宋　敏，李清林，孫定平，鞏彥龍，劉　濤，柴居堂，董萬濤

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅蘭州　730000；2. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅蘭州　730000)

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3種椎動脈型頸椎病大鼠模型的建立與評價(jià)

宋敏1，李清林1，孫定平1，鞏彥龍1，劉濤1，柴居堂2，董萬濤2

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅蘭州730000；2. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅蘭州730000)

摘要：目的通過對3種椎動脈型頸椎病(CSA)模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力、焦慮抑郁度及神經(jīng)精神緊張度的測定，對CSA大鼠造模方法進(jìn)行比較和評價(jià)。方法將120只大鼠隨機(jī)分為混合造模組、植骨壓迫造模組、力學(xué)平衡失調(diào)造模組和空白對照組，每組30只，通過Morris水迷宮、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)及曠場實(shí)驗(yàn)對大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力、焦慮抑郁度及神經(jīng)精神緊張度進(jìn)行檢測和比較，對3種CSA大鼠模型進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果與空白對照組比較，混合造模組、植骨壓迫造模組及力學(xué)平衡失調(diào)造模組的大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降,焦慮抑郁度及神經(jīng)精神緊張度明顯增高(P<0.05)；與植骨壓迫造模組及力學(xué)平衡失調(diào)造模組比較，混合造模組能更好的還原CSA發(fā)病特征。結(jié)論3種造模方法均可以成功復(fù)制CSA動物模型，其中混合造模法更為優(yōu)異，值得推廣。

關(guān)鍵詞：混合造模法；椎動脈型頸椎病；造模評價(jià)

椎動脈型頸椎病(cervical spondylosis of vertebral artery type, CSA)是頸椎病的常見類型之一，占頸椎病的10%～15%[1-2]，臨床主要表現(xiàn)為眩暈、緊張多慮、視覺異常、植物神經(jīng)功能紊亂及抑郁、記憶力減退、睡眠障礙等精神癥狀，嚴(yán)重者甚至發(fā)生猝倒、暈厥[3]。既往實(shí)驗(yàn)研究中，涉及大鼠的CSA經(jīng)典造模方法有植骨壓迫造模法和力學(xué)平衡失調(diào)法[4-5]。本研究在既往研究的基礎(chǔ)上，提出混合造模法，并與經(jīng)典造模法進(jìn)行比較，通過對大鼠學(xué)習(xí)記憶、焦慮抑郁及神經(jīng)精神三種行為學(xué)指標(biāo)的觀測對比，以確證混合造模法所致CSA大鼠模型的實(shí)驗(yàn)價(jià)值，為CSA的后續(xù)治療研究提供更適宜的動物模型。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物6月齡SPF級健康Wistar雄性大鼠120只，體質(zhì)量(300±20)g(生產(chǎn)許可證號為SCXK(甘)2011-0001)，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。動物購進(jìn)后安靜狀態(tài)下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飲水飼料充足，光照節(jié)律12L/12D(7∶00～19∶00)，溫度(23±2)℃，相對濕度(50±10)%。

1.2主要實(shí)驗(yàn)儀器Morris水迷宮及動物行為視頻分析系統(tǒng)、高架十字迷宮及動物行為分析系統(tǒng)、曠場實(shí)驗(yàn)及分析系統(tǒng)等。

1.3分組造模適應(yīng)期后將所有大鼠隨機(jī)分為植骨壓迫造模組、力學(xué)平衡失調(diào)造模組、混合造模組和空白對照組，每組30只。

1.3.1植骨壓迫造模組0.6 g/L水合氯醛按1.0 mg/kg行大鼠腹腔注射麻醉，頸部脫毛、消毒后，取頸背部正中縱形切口(自寰枕關(guān)節(jié)至T2處)，開放右側(cè)頸部肌肉，分離C5、C6椎體前方頸長肌，顯露椎體及其橫突的前方，切除橫突間骨翼，分離椎動脈內(nèi)側(cè)的骨膜至椎體后方，將5 mm長，1.5 mm×1.5 mm×1.5 mm的骨塊植入骨膜下間隙，逐層縫合椎體前方筋膜及組織，最后縫合肌肉，防止骨塊前移，形成右側(cè)頸椎失穩(wěn)。止血滿意后縫合切口，碘伏消毒，外敷消毒紗布保護(hù)，術(shù)后給予青霉素抗感染治療，單鼠單籠飼養(yǎng)。

1.3.2力學(xué)平衡失調(diào)造模組麻醉方法同上。頸部脫毛、消毒后，取頸背部正中縱形切口(自寰枕關(guān)節(jié)至T2處)，切開皮膚及皮下筋膜組織，分離切除左側(cè)頸闊肌，再分別鈍性分離切除左側(cè)頸斜方肌、頸部夾肌、頭頸菱形肌、最長肌、頸髂肋肌及半棘肌，切斷頸闊肌，頭、頸、寰最長肌，頸骼肋肌和頭半棘肌，并切除(5±2.5)mm以免斷端愈合，逐層縫合，形成左側(cè)肌力失衡。術(shù)后處理同上。

1.3.3混合造模組處理方法采取合并植骨壓迫造模組、力學(xué)平衡失調(diào)造模組法，開放頸部后，左側(cè)采取力學(xué)平衡失調(diào)法處理，右側(cè)采取植骨壓迫法處理。術(shù)后處理同上。

1.3.4空白對照組不做任何處理。所有動物術(shù)后適應(yīng)性喂養(yǎng)2周，第3周開始進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.4測量指標(biāo)及方法

1.4.1學(xué)習(xí)記憶能力檢測采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。 包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。定位航行實(shí)驗(yàn)歷時(shí)3 d，每天訓(xùn)練3次，每次訓(xùn)練2 min。在安靜的環(huán)境下，每次隨機(jī)選擇一個(gè)象限讓大鼠入水，大鼠入水時(shí)面向池壁，找到隱藏平臺后立即停止試驗(yàn)。記錄大鼠從開始入水到找到并爬上平臺的時(shí)間即逃避潛伏期，以檢測大鼠的空間學(xué)習(xí)能力。若大鼠在2 min內(nèi)找不到平臺，則記錄其逃避潛伏期為120 s。待第3天的定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后即進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)：將平臺去掉，將大鼠任選一象限入水，時(shí)間2 min，記錄大鼠2 min內(nèi)在平臺所在象限停留的時(shí)間和穿越原平臺所在位置次數(shù)，以檢測大鼠的空間記憶能力。120 s后大鼠還找不到平臺的，引導(dǎo)其到平臺上休息60 s，記錄每只大鼠每次找到平臺的時(shí)間和游泳距離以及游泳速度，取四個(gè)象限平均值為該次實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)每天進(jìn)行4次，持續(xù)5 d。

1.4.2焦慮抑郁度檢測采用高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)。 在安靜的環(huán)境下，將大鼠從中央格面向閉合臂放入迷宮，觀察指標(biāo)包括：進(jìn)入開放臂次數(shù)，開放臂停留時(shí)間，進(jìn)入閉合臂次數(shù)，閉合臂停留時(shí)間。計(jì)算開放臂停留時(shí)間比例，開放臂進(jìn)入次數(shù)比例，高架十字迷宮中總進(jìn)入次數(shù)。記錄5 min內(nèi)的活動情況，實(shí)驗(yàn)完成后將小鼠取出，將兩臂清理干凈，噴灑酒精除去氣味，最后用Xeye動物行為學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。進(jìn)入開放臂次數(shù)及停留時(shí)間與大鼠的焦慮情緒成負(fù)相關(guān)，進(jìn)入開放臂次數(shù)越少，停留時(shí)間越短，說明大鼠的焦慮情緒越嚴(yán)重。

1.4.3神經(jīng)精神緊張度檢測采用曠場實(shí)驗(yàn)。 在安靜的環(huán)境下，將動物放入箱內(nèi)底面中心，開始攝像，記錄時(shí)間5 min。記錄指標(biāo)包括：中央格停留時(shí)間，肢體越過的格子總數(shù)，后肢站立次數(shù)，修飾次數(shù)，總運(yùn)動距離，沿邊運(yùn)動距離，中央運(yùn)動距離等。每只大鼠測定結(jié)束后，清洗方箱內(nèi)壁及底面，以免上次動物余留的信息(如動物的大、小便、氣味)影響下次測試結(jié)果。

2結(jié)果

2.14組大鼠脫落情況各組大鼠造模術(shù)后因麻醉或感染出現(xiàn)脫落情況比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。

表14組大鼠術(shù)后脫落情況比較

Tab.1Comparison of the four groups of rats after the operation

組別總數(shù)脫落數(shù)脫落比例(%)植骨壓迫造模組30310.00力學(xué)平衡失調(diào)造模組3026.67混合造模組30516.67空白對照組300 0

經(jīng)Fisher確切概率法χ2檢驗(yàn)，P>0.05。

2.2Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果4組大鼠7 d內(nèi)學(xué)習(xí)記憶數(shù)據(jù)分析顯示，從第1天到第7天，同一組大鼠在不同時(shí)間段學(xué)習(xí)記憶能力均值的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨時(shí)間延長，學(xué)習(xí)時(shí)間變短，記憶能力增強(qiáng)(P<0.01)；不同組之間學(xué)習(xí)記憶能力比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

2.3高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果大鼠進(jìn)入中央?yún)^(qū)、開放臂區(qū)的次數(shù)比較：混合造模組明顯少于其他3組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；植骨壓迫造模組、力學(xué)平衡失調(diào)造模組與空白對照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.05)；植骨壓迫造模組與力學(xué)平衡失調(diào)造模組對比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。進(jìn)入封閉臂區(qū)次數(shù)比較：混合造模組、植骨壓迫造模組、力學(xué)平衡失調(diào)造模組大鼠與空白對照組對比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

混合造模組大鼠在中央?yún)^(qū)及開放臂區(qū)停留時(shí)間均低于空白對照組及植骨壓迫造模組、力學(xué)平衡失調(diào)造模組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；在封閉臂區(qū)的停留時(shí)間明顯多于空白對照組及植骨壓迫造模組、力學(xué)平衡失調(diào)造模組(P<0.05，P<0.01)；植骨壓迫造模組和力學(xué)平衡失調(diào)造模組在中央?yún)^(qū)及開放臂區(qū)停留時(shí)間少于空白對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.05)，在封閉臂區(qū)停留時(shí)間明顯多于空白對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表3)。

表24組大鼠Morris實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)記憶能力比較

Tab.2Comparison of the learning and memory ability of four groups of rats tested with Morris water maze

±s; s)

與混合造模組比較，*P<0.05，**P<0.01；與空白對照組比較，△P<0.05。

表34組大鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

Tab.3Comparison of experimental results of the four groups of rats in the elevated plus maze

±s)

與混合造模組比較，*P<0.01；與空白對照組比較，△P<0.05。

2.4曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果混合造模組大鼠在站立次數(shù)、跨格數(shù)、修飾次數(shù)、運(yùn)動總距離、沿邊運(yùn)動距離及中央運(yùn)動距離分別與其他3組比較，均顯著減少 (P<0.05，P<0.01)；植骨壓迫造模組、力學(xué)平衡失調(diào)造模組與空白對照組比較亦明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.05，表4)。

3討論

動物模型的建立是實(shí)驗(yàn)研究以及臨床研究的基礎(chǔ)，能夠較好的復(fù)制動物模型是促進(jìn)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)發(fā)展，更好的指導(dǎo)臨床研究的保證。本課題組在分析探究以往CSA動物造模的基礎(chǔ)上，大膽提出混合造模法，以期追求造模的成功率，較高程度的復(fù)制CSA臨床癥狀特點(diǎn)，基本符合臨床發(fā)病條件。

表44組大鼠礦場實(shí)驗(yàn)自主探究行為比較

Tab.4The comparison of independent search in field experiments in the four groups

±s)

與混合造模組比較，*P<0.01；與空白對照組比較，△P<0.05。

研究指出[6-8]，CSA發(fā)病與神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫(NEI)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)有密切關(guān)系，發(fā)病過程中，頸椎退行性變引起鉤椎關(guān)節(jié)骨質(zhì)增生、小關(guān)節(jié)移位、頸部肌肉痙攣、頸交感神經(jīng)興奮/抑制等，造成椎-基底動脈系統(tǒng)缺血及顱內(nèi)供血障礙[9]，激惹NEI調(diào)控機(jī)制，使機(jī)體發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，出現(xiàn)眩暈、頭痛、視物模糊、記憶力下降等癥狀[10]。本研究結(jié)合CSA的發(fā)病機(jī)制，采取離斷大鼠部分頸部肌肉并在一側(cè)骨膜下壓迫植骨的混合造模方法，模擬出頸椎退行性變的假象，構(gòu)建椎-基底動脈缺血、神經(jīng)細(xì)胞變性凋亡、組織慢性缺血缺氧、血管微循環(huán)紊亂的CSA發(fā)病條件，以最大可能的模仿CSA臨床發(fā)病機(jī)制。造模后，大鼠的病理狀態(tài)雖然與人有一定差距，但疾病所致的行為學(xué)等與人相似，同時(shí)還存在復(fù)雜的神經(jīng)內(nèi)分泌改變[11-13]。

CSA臨床主要表現(xiàn)為眩暈、眼花、記憶力下降、焦慮等，而Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)及曠場實(shí)驗(yàn)三種實(shí)驗(yàn)方法是針對CSA發(fā)病特點(diǎn)設(shè)計(jì)的檢測方法。Morris水迷宮用于研究與空間學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的腦區(qū)功能評價(jià)，在世界上已經(jīng)得到廣泛的認(rèn)可，是行為學(xué)研究尤其是學(xué)習(xí)與記憶研究的首選經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Morris水迷宮對造模后的大鼠記憶能力進(jìn)行測評，結(jié)果表明4組大鼠7 d內(nèi)學(xué)習(xí)記憶能力有明顯差異，并且隨時(shí)間延長，學(xué)習(xí)記憶能力逐漸增強(qiáng)，但混合造模組較其他三組記憶力明顯減退，說明混合造模組大鼠出現(xiàn)記憶力下降，符合CSA發(fā)病特點(diǎn)。高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)是利用嚙齒動物被放入高架十字迷宮后會主動探究開臂，但又懼怕開臂中高懸敞開的環(huán)境，由此形成的矛盾沖突狀態(tài)，常用于焦慮研究。該實(shí)驗(yàn)采用視頻跟蹤技術(shù)完成了高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)的自動化和定量化，結(jié)果更加真實(shí)、可信、客觀，重復(fù)性好。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，混合造模組與其他三組比較，大鼠探究能力明顯下降，說明造模組大鼠焦慮抑郁較明顯。曠場實(shí)驗(yàn)是觀察評價(jià)實(shí)驗(yàn)動物神經(jīng)精神緊張度的一種實(shí)驗(yàn)方法。CSA發(fā)病的特點(diǎn)之一是緊張多慮、神經(jīng)紊亂，本實(shí)驗(yàn)采用曠場實(shí)驗(yàn)方法，檢測動物造模后神經(jīng)精神緊張度。結(jié)果表明混合造模組大鼠各種行為指標(biāo)明顯低于其他3組，說明混合造模組大鼠較其他3組大鼠精神更加緊張。

對3種造模方法進(jìn)行比較研究顯示，混合造模法、力學(xué)平衡失調(diào)造模法及植骨壓迫造模法制備的CSA模型大鼠在學(xué)習(xí)記憶能力、焦慮抑郁度和神經(jīng)精神緊張度等方面明顯優(yōu)于空白對照組，說明3組大鼠在造模后其行為學(xué)基本符合CSA臨床發(fā)病特點(diǎn)；而混合造模組CSA大鼠在學(xué)習(xí)記憶能力、焦慮抑郁度以及神經(jīng)精神緊張度三個(gè)方面明顯優(yōu)于力學(xué)平衡失調(diào)造模組和植骨壓迫造模組，說明混合造模組相對于其他兩組能更好的還原CSA發(fā)病特征，驗(yàn)證了本課題組提出的CSA大鼠混合造模法符合CSA動物造模要求。

目前CSA造模方法較多，哪種模型能更好地模擬CSA臨床病理機(jī)制尚不清楚，因此，應(yīng)把動物模型的研究和臨床實(shí)際結(jié)合起來，這樣動物模型的研究才更具有意義。在動物造模過程中應(yīng)綜合考慮多種因素：①動物品系和數(shù)量的確定；②動物隨機(jī)和對照原則的體現(xiàn)；③合理的模型評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)；④中西醫(yī)結(jié)合模擬CSA動物模型[14]。CSA是臨床多發(fā)性疾病，深入研究具有重要的意義，混合造模方法雖然可以模擬出CSA發(fā)病狀態(tài)，但能否完全模擬臨床CSA發(fā)生機(jī)制尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。本課題組將在此研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步從細(xì)胞及分子水平解釋CSA混合造模方法，不斷的豐富CSA造模理論，推動CSA病理機(jī)制和防治研究的發(fā)展。

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(編輯邱芬)

Establishment and evaluation of three kinds of cervical spondylosis of vertebral artery type rat model

SONG Min1, LI Qing-lin1, SUN Ding-ping1, GONG Yan-long1,LIU Tao1, CHAI Ju-tang2, DONG Wan-tao2

(1. Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000; 2. the Affiliated Hospital of Gansu University of TCM, Lanzhou 730000, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo compare and evaluate the methods of building model of cervical spondylosis of vertebral artery type (CSA) rats by measuring the learning and memory ability, anxiety and depression, and degree of nervous tension of three kinds of CSA model rats. MethodsWe randomly divided 120 rats into mixed modeling group, bone graft compression modeling group, mechanical balance disorder modeling group, and blank control group with 30 rats in each. Morris water maze, elevated plus maze test and open field test were used to detect and compare the rats’ abilities of learning and memory, anxiety and depression, and degree of nervous tension. We then evaluated the three CSA rat models. ResultsCompared with those in the blank group, the learning and memory abilities in the mixed modeling, bone graft compression and mechanical balance disorder modeling rats were significantly decreased, the anxiety and depression and degree of nervous tension were significantly increased (P<0.05). Compared with bone graft compression and mechanical balance disorder modeling groups, the mixed modeling group could restore the characteristics of CSA. ConclusionThe three kinds of modeling methods can successfully reproduce the CSA animal model; the mixed modeling is superior and thus worthy of promotion.

KEY WORDS:hybrid modeling method; cervical spondylosis of vertebral artery type; modeling evaluation

收稿日期：2015-09-29修回日期：2015-12-07

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81360554)；甘肅省重點(diǎn)中醫(yī)藥科研立項(xiàng)課題(No.GZK-2010-Z14)；甘肅省中藥現(xiàn)代制藥工程研究院項(xiàng)目開發(fā)(No.2305083306)；甘肅省高等學(xué)校研究生導(dǎo)師科研項(xiàng)目(No.1206-01)

通訊作者：李清林. E-mail: qinglin27@126.com

中圖分類號：R681.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI:10.7652/jdyxb201603032

◇技術(shù)方法研究◇

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81360554), the Key Chinese Medicine Research Project of Gansu Province (No.GZK-2010-Z14), the Project Development of the Modern Pharmaceutical Engineering Research Institute of Chinese Medicine in Gansu Province (No.2305083306), and the Research Project of Graduate Students’ Advisor in Colleges and Universities of Gansu Province (No.1206-01)

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160419.0951.002.html(2016-04-19)