王　琛，孟　哲，馬艷秋，李　澤，陶海龍，白中樂(lè)，李　凌

(1. 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，河南鄭州　450052；2. 河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州　450052)

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◇中醫(yī)藥研究◇

姜黃素對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖及氧化應(yīng)激的影響

王琛1,2，孟哲1，馬艷秋1，李澤1，陶海龍1，白中樂(lè)1，李凌1

(1. 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，河南鄭州450052；2. 河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州450052)

摘要：目的觀察姜黃素(curcumin, Cur)對(duì)血管緊張素Ⅱ(AngII)誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)增殖及氧化應(yīng)激的影響。方法原代培養(yǎng)大鼠VSMCs細(xì)胞，MTT法測(cè)定不同濃度Cur對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs增殖的影響。并分別設(shè)對(duì)照組、AngⅡ干預(yù)組、20 μmol/L Cur組及AngⅡ聯(lián)用不同濃度Cur(5、10、20 μmol/L)組，實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot測(cè)定各組細(xì)胞誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、p47phox mRNA與蛋白的表達(dá)；亞硝酸鹽含量重氮化反應(yīng)吸光測(cè)定法(Greiss assay)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)一氧化氮(NO)的表達(dá)；DCFH-DA氧化法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)含量；黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)各試驗(yàn)組細(xì)胞上清液中超氧化物歧化酶(SOD)活性；分光光度計(jì)檢測(cè)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Gpx)活性。采用p47phox特異性siRNA干擾VSMCs p47phox的表達(dá)，并深入探討Cur抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs增殖及氧化應(yīng)激的機(jī)制。結(jié)果MTT法觀察到Cur在0～80 μmol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞活力無(wú)顯著影響；Cur(5、10、20 μmol/L)可以有效抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs增殖。同時(shí)，Cur可有效抑制AngⅡ誘導(dǎo)的NO、iNOS、p47phox、ROS的高表達(dá)并有效提高SOD和Gpx的活性，且具有濃度依賴性。采用p47phox特異性siRNA下調(diào)p47phox表達(dá)，AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs內(nèi)ROS生成減少。結(jié)論Cur具有抑制AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs的增殖及氧化應(yīng)激作用。這一作用與減少iNOS誘導(dǎo)的NO合成，下調(diào)p47phox的表達(dá)抑制ROS產(chǎn)生、提高SOD和Gpx的活性，進(jìn)而抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：姜黃素(Cur)；血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)；細(xì)胞增殖；氧化應(yīng)激；活性氧；超氧化物歧化酶(SOD)；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Gpx)；血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)；siRNA

近年來(lái)伴隨生活方式的改變，動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclorosis, AS)的發(fā)病率逐年上升，已成為引發(fā)心腦血管疾病的重要病理基礎(chǔ)。研究表明，氧化應(yīng)激(oxidative stress, OS)是AS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要促進(jìn)因素之一。OS主要通過(guò)氧化修飾作用，誘導(dǎo)血管基因表達(dá)、促進(jìn)局部炎癥反應(yīng)和細(xì)胞增殖，從多方面參與AS的發(fā)生發(fā)展[1-2]。OS是指機(jī)體在遭受各種有害刺激時(shí)，組織內(nèi)部活性氧族(reactive oxygen species, ROS)的生成速率大于清除速率而在體內(nèi)蓄積的狀態(tài)。當(dāng)ROS的生成大于清除時(shí)，過(guò)多的ROS堆積會(huì)直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，并誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)遷移、增殖和基質(zhì)成分過(guò)表達(dá)加重AS病變進(jìn)展[3]。生物體本身具有清除多余自由基的能力，主要靠?jī)?nèi)源性自由基清除系統(tǒng)，包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase, Gpx)和過(guò)氧化氫酶(catalase, CAT)等一些抗氧化劑。

姜黃素(curcumin, Cur)是從姜科草本植物姜黃根莖中提取的一種天然多酚類物質(zhì)，具有廣泛的藥理作用。姜黃的研究歷史悠久，其味辛、苦、性溫，入肝脾二經(jīng)，是一味常用的中藥并具有抗氧化、降血脂、抗癌等作用?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證實(shí)，Cur具有抗增殖、抗氧化和清除氧自由基、抗炎等多種藥理學(xué)作用，并具有顯著的心血管保護(hù)活性[4]。近年來(lái)流行病學(xué)調(diào)查顯示，Cur的攝入量與AS的發(fā)病呈負(fù)相關(guān)[5]。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察姜黃素對(duì)血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, AngⅡ)誘導(dǎo)的VSMCs增殖及OS反應(yīng)的影響，以期為Cur抗AS的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥品及試劑雄性SD大鼠，體質(zhì)量150～180 g，購(gòu)于鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。DMEM高糖培養(yǎng)液(Gibco公司，美國(guó))；姜黃素(Sigma公司，美國(guó)，純度為99%)；使用二甲基亞砜(DMSO)將姜黃素制成高濃度儲(chǔ)存液，再根據(jù)工作濃度，使用無(wú)血清DMEM高糖培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋；青霉素、鏈霉素、胎牛血清、噻唑藍(lán)(MTT)及實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(Sigma公司，美國(guó))，p47phox，iNOS以及β-actin多克隆抗體(Santa Cruze公司)；DCFH-DA活性氧測(cè)定試劑盒(碧云天生物公司，北京)；SOD及Gpx活性測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，南京)。

1.2VSMCs原代培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組300 g/L水合氯醛腹腔麻醉大鼠，快速分離胸主動(dòng)脈，仔細(xì)剝離血管內(nèi)膜及外膜，剪碎至1～2 mm3大小的組織塊，使用貼壁法培養(yǎng)。將細(xì)胞置于含200 mL/L胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，其中含有100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的鏈霉素，然后放入37 ℃、50 mL/L CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。使用相差顯微鏡對(duì)VSMCs進(jìn)行形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)鑒定。取第3～6代細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

將VSMCs分為6組：A組(對(duì)照組)、B組(AngⅡ干預(yù)組)、C組(AngⅡ+5 μmol/L Cur)、D組(AngⅡ+10 μmol/L Cur)、E組(AngⅡ+20 μmol/L Cur)、F組(2 μmol/L Cur)。以上B～E組AngⅡ的濃度均為10-7mol/L。

1.3MTT比色法測(cè)定不同濃度Cur對(duì)VSMCs增殖的影響將細(xì)胞以6×104個(gè)/孔接種于96孔板，按照前述細(xì)胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)24 h，改用2 mL/L低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，分別給予0、2.5、5、10、20、40、80 μmol/L Cur或10-7mol/L AngⅡ孵育24 h后，采用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活力。

給予VSMCs 5、10、20 μmol/L Cur預(yù)處理1 h后，10-7mol/L的AngⅡ孵育72 h。吸取培養(yǎng)液，每孔加入MTT(5 mg/mL)20 μL，37 ℃孵育4 h，棄去上清，每孔加入DMSO 100 μL，微微振蕩數(shù)次后，用自動(dòng)酶標(biāo)儀于490 nm處測(cè)定各組吸光度(A)值。

1.4實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各組VSMCs iNOS和p47phox mRNA的表達(dá)將各組細(xì)胞以5×106個(gè)/孔接種于6孔板中，加入含血清培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到70%～80%融合時(shí)，改用無(wú)血清培養(yǎng)基孵育12 h，換用不同濃度姜黃素預(yù)處理1 h，再給予10-7mol/L的AngⅡ刺激細(xì)胞6 h，按照說(shuō)明書(shū)使用Transzol(TransGen公司，北京)提取各組總RNA。使用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TransGen公司，北京)操作步驟，將各組mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用Premier 7.0軟件設(shè)計(jì)Real-time PCR引物，序列如表1示。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。使用Bio-Rad IQ7熒光PCR儀自帶分析軟件對(duì)Real-time PCR結(jié)果進(jìn)行分析。

表1Real-time PCR引物

Tab.1Primers used for Real-time PCR

基因上游引物(5'～3')下游引物(5'～3')p47phoxGAGACATACCTGACGGCCAAAGAAGTCAGCGATGGCCCGATAGiNOSCCACGCTCTTCTGTCTACTGAACACGGGCTTGTCACTCGAGGADPHATCGGCAATGAGCGGTTCCAGCACTGTGTTGGCATAGAGG

1.5Western blot檢測(cè)iNOS與p47phox的表達(dá)將細(xì)胞以5×106個(gè)/孔接種于6孔板中，加入含血清培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%～90%融合時(shí)，改用無(wú)血清培養(yǎng)基孵育12 h。換用不同濃度姜黃素?zé)o血清培養(yǎng)孵育1 h后，加入10-7mol/L的AngⅡ刺激細(xì)胞12 h。每孔使用150 μL RIPA裂解液提取蛋白。BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定各組樣品蛋白濃度。加入蛋白上樣緩沖液并煮沸后，制作100 g/L SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜。一抗?jié)舛葹閕NOS(1∶500)、p47phox (1∶400)和β-actin (1∶2 000)。以β-actin作為內(nèi)參照?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)，圖像采集，Quantity one軟件進(jìn)行圖像分析。

1.6血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)活性氧物質(zhì)(ROS)水平的測(cè)定將各組細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種于96孔板中，不同濃度姜黃素(5、10、20 μmol/L)預(yù)處理1 h，再給予10-7mol/L的AngⅡ刺激，30 min后嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟，用DCFH-DA對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS進(jìn)行熒光標(biāo)記。流式細(xì)胞儀檢測(cè)每組細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度，激發(fā)光波長(zhǎng)為485 nm，檢測(cè)波長(zhǎng)528 nm。

1.7硝酸還原酶法測(cè)定培養(yǎng)液中NO含量細(xì)胞以12×106個(gè)/孔接種于12孔板，孵育過(guò)夜。各組給予相應(yīng)處理后，分別取細(xì)胞上清液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法，722分光光度計(jì)550 nm處比色，測(cè)定各組細(xì)胞上清中NO含量，所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)6次。

1.8SOD和Gpx活性的測(cè)定收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清，BCA法檢測(cè)上清液蛋白濃度。按試劑盒說(shuō)明書(shū)方法和操作要求，黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)細(xì)胞上清中SOD活性，使用分光光度計(jì)法檢測(cè)Gpx活性。

2結(jié)果

2.1不同濃度Cur對(duì)VSMCs細(xì)胞活力及增殖的影響給予VSMCs 0～80 μmol/L Cur或10-7mol/L AngⅡ刺激24 h后，細(xì)胞活力未有明顯改變(圖1A)。10-7mol/L AngⅡ刺激VSMCs 72 h，VSMCs增殖增強(qiáng)。給予不同濃度(5、10、20 μmol/L)預(yù)處理1 h，能夠有效抑制AngⅡ引起的VSMCs增殖；僅給予VSMCs 20 μmol/L Cur刺激72 h，細(xì)胞增殖不受影響(圖1B)。

圖1不同濃度Cur對(duì)VSMCs細(xì)胞活力及增殖的影響

Fig.1 Effect of different concentrations of Cur on the vitality and proliferation of VSMCs

A：給予VSMCs不同濃度Cur和AngⅡ(10-7mol/L)孵育24 h，MTT法測(cè)定各組細(xì)胞活力；B：給予VSMCs不同濃度Cur和AngⅡ(10-7mol/L)孵育72 h，MTT法測(cè)定各組細(xì)胞增殖。與對(duì)照組相比，#P<0.001；與AngⅡ組相比，*P<0.05，***P<0.001。

2.2Cur對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs NO合成及iNOS表達(dá)的影響給予VSMCs 10-7mol/L AngⅡ刺激24 h，NO合成增加。而Cur能夠有效抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs內(nèi)NO合成，并呈濃度依賴性(圖2A)。給予VSMCs 10-7mol/L AngⅡ刺激3 h，iNOS蛋白及mRNA表達(dá)水平升高(P<0.01)；使用不同濃度Cur預(yù)處理1 h，再給予同濃度AngⅡ刺激3 h，iNOS蛋白和mRNA的表達(dá)水平降低(P<0.05)。僅給予VSMCs Cur(20 μmol/L)刺激3 h，不影響iNOS蛋白和mRNA表達(dá)(P>0.05)(圖2B、2C)。

圖2Cur對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs NO合成及iNOS表達(dá)的影響

Fig.2 Effect of Cur on AngⅡ-induced NO production and expression of iNOS in VSMCs

A：NO水平變化；B：Western blot檢測(cè)iNOS表達(dá)變化；C：Real-time PCR檢測(cè)iNOS mRNA表達(dá)變化。與對(duì)照組相比，#P<0.001；與AngⅡ組相比，**P<0.01，***P<0.001。

2.3Cur對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs NADPH氧化酶/ROS信號(hào)通路的影響給予VSMCs 10-7mol/L AngⅡ刺激24 h后，VSMCs內(nèi)ROS含量升高(圖3A)。給予不同濃度Cur預(yù)處理1 h，能夠有效抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs內(nèi)ROS合成，并呈濃度依賴性(P<0.05，圖3A)。目前，NADPH氧化酶被認(rèn)為是VSMCs內(nèi)ROS生成的主要來(lái)源，p47phox是構(gòu)成NADPH氧化酶中重要亞基。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Cur能夠濃度依賴性下調(diào)AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs內(nèi)p47phox蛋白和mRNA的表達(dá)(P<0.05)(圖3B、3C)。與對(duì)照組相比，僅給予20 μmol/L Cur處理VSMCs對(duì)p47phox蛋白和mRNA表達(dá)無(wú)明顯影響(P>0.05，圖3B)。

進(jìn)一步用p47phox特異性siRNA下調(diào)p47phox表達(dá)，結(jié)果顯示，伴隨p47phox的蛋白和mRNA表達(dá)水平降低，VSMCs內(nèi)ROS生成亦減少(圖3C、3D)。因此，Cur可能通過(guò)抑制p47phox表達(dá)，進(jìn)而抑制NADPH氧化酶介導(dǎo)的VSMCs內(nèi)ROS生成，起到抗氧化作用。

2.4Cur對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs SOD及Gpx活性的影響給予VSMCs 10-7mol/L AngⅡ刺激24 h后，VSMCs內(nèi)SOD、Gpx活性明顯降低。給予不同濃度姜黃素預(yù)處理1 h后，SOD及Gpx活性升高，并呈劑量依賴性(圖4A、4B)。結(jié)果提示，Cur可能通過(guò)提高VSMCs內(nèi)活性氧清除酶活性，減少活性氧生成，起到抗氧化保護(hù)作用。

3討論

AS是誘發(fā)心腦血管疾病的主要病理學(xué)改變。目前認(rèn)為，VSMCs的異常增殖在AS病變的形成過(guò)程中起到重要作用[6]。因此，不少學(xué)者相信，有效抑制VSMCs的活化及增殖可能是防治AS發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。AngⅡ作為腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system, RAS)的重要功能因子，可以通過(guò)自分泌和旁分泌方式作用于VSMCs，刺激VSMCs增殖，且具有劑量依賴性[7]。因此，阻斷AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs異常增殖可能成為預(yù)防AS發(fā)生、發(fā)展的治療靶點(diǎn)。研究表明，Cur能夠抑制多種細(xì)胞類型(如肝星狀細(xì)胞、肺成纖維細(xì)胞、胰腺星狀細(xì)胞)增殖，從而可預(yù)防早期器官纖維化的形成和發(fā)展[8]。之前的研究大多集中在各種因素誘導(dǎo)的肝臟纖維化過(guò)程，而在本研究中，我們聚焦于Cur在心血管系統(tǒng)中的作用。結(jié)果表明，Cur能夠濃度依賴性地抑制AngⅡ誘導(dǎo)的 VSMCs增殖，提示該藥在心血管系統(tǒng)亦具有一定程度的抗增殖效應(yīng)。

近年研究發(fā)現(xiàn)，生理劑量的NO具有調(diào)節(jié)血壓、擴(kuò)張血管、抑制血小板聚集和白細(xì)胞粘附、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用。通過(guò)上述多重生理學(xué)效應(yīng)，NO在防止心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展方面發(fā)揮重要的保護(hù)作用[9]。NOS是合成NO的限速酶，對(duì)NO的生成具有重要的影響。NOS主要包含神經(jīng)型(neuronal NOS, nNOS)、內(nèi)皮型(endothellial NOS, eNOS)和誘導(dǎo)型(inducible NOS, iNOS)3個(gè)成員。在某些炎癥介質(zhì)如內(nèi)毒素脂多糖(LPS)，細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)等作用下，iNOS合成明顯增加，誘導(dǎo)高濃度NO合成，進(jìn)而導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化、細(xì)胞壞死，釋放更多的炎癥介質(zhì)，形成惡性循環(huán)[9]。據(jù)此可知，較高濃度NO可能是AS的促進(jìn)因素。本研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ刺激VSMCs能夠誘導(dǎo)iNOS表達(dá)顯著增高，并上調(diào)NO合成。Cur能夠劑量依賴性抑制iNOS mRNA和蛋白表達(dá)，進(jìn)而減少AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞內(nèi)NO生成。據(jù)此有理由推斷，Cur可能通過(guò)下調(diào)iNOS的表達(dá)，減少NO的合成，達(dá)到延緩AS進(jìn)展的心血管保護(hù)作用。

研究表明，許多AS相關(guān)危險(xiǎn)因素，如糖尿病、高血壓、高血脂、肥胖及吸煙等都會(huì)誘導(dǎo)VSMCs內(nèi)ROS的過(guò)多合成[10]。高濃度ROS直接或間接地?fù)p傷細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化、細(xì)胞器功能異常。目前，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，OS反應(yīng)與AS發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[11]。NADPH作為參與VSMCs ROS合成的重要限速酶，參與了AS的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。有研究表明，AngⅡ是激活NADPH氧化酶的最主要刺激因子之一，可通過(guò)與血管緊張素Ⅰ型受體(AT1-R)結(jié)合，激活NADPH氧化酶，促進(jìn)ROS產(chǎn)生，使OS增加，這是AS、糖尿病、高脂血癥、高血壓的共同發(fā)病機(jī)制之一[12]。NADPH氧化酶介導(dǎo)的ROS生成受到NADPH氧化酶的活性及其亞基表達(dá)的精確調(diào)控。p47phox作為NADPH氧化酶復(fù)合體的一種構(gòu)成亞基，為NADPH氧化酶激活的必需參與者。因此，p47phox mRNA和蛋白的變化可在一定程度上反映NADPH氧化酶的活性。在本研究中發(fā)現(xiàn)，給予VSMCs AngⅡ刺激后，伴隨ROS生成增加，p47phox蛋白和mRNA表達(dá)也隨之升高，這與之前文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)論一致。提示，NADPH氧化酶可能是AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs內(nèi)ROS生成的重要參與者。最近有研究表明，Cur能夠有效抑制LPS誘導(dǎo)的VSMCs NADPH氧化酶介導(dǎo)的ROS生成[13]。但尚未見(jiàn)報(bào)道表明，Cur能否影響AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs NADPH氧化酶激活及ROS生成。在本研究中，給予VSMCs Cur預(yù)處理，能夠顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的p47phox mRNA和蛋白表達(dá)，并減少ROS生成。為了更好地闡明NADPH氧化酶激活在AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs內(nèi)ROS生成中的作用，我們采用p47phox特異性siRNA對(duì)VSMCs的p47phox進(jìn)行基因沉默。結(jié)果顯示，隨著NADPH氧化酶活性降低，VSMCs內(nèi)ROS水平顯著降低。據(jù)此，有理由相信Cur可能通過(guò)減少p47phox表達(dá)，下調(diào)NADPH氧化酶活性，進(jìn)而抑制AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs內(nèi)ROS生成。

圖3 Cur對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCsNADPH氧化酶/ROS信號(hào)通路的影響Fig.3EffectofCuronAngⅡ-inducedNADPH/ROSsignalingpathwayinVSMCsA:ROS的變化;B:Westernblot檢測(cè)p47phox蛋白表達(dá)變化;C:p47phoxsiRNA對(duì)VSMCsp47phox蛋白表達(dá)的影響;D:p47phoxsiRNA對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs內(nèi)ROS生成的影響。與對(duì)照組相比,#P<0.001;與AngⅡ組相比,*P<0.05,***P<0.001;與p47phoxsiRNA組相比,△P<0.05。

圖4Cur對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs SOD及Gpx活性的影響

Fig.4 Effect of Cur on AngⅡ-induced activity of SOD and Gpx in VSMCs

A：SOD活性變化；B：Gpx活性變化。與對(duì)照組相比，#P<0.001；與AngⅡ組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

SOD、Gpx和CAT等抗氧化酶在機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)中發(fā)揮著極其重要的作用，其含量水平能夠一定程度上反映機(jī)體抗氧化能力。在細(xì)胞內(nèi)，SOD是抵抗ROS損害的第一道防線。SOD是機(jī)體內(nèi)主要的超氧自由基清除劑，其活性高低代表了組織清除自由基的能力。如果SOD活性不足或含量降低，細(xì)胞就會(huì)受到氧自由基的攻擊，誘發(fā)細(xì)胞損傷[14]。Gpx是體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過(guò)氧化物分解酶，能夠特異性的催化谷胱甘肽(glutathione, GSH)對(duì)過(guò)氧化物的還原反應(yīng)，起到清除過(guò)氧化物代謝產(chǎn)物，阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化連鎖反應(yīng)的抗AS心血管保護(hù)作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，給予VSMCs AngⅡ刺激后，SOD和Gpx含量顯著降低；使用Cur預(yù)處理能夠有效逆轉(zhuǎn)AngⅡ誘導(dǎo)的SOD和Gpx含量減少。結(jié)果提示，Cur可能通過(guò)增強(qiáng)VSMCs內(nèi)抗氧化酶活性，拮抗AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs內(nèi)OS反應(yīng)，進(jìn)而起到一定程度的抗AS作用。

綜上所述，Cur可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs增殖；下調(diào)iNOS mRNA和蛋白表達(dá)，減少VSMCs內(nèi)NO合成；通過(guò)抑制NADPH氧化酶活性降低ROS生成和提高SOD和Gpx活性，進(jìn)而影響AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs OS過(guò)程。這為Cur應(yīng)用于AS的防治提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(編輯國(guó)榮)

Curcumin inhibits AngⅡ-induced proliferation and oxidative stress in vascular smooth muscle cells

WANG Chen1,2, MENG Zhe1, MA Yan-qiu1, LI Ze1,TAO Hai-long1, BAI Zhong-le1, LI Ling1

(1. Department of Cardiology, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450052; 2. Institute of Clinical Medicine, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450002, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the effect of curcumin (Cur) on AngⅡ-induced proliferation and oxidative stress of vascular smooth muscle cells (VSMCs). MethodsPrimary rat VSMCs were cultured and divided into control group, AngⅡ group, AngⅡ+Cur 5 μmol/L group, AngⅡ+Cur 10 μmol/L group, AngⅡ+Cur 20 μmol/L group, and Cur 20 μmol/L group. The proliferation of AngⅡ-induced VSMCs was measured by MTT assay. The mRNA and protein expressions of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and p47phox were detected by real-time PCR and Western blot. Nitric oxide (NO) production was measured by Griess reaction. Production of intracellular reactive oxygen species (ROS) was measured by DCFH-DA staining, and the activities of superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (Gpx) were detected by xanthine oxidase assay and visible spectrophotometer. small interfering RNA (siRNA) was used to silence the expression of p47phox to further explore the mechanism for Cur inhibiting the proliferation of AngⅡ-induced VSMCs and oxidative stress. ResultsVSMCs activities were not significantly affected by Cur at the concentration between 0 and 80 μmol/L. Cur (5, 10 and 20 μmol/L) significantly inhibited AngⅡ-induced proliferation of VSMCs. Cur had an inhibitory effect on the overexpression of NO, iNOS, p47phox and ROS in VSMCs and upregulated the activities of SOD and Gpx in a concentration-dependent manner. AngⅡ-induced ROS production in VSMCs was significantly attenuated by pretreatment with p47phox specific siRNA. ConclusionCur can inhibit the proliferation and oxidative stress of AngⅡ-induced VSMCs.

KEY WORDS:curcumin (Cur); vascular smooth muscle cells (VSMCs); cell proliferation; oxidative stress; reactive oxygen species (ROS); superoxide dismutase (SOD); glutathione peroxidase (Gpx); angiotensin Ⅱ (AngⅡ); siRNA

收稿日期：2015-07-19修回日期：2015-11-19

基金項(xiàng)目：鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院青年基金資助項(xiàng)目(No.YFFAHZZ2013020105)

通訊作者：李凌. E-mail: liling_03202178@163.com. 王琛、孟哲為共同第一作者.

中圖分類號(hào)：R285；R54

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI:10.7652/jdyxb201603029

Supported by the Youth Foundation of the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University (No.YFFAHZZ2013020105)

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160411.1103.018.html(2016-04-11)