楊　波，張衛(wèi)東，李小飛，王　榮，李建忠，李曉平，李明江，杜洪印，姜　濤

(1. 天津市第一中心醫(yī)院胸外科，天津　300192；2. 第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院胸外科，陜西西安　710038；3. 西安交通大學(xué)航天航空學(xué)院，陜西西安　710049；4. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心血管外科，黑龍江哈爾濱　150001；5. 天津市第一中心醫(yī)院麻醉科，天津　300192)

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◇基礎(chǔ)研究◇

大劑量鹽酸氨溴索對(duì)大鼠肺缺血再灌注損傷后的肺保護(hù)機(jī)制

楊波1，張衛(wèi)東1，李小飛2，王榮3，李建忠4，李曉平1，李明江1，杜洪印5，姜濤2

(1. 天津市第一中心醫(yī)院胸外科，天津300192；2. 第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院胸外科，陜西西安710038；3. 西安交通大學(xué)航天航空學(xué)院，陜西西安710049；4. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心血管外科，黑龍江哈爾濱150001；5. 天津市第一中心醫(yī)院麻醉科，天津300192)

摘要：目的探討大劑量鹽酸氨溴索對(duì)大鼠肺缺血再灌注損傷后肺的保護(hù)作用以及可能的作用機(jī)制。方法將健康雄性SD大鼠60只隨機(jī)分成4組：對(duì)照組、氨溴索組、肺缺血再灌注(I/R)組、I/R+氨溴索組，每組15只。造模前分別給予大劑量氨溴索組和I/R+氨溴索組靜脈注射鹽酸氨溴索0.75 g/L，分別給予對(duì)照組和I/R組注射與上述氨溴索治療量等容量的生理鹽水。觀察肺組織病理學(xué)改變并評(píng)分，檢測濕干重比值(W/D)、白介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、細(xì)胞凋亡數(shù)目、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)，Western blot方法觀察大鼠肺組織Toll樣蛋白4(Toll-like receptor 4, TLR4)信號(hào)通路的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與對(duì)照組相比，I/R組肺泡壁增寬，肺泡腔內(nèi)可見出血等炎癥表現(xiàn)，W/D、炎癥因子顯著升高，肺組織W/D、IL-1β、TNF-α、凋亡細(xì)胞、NF-κB活性和TLR4信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平明顯升高；與(I/R)組相比，I/R+氨溴索組肺泡腔內(nèi)出血、水腫等炎癥表現(xiàn)減輕，W/D、炎癥因子、凋亡細(xì)胞顯著降低，肺組織NF-κB轉(zhuǎn)錄活性及TLR4信號(hào)通路表達(dá)水平明顯降低。結(jié)論大劑量鹽酸氨溴索通過下調(diào)TLR4信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)缺血再灌注損傷大鼠的肺保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：大劑量鹽酸氨溴索；肺缺血再灌注損傷；肺保護(hù)；Toll樣蛋白受體4(TLR4)

隨著肺移植、心臟手術(shù)、心肺腦復(fù)蘇以及血栓溶栓治療的深入研究，肺缺血再灌注損傷(LIRI)及其所導(dǎo)致的肺功能障礙的發(fā)生機(jī)制和防治受到人們的高度重視。LIRI仍然是導(dǎo)致早期高發(fā)病率和晚期高死亡率最重要的原因[1-2]。大量臨床實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，鹽酸氨溴索大劑量應(yīng)用時(shí)可對(duì)肺臟發(fā)揮抗炎、抗氧化等保護(hù)作用[3-5]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)先給予大劑量鹽酸氨溴索對(duì)大鼠肺移植術(shù)后急性肺損傷有重要的保護(hù)作用，而其具體機(jī)制尚不清楚[3]。本實(shí)驗(yàn)擬進(jìn)一步探討大劑量鹽酸氨溴索對(duì)大鼠LIRI后的肺保護(hù)作用，以及對(duì)Toll樣蛋白4/核轉(zhuǎn)錄因子-κB信號(hào)通路的影響，以期為其臨床應(yīng)用提供更多的基礎(chǔ)理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康的成年SD大鼠60只，均為雄性，由第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，體質(zhì)量200～230 g。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器及試劑電熱恒溫干燥箱(北京科偉永興儀器有限公司)，顯微鏡(德國徠卡公司)，Western-blot蛋白電泳儀(Bio-Rad公司)，鹽酸氨溴索(勃林格殷格翰公司)，兔抗大鼠TLR4抗體(美國CST公司)，兔抗大鼠NF-κBp65抗體(美國CST公司)，兔抗大鼠β-actin抗體(美國CST公司)，免疫組化試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司)，BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，ELISA試劑盒(上海通蔚生物科技有限公司)，TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.3方法

1.3.1動(dòng)物模型的建立、分組及給藥健康成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、氨溴索組、I/R組和I/R+氨溴索組，每組15只。氨溴索組和I/R+氨溴索組在造模型前30 min給予靜脈注射鹽酸氨溴索0.75 g/L，對(duì)照組和I/R組則注射與上述治療量等容量的生理鹽水。腹腔注射10 g/L戊巴比妥40 mg/kg麻醉后，將大鼠仰臥固定于手術(shù)板上，經(jīng)口氣管插管，并連接呼吸機(jī)，呼吸機(jī)輔助通O2(60%)，最高峰壓在10 cm H2O，最大呼氣末壓力為2 cm H2O，呼吸頻率60次/min，呼吸比2∶3，潮氣量為9 mL，這些參數(shù)可以排除其他原因?qū)е碌募毙苑螕p傷[2,6]。胸部備皮常規(guī)消毒后鋪巾，無菌條件下取左側(cè)第4肋間前外側(cè)切口入胸腔，分離肌層，剪開胸膜,游離左肺門，尾靜脈注射肝素50單位，混合鹽水總體積500 μL，待5 min后肝素開始發(fā)揮作用時(shí)，以無創(chuàng)傷動(dòng)脈夾夾閉肺門處血管，縫合切口，60 min后經(jīng)原切口進(jìn)胸，取出動(dòng)脈夾，恢復(fù)血供，形成缺血再灌注。對(duì)照組全麻后方法同上，但不需夾閉肺門。

1.3.2肺組織濕/干重比值(W/D)立即獲取樣本右肺上葉稱濕重后70 ℃電熱恒溫干燥箱中烤24 h后為干重，計(jì)算肺組織W/D。

1.3.3大鼠缺血再灌注損傷肺組織的HE染色右肺中葉經(jīng)過固定、包埋、切片、染色，光鏡下觀察各組肺組織病理學(xué)變化。

1.3.4ELISA對(duì)大鼠缺血再灌注損傷炎癥因子的檢測麻醉處死大鼠，結(jié)扎肺門，支氣管肺泡灌洗液(BALF)收集大鼠炎癥因子，在4 ℃下灌洗液離心(1 000 r/min)5 min后取上清。根據(jù)產(chǎn)品說明書進(jìn)行BCA蛋白定量。通過ELISA試劑盒檢測IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平。

1.3.5TUNEL對(duì)大鼠缺血再灌注損傷凋亡細(xì)胞的檢測樣本經(jīng)過二甲苯脫蠟、梯度乙醇、不含DNase的蛋白酶K和TUNEL檢測液孵育，最后用抗熒光淬滅封片液封片。隨意選取鏡下10個(gè)視野(×100)，分別計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)，根據(jù)公式凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)計(jì)算凋亡指數(shù)(AI)。

1.3.6免疫組化對(duì)大鼠缺血再灌注損傷NF-κBp65的檢測常規(guī)石蠟切片依次經(jīng)過二甲苯、梯度乙醇脫蠟至水后，3 mol/L尿素消化，檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)進(jìn)行抗原修復(fù)，新鮮配置30 mL/L H2O2封閉，滴加血清封閉液30 min，甩去血清，加一抗NF-κBp65(1∶150)，4 ℃冰箱孵育過夜，37 ℃復(fù)溫，滴加試劑B(生物素標(biāo)記二抗)室溫37 ℃孵育45 min，PBS沖洗，試劑C(親和素)室溫37 ℃孵育40 min。滴加新鮮配制的DAB顯色液避光顯色，8 min后中止顯色，水洗，再以蘇木素染色，依次經(jīng)乙醇梯度脫水、二甲苯透明及中性樹膠封片。設(shè)置空白對(duì)照以PBS代替一抗，其余步驟同上。

1.3.7Western blot對(duì)大鼠TLR4/NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平的檢測肺組織加入細(xì)胞裂解液、充分勻漿，于4 ℃離心后，用BCA法進(jìn)行蛋白定量，加上樣緩沖液并煮沸5 min，上樣10 μL，進(jìn)行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。滴加50 g/L脫脂奶封閉1 h后，分別滴加兔抗大鼠TLR4抗體、phospho-IκBα抗體NF-κBp65抗體以及β-actin抗體(室溫封閉1 h)及辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(室溫封閉1 h)。滴加ECL反應(yīng)混合液，置入儀器觀察結(jié)果，分析灰度值。

2結(jié)果

2.1大劑量鹽酸氨溴索對(duì)大鼠肺組織W/D的影響與對(duì)照組(4.2±0.2)及氨溴索組(4.1±0.1)相比，I/R

組(7.4±0.3)肺組織W/D明顯升高，而I/R+氨溴索組(5.5±0.1)肺組織W/D明顯降低(P<0.05，圖1)。

圖1肺缺血再灌注損傷后大鼠肺組織濕干重比值(W/D)

與對(duì)照組及氨溴索組比較，*P<0.05。

2.2各組大鼠肺組織的病理學(xué)變化對(duì)照組和氨溴索組大鼠肺組織小葉結(jié)構(gòu)清晰，肺泡腔內(nèi)無明顯滲出，肺泡間質(zhì)無明顯炎性浸潤，肺泡壁無明顯增厚；而I/R組大鼠肺泡壁增寬，肺泡間質(zhì)有炎性浸潤，肺泡腔內(nèi)可見大量出血和滲出等炎癥表現(xiàn)；I/R+氨溴索組大鼠肺泡壁明顯變薄，肺泡腔內(nèi)出血量減少，炎性滲出減少(圖2)。

2.3大劑量鹽酸氨溴索對(duì)LIRI大鼠IL-1β和TNF-α炎癥因子的影響大鼠LIRI后，IL-1β和TNF-α炎癥因子的水平明顯升高;大劑量鹽酸氨溴索能顯著降低IL-1β和TNF-α炎癥因子的表達(dá)水平(表1)。

圖2各組大鼠肺組織的病理學(xué)變化

Fig.2 Effect of ambroxol hydrochloride on pulmonary histopathologic changes of rats (HE, ×200)

A：對(duì)照組；B：氨溴索組；C：I/R組；D：I/R+氨溴索組。

表1ELISA檢測缺血再灌注損傷后大鼠IL-1β和TNF-α水平的變化

Tab.1 Effect of ambroxol hydrochloride on the expressions of IL-1β and TNF-α in BALF

±s, n=15)

與對(duì)照組及氨溴索組比較，*P<0.05。

2.4鹽酸羥考酮注射液對(duì)大鼠損傷肺組織凋亡細(xì)胞的影響TUNEL染色顯示，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光，I/R組凋亡指數(shù)為(31.22±2.04)%，與對(duì)照組[(1.27±0.58)%]和氨溴索組[(1.13±0.59)%]相比，凋亡細(xì)胞指數(shù)明顯升高；I/R+氨溴索組[(20.03±0.41)%]凋亡細(xì)胞指數(shù)顯著下降(P<0.05)。

2.5大劑量鹽酸氨溴索對(duì)大鼠NF-κBp65活性的影響肺組織NF-κBp65蛋白在對(duì)照組與氨溴索組胞質(zhì)、胞核中幾乎無表達(dá)。與對(duì)照組相比較，I/R組NF-κBp65蛋白在胞質(zhì)和胞核中表達(dá)量明顯增多，處于活化狀態(tài)；而I/R+氨溴索組NF-κBp65蛋白在胞質(zhì)和胞核中表達(dá)量相對(duì)減少(圖3)。

圖3各組大鼠肺組織NF-κBp65的免疫組化結(jié)果

Fig.3 Expression of NF-κBp65 of lung tissues of rats with LIRI detected by Immunohistochemistry (×400)

A：對(duì)照組；B：氨溴索組；C：I/R組；D：I/R+氨溴索組。

2.6各組肺組織TLR4/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平對(duì)照組與氨溴索組中TLR4信號(hào)通路相關(guān)蛋白幾乎無明顯變化；I/R組中肺組織TLR4、phospho-IκBα以及NF-κBp65DNA binding的表達(dá)水平顯著增高(P<0.05)；而I/R+鹽酸氨溴索組上述信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平相對(duì)降低(P<0.05，表2)。

表2Western blot檢測TLR4/NF-κB信號(hào)通路的蛋白含量

Tab.2Effect of ambroxol hydrochloride on the expression of TLR4/NF-κB signaling protein in lung tissues of rats with LIRI

±s，n=15)

與對(duì)照組及氨溴索組比較，*P<0.05，#P<0.05。

3討論

自1983年后，隨著現(xiàn)代外科的發(fā)展，盡管臟器的保存、外科手術(shù)操作和圍手術(shù)期處理有了很大的改進(jìn)，但缺血再灌注損傷被認(rèn)為是組織器官致傷的潛在重要因素，更是器官移植術(shù)后的常見并發(fā)癥[6-7]。進(jìn)一步加深LIRI發(fā)生發(fā)展機(jī)制的認(rèn)識(shí)以及針對(duì)損傷機(jī)制尋找新的醫(yī)療預(yù)防及治療思路是擺在臨床工作者面前亟待解決的難題。

TLR4是識(shí)別細(xì)菌脂多糖(LPS)、炎癥因子、活性氧的最主要受體，TLR4表達(dá)的水平?jīng)Q定著肺內(nèi)炎癥反應(yīng)的程度[8]。通過對(duì)TLR4-髓樣分化因子88(MyD88)的識(shí)別，使核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)活化，從而釋放大量細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)，最終導(dǎo)致肺損傷。研究還發(fā)現(xiàn)，SARS冠狀病毒及H5N1禽流感病毒產(chǎn)生的氧化磷脂類(OxPAPC)同樣是重要的直接致?lián)p因素，而OxPAPC也正是通過觸發(fā)TLR4而進(jìn)一步導(dǎo)致肺損傷的發(fā)生[9]。因此，在眾多致?lián)p因素導(dǎo)致肺損傷的機(jī)制中，TLR4通路都起到了關(guān)鍵作用。

已知TLR4/NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活是直接導(dǎo)致再灌注損傷的主要因素之一[8,10]。TLR4與MyD88樣銜接蛋白(MAL)聚集MyD88后，IL-1受體相關(guān)激酶 4 (IRAK4)與IL-1受體相關(guān)激酶1(IRAK1)在其下游聚集，IRAK1下游的腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)向下繼續(xù)作用在NF-κB激酶抑制物(IKK)α/β/γ復(fù)合物上，NF-κB被激活。激活后的NF-κB導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞及肺泡巨噬細(xì)胞釋放大量細(xì)胞因子及趨化因子，如IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8、單核細(xì)胞趨化因子1(MCP-1)與人生長調(diào)節(jié)致癌基因α(GROα)[11]。若能阻斷TLR4/NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路，調(diào)控炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展，可有效地減輕機(jī)體組織的損傷。

大劑量鹽酸氨溴索對(duì)LIRI的保護(hù)機(jī)制國內(nèi)外報(bào)道較少。延續(xù)前期課題，本課題組進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，I/R+鹽酸氨溴索可減輕大鼠肺水腫，減少細(xì)胞凋亡數(shù)目，降低IL-1β和TNF-α水平表達(dá)，同時(shí)抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄活性；Western blot檢測發(fā)現(xiàn)TLR4信號(hào)通路的相關(guān)蛋白表達(dá)水平顯著下降。表明大劑量鹽酸氨溴索可通過下調(diào)TLR4信號(hào)通路的表達(dá)，減少下游TRAF6作用于IKKα/β/γ復(fù)合物，從而抑制NF-κB的活化，最終緩解肺水腫、減輕炎癥反應(yīng)，發(fā)揮保護(hù)肺泡上皮細(xì)胞的作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)初步探討了大劑量應(yīng)用鹽酸氨溴索對(duì)大鼠LIRI具有顯著的保護(hù)作用，為肺損傷后的恢復(fù)創(chuàng)造了有利條件。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)TLR4/NF-κB信號(hào)通路可能作為鹽酸氨溴索發(fā)揮保護(hù)作用的靶向調(diào)控位點(diǎn)，這為研究其臨床藥物的靶向治療提供新的指導(dǎo)價(jià)值。

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(編輯卓選鵬)

Protective effect of large dose of ambroxol hydrochloride on lung ischemia-reperfusion injury in rats

YANG Bo1, ZHANG Wei-dong1, LI Xiao-fei2, WANG Rong3, LI Jian-zhong4,LI Xiao-ping1, LI Ming-jiang1, DU Hong-yin5, JIANG Tao2

(1. Department of Thoracic Surgery, Tianjin First Central Hospital, Tianjin 300192;2. Department of Thoracic Surgery, Tangdu Hospital of the Fourth Military Medical University,Xi’an 710038; 3. School of Aerospace, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710049;4. Department of Cardiovascular Surgery, the Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001; 5. Department of Anesthesiology,Tianjin First Central Hospital, Tianjin 300192, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo observe the effects of large-dose ambroxol hydrochloride on lung ischemia-reperfusion injury (LIRI) and discuss the protection of ambroxol hydrochloride on Toll-like receptor 4 (TLR4)/nuclear transcription factor-kappa B (NF-κB) after lung ischemia-reperfusion injury in rats. MethodsWe randomly assigned 60 healthy SD rats into four groups (n=15 for each): control group, ambroxol hydrochloride group (0.75 g/L), ischemia-reperfusion group (I/R), and I/R+ambroxol hydrochloride group. The ambroxol hydrochloride group and I/R+ambroxol hydrochloride group were injected large dose of ambroxol hydrochloride by intravenous injection. The control group and the I/R group received normal saline. The effects of ambroxol hydrochloride on lung ischemia-reperfusion (LIR)-induced pathological changes and inflammatory cytokines release level were examined. DNA ends situ labeling assay (TUNEL) was used to detect the apoptosis of cells. NF-κBp65 was detected by immunohistochemistry. In addition, the TLR4 signaling pathway activation in lung tissues was detected by Western blot analysis. ResultsCompared with those in the control group, some hemorrhage and inflammation changes of lung tissues were observed; the W/D ratio, inflammatory cytokines, apoptosis of cells, NF-κBp65 and TLR4 signaling pathway protein expression in I/R group was obviously increased. Compared with I/R group, some mild hemorrhage and inflammation changes of lung tissues were observed; W/D ratio, inflammatory cytokines, apoptosis of cells, NF-κBp65 activity, and TLR4 signaling pathway expression were all decreased significantly in I/R+ambroxol hydrochloride group. ConclusionLarge dose of ambroxol hydrochloride can protect rats with lung ischemia-reperfusion injury by downregulating TLR4 signaling pathway.

KEY WORDS:large dose of ambroxol hydrochloride; lung ischemia-reperfusion injury; lung protection; Toll-like receptor 4

收稿日期：2015-03-25修回日期：2015-12-24

基金資助：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81070062)；軍隊(duì)“十二五”課題(12MA208)

通訊作者：姜濤. E-mail: jiangtaochest@163.com；杜洪印. E-mail: duhongyin123@sina.com

中圖分類號(hào)：R655.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI:10.7652/jdyxb201603014

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81070062) and the Military Medical Scientific Research Items of China (12MA208)

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160411.1047.016.html(2016-04-11)