童波 鐘進生 梁瑩 吳西雅 肖祖克 周洪 郭玲玲

5-Aza-dC在肺癌細胞系中去甲基化作用機制

童波 鐘進生 梁瑩 吳西雅 肖祖克 周洪 郭玲玲

目的 研究5-Aza-dC對肺癌細胞系中的去甲基化的作用。方法 對正常肺細胞以及5-Aza-dC分組處理的A549、NCI-H520甲基化特異性PCR和RT-PCR定量檢測。結(jié)果 未處理的A549和NCI-H520細胞中TFPI-2表現(xiàn)出完全甲基化特異性。而經(jīng)過5-Aza-dC處理過的肺癌細胞系細胞則表現(xiàn)出不完全甲基化狀態(tài)，并呈現(xiàn)出量效關(guān)系。A549和NCI-H520細胞在經(jīng)5-Aza-dC處理后TFPI-2基因mRNA表達均明顯高于未處理組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；并呈現(xiàn)出量效關(guān)系。結(jié)論 5-Aza-dC對肺癌細胞中的TFPI-2基因具有去甲基化作用，并具有量效關(guān)系。

5-Aza-dC；TFPI-2；甲基化；A549；NCI-H520

肺癌是一種死亡率較高的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。雖然對肺癌所采用的治療方案在不斷的改善，患者5年生存率卻未獲得提高[2]。惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是造成肺癌臨床治療失敗和患者死亡的主要原因[3]。早期治療生存率明顯高于晚期治療的患者[4]?；蚣谆悄[瘤分子生物學(xué)研究的熱點[5]。在腫瘤發(fā)生發(fā)展中通過去甲基化處理可恢復(fù)抑癌基因的表達，從而達到防治腫瘤的目的[5-6]。

組織因子信號通路抑制因子TFPI-2，是一種31kD大小的Kunitz 型絲氨酸蛋白酶抑制劑，分泌到細胞外基質(zhì)（ECM）中，被認為是一種抑癌基因。因為TFPI-2可抑制血纖維蛋白溶解酶的活性，參與基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）的激活[2]，調(diào)控ECM的降解和腫瘤細胞浸潤。大部分惡性腫瘤，例如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、肝細胞癌TFPI-2表達下調(diào)。在細胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或通過融合腺病毒導(dǎo)入TFPI-2后，可降低了癌細胞的浸潤性[3]，但目前，還沒有研究觀察TFPI-2恢復(fù)表達、高表達以及去甲基化對肺癌所造成的影響。

5-氮雜-2’-脫氧胞苷（5-Aza-dC）可能通過使甲基化后的抑癌基因再次活化[7-10]。5-Aza-dC作為治療惡性腫瘤的去甲基化藥物已被美國食品藥品管理局批準[11]。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺癌細胞系A(chǔ)549、NCI-H520及正常肺細胞系細胞均購自上海拜力生物科技有限公司。使用購自美國FBS公司的濃度為10%的胎牛血清培養(yǎng)基（Thermo fisher, 美國）。DNA提取以及修飾試劑盒購自TOYOBO，從Takara公司購買Taq DNA聚合酶，dNTPs。引物由大連寶生生物工程有限公司合成。RNA提取，RT-PCR試劑盒均購自TOYOBO。

1.2 細胞培養(yǎng)以及分組藥物處理 對照組：同期培養(yǎng)不加藥培養(yǎng)96h，只換液；A549、NCI-H520細胞株分別分為藥物1組：將濃度為1×10-7mol/L的5-Aza-dC加入到DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)96h；藥物2組：將濃度為5×10-7mol/L的5-Aza-dC加入到DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)96h；藥物3組：將濃度為1×10-6mol/L的5-Aza-dC加入到DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)96h。

1.3 甲基化特異性PCR 引物為，F(xiàn)：5′-TTTCGTATAAA GCGGGTATTC-3′，R: 5′-ACGACCCGCTAATCAAAACG-3’，非甲基化：F：5′-GGATGTTTG TTTTGTATA-3′；R：5′-AAA CATCCAAAAAAACACCTAAC-3′。反應(yīng)控制條件為：20min 95℃；30s 94℃；30s 52℃；45s 72℃循環(huán)40次后在72℃保溫10min，以100V的電壓進行40min的電泳，進行成像。

1.4 RT-PCR定量檢測 TFPI-2引物：F：5’-CAGAATT CTATGGACCCCGCTCGCCCC-3’;R:5’-CAGTCGACTTAAAATTGCTTCTTCCG-3’，以β-action作為內(nèi)參。以100V的電壓進行40min的電泳，在成像系統(tǒng)中進行成像并攝像，對比表達強度。

1.6 Western blot分析各細胞中TFPI-2蛋白表達 對各組中TFPI-2蛋白表達水平進行測定。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 本次研究采用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件包進行納入與分析，所計量資料采用“x±s”表示，采用ANOVA并t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 肺癌細胞系細胞TFPI-2基因甲基化影響 未處理的A549和NCI-H520細胞中TFPI-2表現(xiàn)出完全甲基化特異性。而經(jīng)過5-Aza-dC處理過的肺癌細胞系細胞則表現(xiàn)出不完全甲基化狀態(tài)，并呈現(xiàn)出量效關(guān)系。見圖1。

2.2 肺癌細胞系細胞TFPI-2基因mRNA表達對比 A549和NCI-H520細胞在經(jīng)5-Aza-dC處理后TFPI-2基因mRNA表達均明顯高于未處理組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；并呈現(xiàn)出量效關(guān)系。見表1。

圖1 5-Aza-dC不同濃度對肺癌系細胞處理對TFPI-2甲基化水平的作用

表1 肺癌細胞系細胞TFPI-2基因mRNA表達對比（x±s，倍）

3 討論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展涉及多種機制，包括細胞增殖和凋亡，細胞遷移和浸潤。在這個過程中包含了ECM被一系列的諸如MMP 蛋白酶的降解。在胰腺癌、食管癌、鼻咽癌、前列腺癌中發(fā)現(xiàn)TFPI-2的表達能夠抑制腫瘤細胞的增殖。一些研究對其機制進行了研究[9]，發(fā)現(xiàn)TFPI-2可降低了細胞的增殖能力，將細胞阻斷在G1/S期，這同細胞周期依賴的激酶抑制因子p15和p27有關(guān)。p27（通過調(diào)控CDK2將細胞阻斷在G1/S期）在細胞周期中的調(diào)控作用，例如在胰腺癌和纖維肉瘤中，都已經(jīng)有報道[10]。有研究通過腺病毒，將p27轉(zhuǎn)入NSCLC細胞中，使細胞停滯在G1/S期，并抑制了裸鼠移植瘤的增長。說明p27的低表達同病人預(yù)后差有關(guān)，在NSCLC中，p27表達高，病人生存期長。這也是TFPI-2腫瘤制效應(yīng)的機制之一[11]。腫瘤細胞的浸潤和進展也需要ECM降解，主要是通過蛋白酶，特別是MMP。研究報道[12]，TFPI-2是一種MMP活性的抑制因子，主要通過抑制纖溶酶來抑制MMP-1、-2、-3、-9。另外，除直接抑制外，TFPI-2也抑制MMP-1和-3的表達，來抑制腫瘤的增殖。SCLC手術(shù)切除標本稀少，主要是支氣管鏡和縱隔鏡檢查標本，因此僅僅夠用于免疫組織化學(xué)分析。

TFPI-2是一種潛在的血纖維蛋白溶解酶抑制因子，可以通過激活MMPs參與腫瘤進展的蛋白酶，因此，TFPI-2是一種潛在的腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的抑制因子。在諸如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、肝細胞癌、非小細胞肺癌的惡性腫瘤中低表達。TFPI-2作為一種抑癌基因，基因啟動子區(qū)甲基化發(fā)生率明顯高于正常肺組織，且能抑制TFPI-2基因的表達，可促進肺癌的發(fā)生發(fā)展。我們前期研究亦表明TFPI-2基因在非小細胞肺癌中呈低表達，基因甲基化與該基因表達沉默以及下降存在密不可分的相關(guān)性，并且其與TNM和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間呈負相關(guān)性。因此TFPI-2的表達與肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其基因啟動子區(qū)CpG島高甲基化是TFPI-2低表達的可能機制之一，對于腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移具有促進作用。那么，通過去甲基化治療可促進肺癌TFPI-2基因表達，可能是肺癌治療的新方向，可作為肺癌基因治療的新靶點。

通過基因檢測后發(fā)現(xiàn)TFPI-2基因在染色體7q22上，此種蛋白是一種較絲氨酸蛋白酶跟家具有抑制纖溶酶作用，并可以對多種蛋白酶起到抑制性作用。腫瘤的轉(zhuǎn)移以及侵襲主要是通過使細胞外基質(zhì)（ECM）降低來實現(xiàn)，而對ECMT的降解FPI-2具有抑制性的作用，由于此種機制使得腫瘤的生長得到控制，并對腫瘤細胞的浸潤以及轉(zhuǎn)移起到抑制性的作用[12]。

本次研究發(fā)現(xiàn)5-Aza-dC對肺癌細胞系細胞的甲基化具有一定的抑制性作用，同時還發(fā)現(xiàn)5-Aza-dC存在劑量依賴性。

[1] Jemal A,Siegel R,Ward E,et al.Cancer Statistics,2009[J].CA Cancer J Clin,2009,59(4):225-249.

[2] Crivaux M,Zureik M,Marsal L,et al.Five year survival for lung cancer patients managed in general hospital[J].Rev Mal Respir,2011,28(7):31-38.

[3] Makale M.Cellular mechanobiology and cancer metastasis[J].Birth Defects Res C Embryo Today,2007,81(4):329-343.

[4] Etzioni R,Urban N,Ramsey S,et al.The case for early detection[J].Nat Rev Cancer,2003,3(4):243-252.

[5] Novik KL,Nimmrich I,Genc B,et al.Epigenomics:genome-wide study of methylation phenomena[J].Curr Issues Mol Biol,2002,4(4):111-128.

[6] Herman JG,Baylin SB.Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation[J].N Engl J Med,2003,349(21):2042-2054.

[7] Pinto A，Zagonel V.5-Aza-2’deoxycytidine and 5-Aza-cytidine in the treatment of acute myeloid leukemias and myelodysplastic syndromes:past,present,and future trends[J].Leukemia,1993,1:51-60.

[8] Kantarjian H,Oki Y,Garcia-manero G,et al.Results of a randomized study of 3 schedules of low-dose decitabine in higher-risk myelodysplastic syndrome and chronic myelomonocutic leukemia[J]. Blood,2007,109(1):52-57.

[9] Yang AS.Doshi KD,choi SW，et al.DNA methylation changes after 5-Aza-2’-deoxycytidine therapy in patients with leukemia[J].Cancer Res,2006,66(10):5495-5503.

[10] Mund C,Hackanson B,Stresemann C,et al.Characterization of DNA demethylation effects induced by 5-Aza-2’-deoxycytidine in patients with myelodysplastic syndrome[J].Cancer Res,2005,65(16):7086-7090.

[11] Issa JP,Kantarjian HM,Kirkpatrick P.Azacitidine[J].Nat Rev Drug Discov,2005,4(4):275-276.

[12] Du X，Chand HS，Kisiel W．Human tissue factor pathway inhibitor-2 does not bind or inhibit activated matrix metalloproteinase-1[J]．Biochim Biophys Acta，2003，1621(3):242-245．

Objective To study the effect of 5-Aza-dC on the methylation of lung cancer cell lines. Methods Quantitative detection of A549, NCI-H520 methylation specific PCR and RT-PCR in normal lung cells and 5-Aza-dC group. Results TFPI-2 in untreated A549 and NCI-H520 cells showed complete methylation specificity. The 5-Aza-dC treated lung cancer cell lines showed incomplete methylation status, and showed a dose effect relationship. After 5-Aza-dC treatment, A549 and NCI-H520 cells were significantly higher than the untreated group, the difference was statistically significant (P＜0.05), and showed a dose effect relationship. Conclusion 5-Aza-dC has a role in the methylation of TFPI-2 gene in lung cancer cells, and has dose effect relationship.

5-Aza-dC；TFPI-2；Methylation；A549；NCI-H520

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.29.006

江西 330006 江西省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科 （童波 梁瑩 吳西雅肖祖克 周洪 郭玲玲） 333200 婺源縣人民醫(yī)院內(nèi)二科 （鐘進生）

梁瑩 E-mail：anlixia002@163.com