趙進(jìn)軍,胡子有,歐陽晴晴,毋　靜,陳玉姣,楊　敏△

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院：1.風(fēng)濕免疫科；2.實(shí)驗(yàn)中心，廣州 510515)

小鼠滑膜成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)

趙進(jìn)軍1,胡子有2,歐陽晴晴1,毋靜1,陳玉姣1,楊敏1△

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院：1.風(fēng)濕免疫科；2.實(shí)驗(yàn)中心，廣州 510515)

[摘要]目的利用C57BL/6小鼠探索出一種改良的小鼠滑膜成纖維細(xì)胞(SF)的原代培養(yǎng)方法，以方便類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)關(guān)于滑膜炎的研究。方法收集小鼠髖關(guān)節(jié)周圍滑膜，去除內(nèi)含的“蛋黃樣”物，將滑膜移入含0.5% Ⅳ型膠原酶的EP管中，剪碎；置入37 ℃搖箱中振蕩消化60 min，然后在渦輪振蕩儀上振蕩1.5 min，常規(guī)培養(yǎng)。結(jié)果細(xì)胞培養(yǎng)1周左右。進(jìn)行第一次傳代；大約在培養(yǎng)10 d后滑膜巨噬細(xì)胞的數(shù)量達(dá)到最高峰，然后逐漸減少；在第3次傳代(15～20 d)后，滑膜巨噬細(xì)胞基本消失。用Vimentin標(biāo)記的細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色顯示SF細(xì)胞純度超過95%；用Vimentin和CD90.2標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)顯示其純度達(dá)到95%，用CD54標(biāo)記其純度大約為80%。結(jié)論利用C57BL/6小鼠探索出一種改良的小鼠SF的原代培養(yǎng)方法是一種簡便易行的小鼠SF的原代培養(yǎng)方法。

[關(guān)鍵詞]關(guān)節(jié)炎,類風(fēng)濕;成纖維細(xì)胞;滑膜;細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù);小鼠,近交C57BL

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以慢性侵蝕性關(guān)節(jié)炎為特征的全身性自身免疫性疾病。RA的病變特點(diǎn)為滑膜炎，以及由此造成的關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形。如果不經(jīng)過正規(guī)治療，約45%的患者在10年內(nèi)出現(xiàn)殘廢[1]。RA廣泛分布于世界各地，其發(fā)病具有一定的種族差異，在不同人群中的患病率為0.18%～1.07%[2-3]。RA在各年齡中皆可發(fā)病，高峰年齡在30～50歲，一般女性發(fā)病多于男性[4]。

RA的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至少有8種細(xì)胞類型參與，包括：肥大細(xì)胞[5]、成纖維細(xì)胞[6]、巨噬細(xì)胞[7]、T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞[8]、軟骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞[9]等，這些細(xì)胞通過表面的受體、分泌的細(xì)胞因子、趨化因子、組織蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶等相互作用，形成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。RA的主要病理改變?yōu)榛ぱ?，表現(xiàn)為滑膜增生和炎性細(xì)胞浸潤。血管翳形成是RA滑膜炎的重要病理特征，在RA軟骨和骨破壞過程中發(fā)揮重要作用[10]?；こ衫w維細(xì)胞(SF)和滑膜巨噬細(xì)胞是滑膜組織內(nèi)兩種主要細(xì)胞類型。在非病變組織內(nèi)，SF的生理功能是給關(guān)節(jié)腔和臨近軟骨提供營養(yǎng)性的漿蛋白和潤滑分子。SF也通過產(chǎn)生基質(zhì)成分如膠原和透明質(zhì)酸及一系列基質(zhì)降解酶參與不斷的基質(zhì)重塑[11]。但在RA中，SF激活形成類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞(RASF)，通過產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子和基質(zhì)降解分子破壞關(guān)節(jié)。

如何在體外快速獲得大量的SF是RA基礎(chǔ)研究中的一個(gè)難點(diǎn)，目前在大鼠、兔子等大型嚙齒類動(dòng)物中由于其滑膜組織相對(duì)較多，體外培養(yǎng)SF容易。但小鼠由于關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜體積小，難以獲得大量純化的細(xì)胞。目前小鼠SF的原代培養(yǎng)體系還沒有完全建立[12],不易成功,細(xì)胞生存時(shí)間短,傳代次數(shù)少,增加了對(duì)其進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究的難度,制約了關(guān)節(jié)疾病研究的順利進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)摸索出一種改良的SF培養(yǎng)法，培養(yǎng)時(shí)間短，且細(xì)胞純度較大。

1材料和方法

1.1動(dòng)物、器材及試劑5～10周齡C57BL/6小鼠1只。顯微外科手術(shù)剪刀和鑷子、1.5 mL EP管、0.2 μm濾器、60 mm培養(yǎng)皿、3 mL一次性吸管、75 cm2培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)箱、無菌操作臺(tái)、體視鏡、離心機(jī)、渦輪機(jī)、恒溫?fù)u箱、流式細(xì)胞儀、光學(xué)顯微鏡。75%乙醇、青霉素/鏈霉素、Ⅳ型膠原酶、DMEM(高糖)培養(yǎng)基、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液(PBS)、吐溫-20、Triton X-100;大鼠抗小鼠CD106單克隆抗體(BD Biosciences Cat.#553330),大鼠IgG2aκ同型對(duì)照抗體(BD Biosciences Cat.#553927),FITC熒光標(biāo)記山羊抗大鼠二抗(BD Biosciences Cat.#554016),PE熒光標(biāo)記倉鼠抗小鼠CD54抗體(BD Biosciences Cat.#553253),PE熒光標(biāo)記倉鼠IgG1κ同型對(duì)照抗體(BD Biosciences Cat.#553972),生物素標(biāo)記大鼠抗小鼠CD90.2抗體(BD Biosciences Cat.#553011),生物素標(biāo)記大鼠IgG2b κ同型對(duì)照抗體(BD Biosciences Cat.#553987),PE熒光標(biāo)記Streptavidin鏈霉親和素(BD Biosciences Cat.#554061),兔抗小鼠波形蛋白抗體(Cell Signaling Cat.#9854)。

1.2試劑的配制含血清DMEM(高糖)培養(yǎng)基：加入青霉素、鏈霉素和15%胎牛血清。1% Ⅳ型膠原酶：100 mg Ⅳ型膠原酶用10 mL TBS配置，0.22 μm濾器過濾除菌后分裝成1 mL，-20 ℃保存。PBST：100 μL的Tween-20用100 mL PBS 稀釋，室溫保存，2個(gè)月內(nèi)使用完畢。

1.3滑膜組織的獲取小鼠斷頸處死，置于75%乙醇中消毒2 min，剪開雙后肢皮膚，用顯微外科手術(shù)剪刀和鑷子在髖關(guān)節(jié)的周圍剪下滑膜組織(為白色海綿狀，圖1A所示)，需注意將其中“蛋黃樣”黃色橢圓物去除(圖1B中小圖所示)。轉(zhuǎn)移入含2 mL DMEM培養(yǎng)基的60 mm平皿中。在該實(shí)驗(yàn)中，主要是采用髖關(guān)節(jié)周圍的滑膜組織，但如欲獲得更多的滑膜組織，也可進(jìn)行以下操作：取下雙后肢(不含足踝，應(yīng)保留所有的肌肉組織)，置于含2 mL DMEM培養(yǎng)基的60 mm平皿中。在體視鏡下，用顯微外科手術(shù)剪刀和鑷子剪開小鼠腘窩內(nèi)肌肉，剪下滑膜組織(圖1C中箭頭2所示)，也需注意將其中“蛋黃樣”黃色橢圓物去除(圖1B所示)，轉(zhuǎn)移入另一個(gè)含2 mL DMEM培養(yǎng)基的60 mm平皿中。為獲取關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜組織，可在體視鏡下沿髕骨兩側(cè)打開膝關(guān)節(jié)腔(圖1C中箭頭3所示)，翻轉(zhuǎn)暴露關(guān)節(jié)腔，小心剝離關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜組織(圖1D所示)。

A：髖關(guān)節(jié)周圍滑膜組織，在體視鏡下滑膜組織顯示為白色泡沫狀，但在大體解剖時(shí)，由于與腹膜相臨近，呈現(xiàn)出淺紅色;B：分離下來的髖關(guān)節(jié)周圍滑膜組織，在圖中轉(zhuǎn)彎部位隱藏著一個(gè)類似“蛋黃樣”的圓形物，如小圖所示，由于體視鏡下拍照導(dǎo)致顏色失真，實(shí)際應(yīng)為黃色;C：為分離下來的后肢，數(shù)字2標(biāo)識(shí)的滑膜組織隱藏在腘窩深處，需剪開肌肉才可暴露，該處獲得的滑膜組織中也存在類似髖關(guān)節(jié)周圍滑膜組織中隱含的“蛋黃樣”物；數(shù)字3標(biāo)識(shí)的為膝關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜組織，需沿髕骨兩側(cè)打開膝關(guān)節(jié)腔后暴露;D：為分離下來的滑膜組織，數(shù)字1標(biāo)識(shí)的為髖關(guān)節(jié)周圍滑膜組織，數(shù)字2標(biāo)識(shí)的為腘窩內(nèi)滑膜組織，數(shù)字3標(biāo)識(shí)的為膝關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜組織。

圖1不同部位的滑膜組織

A：原代培養(yǎng)3 d(×10)，SF貼壁生長良好，也可見到部分滑膜巨噬細(xì)胞;B:第1代，培養(yǎng)9 d(×10)，由于SF生長密集，滑膜巨噬細(xì)胞的數(shù)量不多；但如此時(shí)進(jìn)行消化傳代，即可發(fā)現(xiàn)有較多的滑膜巨噬細(xì)胞貼壁生長;C:第2代，培養(yǎng)16 d(×10)，滑膜巨噬細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，而SF的純度明顯提高。

圖2不同時(shí)間點(diǎn)的SF生長狀況

1.4滑膜組織的消化及SF的培養(yǎng)將修剪后的滑膜組織轉(zhuǎn)移至含0.5 mL DMEM和0.5 mL Ⅳ型膠原酶的EP管中，剪碎成1 mm3的碎塊。將EP管平放置于37 ℃搖箱中(200次/min)，振蕩消化60 min；消化后，置于渦輪機(jī)上高速振蕩1.5 min以保證細(xì)胞分離；300×g離心5 min，吸棄上清，在超凈臺(tái)上加入含血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，選用75 cm2培養(yǎng)瓶。

1.5SF的免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色用Vimentin對(duì)第3次傳代后的SF進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色。傳代細(xì)胞消化后按1×105/mL加入12孔板培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)基，PBS輕輕漂洗2次，4%多聚甲醛固定10 min；用0.2% Triton X-100處理5 min，PBST沖洗3 min×3次；每孔加200～300 μL山羊血清封閉液，室溫下孵育20～30 min；直接加入1 μL帶熒光標(biāo)記的一抗，4 ℃避光過夜；吸去一抗，PBST沖洗3 min×3次；加上200 μL PBS，熒光顯微鏡下綠光激發(fā)。

1.6SF的流式細(xì)胞儀分析用Vimentin、CD90.2、CD54和CD106 4種細(xì)胞表面標(biāo)志物對(duì)SF的純度進(jìn)行分析，遵照各種抗體的說明書進(jìn)行。

2結(jié)果

滑膜成纖維細(xì)胞在第2天即可見貼壁，3 d后可進(jìn)行第1次換液(圖2A)，以后每3～4天換液1次，約在1周時(shí)即可進(jìn)行第1次傳代。10 d時(shí)滑膜巨噬細(xì)胞數(shù)量最多(圖2B)，此后隨傳代次數(shù)增多而減少，至第3次傳代(第15～20天)時(shí)滑膜巨噬細(xì)胞基本消失(圖2C)。

用細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色方法除可以確定細(xì)胞的性質(zhì)外，也可初步判斷出細(xì)胞純度。如圖3B中所示，用Vimentin可以很好地進(jìn)行SF的免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色，顯示其細(xì)胞純度大于95%，也證實(shí)本方法簡便可行，能夠獲得大量的SF。流式細(xì)胞分析的結(jié)果顯示，Vimentin和CD90.2標(biāo)識(shí)的細(xì)胞純度超過95%，而CD54標(biāo)識(shí)的細(xì)胞純度約為80%，但CD106標(biāo)識(shí)的細(xì)胞純度僅為23%，見圖4。

A:第3代，培養(yǎng)20 d(×10)。圖上顯示培養(yǎng)第3代時(shí)細(xì)胞生長不如圖2C所示的第2代培養(yǎng)，實(shí)際上為進(jìn)行Vimentin細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色;B:在熒光顯微鏡下Vimentin免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色(×10)顯示SF生長良好。

圖3細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色檢測SF細(xì)胞純度

A:Vimentin標(biāo)示的細(xì)胞純度約為95%;B:CD90.2 標(biāo)示細(xì)胞純度約99%;C:CD54標(biāo)示細(xì)胞純度約為83%;C:CD106標(biāo)示細(xì)胞純度約為23%。

圖4流式細(xì)胞術(shù)檢測SF細(xì)胞純度

3討論

既往小鼠滑膜細(xì)胞培養(yǎng)法有組織塊培養(yǎng)法、胰酶和膠原酶消化法等，但這些方法均存在明顯的缺點(diǎn)。組織塊貼壁法相對(duì)簡單易行，但由于組織塊小，不易均勻分布，導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量差異較大，組織塊周圍容易見到大量細(xì)胞生長。另外還有包括組織塊種植困難不易成活、原代生長周期長、細(xì)胞數(shù)量少等缺點(diǎn)[13]。胰酶法的缺點(diǎn)是不能有效消化分離纖維組織，使滑膜細(xì)胞不易游離，且過篩網(wǎng)時(shí)堵塞網(wǎng)孔，故細(xì)胞數(shù)量很少[14]。

小鼠SF的原代培養(yǎng)中作者初期按文獻(xiàn)報(bào)道用Ⅱ型膠原酶聯(lián)合胰酶消化法進(jìn)行培養(yǎng)，但該方法效果差，獲得的原代細(xì)胞數(shù)量少，純度低，需培養(yǎng)15～20 d后才可以進(jìn)行第1次傳代。Ⅳ型膠原酶能有效地消化分離纖維組織及細(xì)胞間質(zhì)，充分游離細(xì)胞，纖維組織被膠原酶消化成絮絲狀纖維。使用一種酶，同時(shí)減少過濾程序，簡化了實(shí)驗(yàn)操作的過程，減少了細(xì)胞的丟失[12]。本研究使用Ⅳ型膠原酶的濃度從最初的0.1%逐漸提高，發(fā)現(xiàn)0.5%的效果最好。也可能更高的濃度可獲得更好的效果，因0.5%的Ⅳ型膠原酶濃度已可以獲得較好效果，因此沒有再進(jìn)一步加大濃度進(jìn)行觀察。Ⅳ型膠原酶消化后，在渦輪機(jī)上振蕩也非常重要，該步驟主要目的是使SF分散開，振蕩時(shí)間少于1.0 min效果差，而振蕩1.5 min與3.0 min效果相似，因此推薦使用1.5 min。

本研究曾用關(guān)節(jié)間滑膜組織進(jìn)行培養(yǎng)，但獲得細(xì)胞純度低。不僅因?yàn)殛P(guān)節(jié)間滑膜組織少，且關(guān)節(jié)間有軟骨存在，易造成軟骨細(xì)胞的混雜，兩種細(xì)胞混雜后，目前并沒有太好的純化方法，導(dǎo)致細(xì)胞純度降低。與選取關(guān)節(jié)間滑膜組織相比，髖關(guān)節(jié)周圍滑膜組織量多，尤其是髖關(guān)節(jié)處游離的滑膜組織最多，且在體視鏡下易于修剪掉附帶的結(jié)締組織。用該方法在培養(yǎng)第3天即可見到大量的滑膜類成纖維細(xì)胞生長，在6～8 d后即可進(jìn)行第一次傳代，此時(shí)，可觀察到的滑膜類巨噬細(xì)胞的數(shù)量也最多。由于滑膜類巨噬細(xì)胞粘貼牢固，用0.25%胰酶消化后不易脫落，因此，在傳代的過程中即進(jìn)行了純化?；旧显?次傳代后即可除去巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。

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Primary culture for synovial fibroblasts in mice*

ZhaoJinjun1,HuZiyou2,OuyangQingqing1,WuJing1,ChenYujiao1,YangMin1△

(1.DepartmentofRheumatology;2.ExperimentalCenter，SouthernHospitalAffiliatedtoSouthernMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510515,China)

[Abstract]ObjectiveThe primary culture of synovial fibroblasts is a convenient tool to study the pathology and physiology of synovial tissues.An improved method was constructed in this study by C57BL/6 mice to study the mechanism of rheumatoid arthritis(RA).MethodsThe synovium around the hip joints were collected.Attention should be paid to eliminate the "egg-yolk" like yellow oval substance in the middle of the synovium.The synovium was transferred into a 1.5 mL Eppendorf tube containing 0.5% type Ⅳ collagenase and cut into 1 mm3 blocks or so.The Eppendorf tube was placed in 37 ℃ Constant temperature orbital shaker incubator for 60 min.After digestion,the tube was placed on the Vortex for a high-speed oscillation for 1.5 minutes to guarantee the separation of cells.ResultsWithin about 1 week,the first passage was performed by the trypsin digestion method.On day 10,the number of synovial macrophages reached the maximum and then decreased gradually.After the third generation (day 15 to 20),the synovial macrophages generally disappeared.Vimentin was suitable for the immunofluorescence cytochemical staining for the synovial fibroblasts.The cell purity was indicated as >95%.The cytometric analysis indicated that purity of Vimentin and CD90.2-labelled cells was over 95%;the purity of CD54-labelled cells was 80% approximately.ConclusionIt is a simple and effective method for primary culture of synovial fibroblasts in mice.

[Key words]arthritis,rheumatoid;fibroblasts;synovial membrane;cell culture techniques；mice,inbred C57BL

doi:·技術(shù)與方法·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.02.026

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30972747；81172875)。

作者簡介：趙進(jìn)軍(1978-)，主治醫(yī)師，博士，主要從事風(fēng)濕免疫研究。 △通訊作者，E-mail：minyanggz@yahoo.com。

[中圖分類號(hào)]R684.3

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)02-0228-04

(收稿日期：2015-09-18修回日期：2015-10-03)