李　娜，孫麗君，李東林，劉　頌，高家志

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦科，貴州遵義 563000；2.貴州省人民醫(yī)院婦科，貴陽(yáng) 550002)

檢測(cè)ROC1在卵巢惡性上皮性腫瘤組織中的表達(dá)及臨床意義研究*

李娜1，孫麗君1，李東林2，劉頌1，高家志1

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦科，貴州遵義 563000；2.貴州省人民醫(yī)院婦科，貴陽(yáng) 550002)

[摘要]目的探究ROC1在卵巢惡性上皮性腫瘤組織的表達(dá)及臨床意義，為卵巢上皮性惡性腫瘤的基因治療提供新的思路。方法選取2005年10月至2007年10月在遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院行卵巢癌手術(shù)并進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)5年隨訪(fǎng)的261例卵巢癌患者，對(duì)卵巢癌組織及相應(yīng)周?chē)＝M織中ROC1 mRNA及蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，并將結(jié)果與患者的預(yù)后之間的相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果ROC1在卵巢癌組織中過(guò)度表達(dá)，而在相對(duì)應(yīng)周?chē)＝M織中幾乎不表達(dá)；ROC1表達(dá)水平高低與患者的生存率存在負(fù)相關(guān)性。結(jié)論卵巢癌患者中ROC1表達(dá)水平越高，預(yù)后越差。

[關(guān)鍵詞]ROC1；卵巢腫瘤；基因療法；預(yù)后，存活率

泛素是一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量小的多肽，在生物體各類(lèi)細(xì)胞中廣泛存在。其能夠通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑將被泛素標(biāo)記的蛋白質(zhì)底物特異性識(shí)別并迅速降解，對(duì)多種細(xì)胞進(jìn)程通路具有重要的調(diào)節(jié)作用，尤其是惡性腫瘤的發(fā)生[1]。而泛素-蛋白酶體途徑包含了3種關(guān)鍵的酶：E1泛素活化酶、E2泛素結(jié)合酶和E3泛素連接酶。其中ROC1是E3泛素連接酶中的最重要的成分，對(duì)于介導(dǎo)泛素-蛋白酶體途徑起到了關(guān)鍵的作用[2]。本研究為探究卵巢癌患者中ROC1表達(dá)情況及其與患者預(yù)后相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料選取2005年10月至2007年10月在遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院因卵巢惡性上皮性腫瘤行手術(shù)治療(全面分期或腫瘤細(xì)胞減滅術(shù))并進(jìn)行了5年隨訪(fǎng)的261例患者病理標(biāo)本，所有患者診斷明確，均有病理學(xué)支持診斷。年齡28～68歲，平均48.3歲，分期情況：Ⅰ期58例，Ⅱ期81例，Ⅲ期77例，Ⅳ期45例；病理類(lèi)型：漿液性癌201例，黏液性癌27例，子宮內(nèi)膜樣癌25例，透明細(xì)胞癌8例；除Ⅰa期和Ⅰb期且為高分化的患者外，其余術(shù)后均輔助化學(xué)治療，早期患者3～6個(gè)療程，晚期患者6～8個(gè)療程。

1.2儀器及主要試劑高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Beckman Instruments公司)，Sorvall Heraeus 水平離心機(jī)(德國(guó)Hanau公司)，PCR 擴(kuò)增儀(美國(guó)MJ Research公司)，凝膠成像系統(tǒng)電泳儀(美國(guó)Pharmacia Biotech公司)，冷凍超高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf,Kendro Laboratory生產(chǎn))，凝膠掃描成像系統(tǒng) (瑞典Amersham Biotech公司)、復(fù)合蛋白酶抑制劑(美國(guó)Pierce公司)，Hybond-N+尼龍膜(美國(guó)Amersham Pharmacia Biotech Limited公司)、DAB 顯色系統(tǒng)、山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物公司)、兔抗ROC1一抗(NB100-1672,美國(guó)Novus公司)。

1.3方法選取患者手術(shù)標(biāo)本，對(duì)標(biāo)本中腫瘤組織及相應(yīng)周?chē)＝M織分別進(jìn)行檢測(cè)，采用免疫組織化學(xué)定性分析ROC1在卵巢癌組織中的表達(dá)，RT-PCR方法檢測(cè)ROC1蛋白mRNA的轉(zhuǎn)錄情況，采用Western blot法定量檢測(cè)ROC1蛋白表達(dá)情況，最后將檢測(cè)結(jié)果與患者的預(yù)后進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.3.1免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)ROC1在卵巢癌組織中的表達(dá)取卵巢癌組織標(biāo)本，10%甲醛液固定，水洗后脫水，浸蠟，包埋制備標(biāo)本，切片，貼片并干燥，最后脫蠟至水。PBS洗3次，枸櫞酸鈉抗原修復(fù)，加熱至95 ℃后冷卻，加含3%H2O2工作液封閉2 h,1∶500兔抗ROC1抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，加入1∶1 000稀釋的二抗，室溫下孵育2 h，DAB顯色，復(fù)染，封片。采用AxioVision 2 plus顯微鏡進(jìn)行觀察，并采用AxioVision3.0進(jìn)行拍照分析。

1.3.2 RT-PCR方法檢測(cè)ROC1蛋白mRNA的轉(zhuǎn)錄收集腫瘤細(xì)胞及相應(yīng)周?chē)＝M織細(xì)胞，采用Trizol提取總RNA，檢測(cè)純度備用。(1)取5 μL總RNA利用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA；利用Primer BLAST設(shè)計(jì)ROC1蛋白上游引物為5′-GAU AGC ACC AGG CAG GAA U-3′，下游引物為5′-AUU CCU GCC UGG UGC UAU C-3′，產(chǎn)物大小512 bp；GAPDH上游引物為5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG U-3′，下游引物為5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGA A-3′，產(chǎn)物大小265 bp。(2)取5 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增：94 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán)；再72 ℃條件下延伸10 min。凝膠電泳系統(tǒng)分離擴(kuò)增產(chǎn)物，觀察擴(kuò)增產(chǎn)物條帶亮度并進(jìn)行攝影。最后采用凝膠分析系統(tǒng)對(duì)擴(kuò)增條帶進(jìn)行分析，基因的表達(dá)量用相應(yīng)的平均灰度值代表，并除以GAPDH灰度值，結(jié)果作為ROC1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3Western blot法檢測(cè)ROC1蛋白表達(dá)情況取卵巢癌及周?chē)＝M織標(biāo)本，提取總蛋白并采用Bradford法檢測(cè)蛋白濃度。取30 μg總蛋白加入15%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)中進(jìn)行電泳，等溴酚藍(lán)接近凝膠底部時(shí)停止電泳，轉(zhuǎn)移緩沖液轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維膜上，TBST洗2遍，室溫下5%脫脂奶粉封閉液封閉1 h，加入1∶500的ROC1抗體稀釋液，4 ℃搖床孵育過(guò)夜，TBST水洗3次，每次5～10 min，加入1∶2 000封閉液稀釋的二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜后用ECL液顯影。采用FluorChem 5500，Alpha Innotech 處理圖像，理論條帶相對(duì)分子質(zhì)量為13×103。

1.3.4隨訪(fǎng)囑患者第1年每3個(gè)月門(mén)診復(fù)查1次，后1年、半年門(mén)診復(fù)查1次，如有復(fù)發(fā)，參照美國(guó)國(guó)立結(jié)合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)治療指南進(jìn)行進(jìn)一步治療，如患者死亡，取消隨訪(fǎng)，以2年為限，統(tǒng)計(jì)所得資料。

2結(jié)果

2.1免疫組織化學(xué)結(jié)果分析用ROC1蛋白抗體對(duì)卵巢癌組織及周?chē)＝M織進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)，卵巢癌細(xì)胞中ROC1蛋白表達(dá)明顯高于周?chē)＝M織。不同病理類(lèi)型之間的表達(dá)也不同，見(jiàn)圖1、2。

圖1　兩組組織及細(xì)胞中ROC1蛋白表達(dá)情況

圖2　不同病理類(lèi)型的組織內(nèi)ROC1蛋白表達(dá)情況(×100)

2.2ROC1 mRNA轉(zhuǎn)錄情況ROC1 mRNA在卵巢癌腫瘤細(xì)胞及周?chē)＝M織細(xì)胞中表達(dá)有顯著差異，ROC1 mRNA在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，隨著惡性程度增高而升高。見(jiàn)圖3。

1:正常組織；2:腫瘤組織；3:腫瘤組織(++)；4:腫瘤組織(+++)；5:腫瘤組織(++++)。

圖3ROC1 mRNA表達(dá)情況

2.3ROC1蛋白表達(dá)情況Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)的ROC1分子量與理論值相等，表明腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的蛋白的確為ROC1蛋白，見(jiàn)圖4。

圖4　ROC1蛋白Western blot 結(jié)果

2.4不同ROC1表達(dá)與卵巢癌預(yù)后生存曲線(xiàn)圖隨著ROC1表達(dá)的程度逐漸升高，患者的病死率越高，見(jiàn)圖5。

圖5　ROC1蛋白表達(dá)與生存率之間的生存曲線(xiàn)圖

3討論

卵巢癌在婦科惡性腫瘤中發(fā)病率第二，但病死率卻是居?jì)D科惡性腫瘤之首[3]。目前，卵巢癌的發(fā)病原因尚不明確，主要與不育、妊娠次數(shù)少及使用促排卵藥物、絕經(jīng)晚、長(zhǎng)期口服避孕藥、飲食因素及遺傳因素等有關(guān)[4]。由于其位置特殊，早期通常無(wú)明顯表現(xiàn)，預(yù)后較差。

泛素-蛋白酶體途徑是介導(dǎo)蛋白質(zhì)降解的過(guò)程[1]。其中包含E1泛素活化酶、E2泛素結(jié)合酶和E3泛素連接酶[2]。E3泛素連接酶可以促進(jìn)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子等多種蛋白底物的降解，功能失常會(huì)導(dǎo)致一系列的疾病，包括腫瘤[5]。研究發(fā)現(xiàn)，其中的F-box蛋白Skp2在多種腫瘤組織中過(guò)度表達(dá)[6]，且能夠促進(jìn)P27的降解，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。ROC1是E3泛素連接酶環(huán)狀結(jié)構(gòu)中的核心部分，也是泛素-蛋白酶體系統(tǒng)中最關(guān)鍵的部分[7]，能夠調(diào)節(jié)生理和病理狀態(tài)下的多種細(xì)胞進(jìn)程，如DNA 修復(fù)、炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等，在細(xì)胞生命活動(dòng)中具有重要的意義。

近年來(lái)，隨著研究的深入，在酵母菌[8]、隱桿線(xiàn)蟲(chóng)[9]、果蠅[10]中均發(fā)現(xiàn)ROC1是細(xì)胞增殖不可缺少的關(guān)鍵物質(zhì)，而且ROC1的缺失會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡或衰老死亡，經(jīng)ROC1恢復(fù)表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)。但在實(shí)體腫瘤中的研究尚未大面積開(kāi)展。Li等[11]研究發(fā)現(xiàn)，ROC1在多種惡性腫瘤細(xì)胞中均有過(guò)度表達(dá)的情況，但在周?chē)＝M織細(xì)胞中微量或者不表達(dá)。例如肺癌，在鱗癌中表達(dá)要高于腺癌及正常組織。Nai等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在黑色素瘤中，ROC1的表達(dá)與細(xì)胞周期素D1呈顯著的負(fù)相關(guān)，即ROC1能夠降解細(xì)胞周期素D1表達(dá)。

本試驗(yàn)及前期試驗(yàn)研究結(jié)果表明：ROC1在卵巢癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于卵巢良性腫瘤組織和正常卵巢組織[13-14]，ROC1表達(dá)水平高低與患者的生存率存在負(fù)相關(guān)性。ROC1 mRNA在卵巢癌腫瘤細(xì)胞及周?chē)＝M織細(xì)胞中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，ROC1蛋白在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)隨著惡性程度增高而升高。本研究還發(fā)現(xiàn)ROC1蛋白在透明細(xì)胞癌組織的表達(dá)高于其他類(lèi)型的卵巢癌組織，且該蛋白的表達(dá)水平與腫瘤的病理分級(jí)有關(guān)(Z/χ2=9.0704，P<0.05)，其原因可能與ROC1基因在不同類(lèi)型的卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用不同有關(guān)。近期有研究表明E3泛素連接酶CRL4-CDT2/DCAF2可以成為潛在的上皮性卵巢癌化學(xué)治療的靶點(diǎn)[15]。

ROC1蛋白過(guò)度表達(dá)潛在的生物學(xué)原理及與卵巢癌的惡性行為的關(guān)系目前尚不清楚。作者下一步將研究卵巢惡性腫瘤的血清ROC1的表達(dá)，探討血清ROC1是否有預(yù)測(cè)卵巢癌的價(jià)值。

推測(cè)ROC1蛋白可作為卵巢惡性腫瘤，特別是惡性程度較高的透明細(xì)胞癌預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)，對(duì)卵巢癌的臨床治療具有重要的意義，同時(shí)可能成為基因治療的一個(gè)靶點(diǎn)。

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Expression and clinical significance of ROC1 in women with epithelial ovarian cancer*

LiNa1,SunLijun1,LiDonglin2,LiuSong1,GaoJiazhi1

(1.DepartmentofGynaecology,theAffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi,Guizhou563000,China;2.DepartmentofGynaecology,thePeople′sHospitalofGuizhou,Guiyang,Guizhou550002,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of ROC1 in ovarian cancer tissues,to provide new ideas for the gene therapy of ovarian cancer.Methods261 women with ovarian cancer underwent resection from December 2005 to December 2007 in the Affiliated Hospital of Zunyi Medical College and with 5 years follow-up were enrolled.ROC1 mRNA transcription and protein expression level of ovarian cancer tissue and surrounding normal tissue were tested,and later the correlation between the results and patient′s prognosis was statistically analyzed.ResultsROC1 in ovarian cancer tissue was over-expressed,but almost no expression in surrounding normal ovarian carcinoma;ROC1 expression levels had a negative correlation with the survival rate of the patients.ConclusionROC1 in ovarian cancer tissue was over-expressed,but almost no expression in surrounding normal ovarian carcinoma;ROC1 expression levels had a negative correlation with the survival rate of the patients.

[Key words]ROC1;ovarian neoplasms;gene therapy;prognosis,survival rate

doi:論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.02.018

基金項(xiàng)目：貴州省科技廳聯(lián)合基金資助項(xiàng)目(黔科合J字LKZ[2012]50號(hào))。

作者簡(jiǎn)介：李娜(1980-)，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事臨床婦科腫瘤研究。

[中圖分類(lèi)號(hào)]R737.31

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)02-0202-03

(收稿日期：2015-08-08修回日期：2015-09-16)