medicine，2011，17（3）：313-319.

[12] Dong W，Du J，Shen H，et al. Administration of embryonic stem cells generates effective antitumor immunity in mice with minor and heavy tumor load [J]. Cancer Immunology Immunotherapy，2010，59（11）：1697-1705.