潘博宇，　王荷花，　張小驥，　黃　娟，　吳元欣，　陳孝平

武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院綠色化工過程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢　430073

?

甘草酸、甘草苷對腫瘤細(xì)胞中硫氧還蛋白的核定位影響及其臨床意義*

潘博宇，王荷花，張小驥，黃娟，吳元欣，陳孝平△

武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院綠色化工過程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430073

摘要：目的通過選用甘草的主要單藥活性成分作用于人宮頸癌HeLa細(xì)胞，探索其對硫氧還蛋白(thioredoxin-1，Trx)在腫瘤細(xì)胞核中定位的影響。方法選取甘草酸(glycyrrhizic acid，GCA)、甘草苷(liquiritin，LQ)兩種單藥分別設(shè)置藥物濃度梯度與作用時(shí)間梯度實(shí)驗(yàn)組。再將一定濃度的GCA、LQ分別與臨床化療藥物紫杉醇(paclitaxel，PTX)或表柔比星(epirubicin，EPI)兩兩聯(lián)用設(shè)置聯(lián)合用藥實(shí)驗(yàn)組。通過Western blot測定Trx在HeLa細(xì)胞核中表達(dá)量的變化，四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測藥物對HeLa細(xì)胞增殖抑制的影響。結(jié)果Trx在細(xì)胞核內(nèi)的含量變化均隨2種單藥濃度的增大和藥物作用時(shí)間的延長呈下降趨勢；GCA、LQ對細(xì)胞的毒性較小，且其與低劑量化療藥物聯(lián)用對細(xì)胞核中Trx表達(dá)量的影響，與單純高劑量化療藥物作用效果相近。結(jié)論GCA和LQ均可使Trx在HeLa細(xì)胞核中的表達(dá)下降，且其與臨床化療藥物聯(lián)用有望降低后者的使用劑量，從而表現(xiàn)出一定的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：甘草酸；甘草苷；硫氧還蛋白；腫瘤細(xì)胞；核定位

硫氧還蛋白(thioredoxin-1，Trx)是一類分布比較廣泛的小分子多功能蛋白，它在細(xì)胞凋亡及腫瘤細(xì)胞耐藥方面扮演著重要的角色。目前針對多種腫瘤細(xì)胞系的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Trx表達(dá)含量與腫瘤細(xì)胞耐藥方面存在某種正相關(guān)聯(lián)系[1-2]，即癌癥患者體內(nèi)Trx表達(dá)水平較高，其往往會對多種臨床抗癌藥物呈現(xiàn)出一定的耐藥性[3-4]。這主要是由于抗癌藥物作用于腫瘤細(xì)胞后，會使較多的Trx向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，從而使其能夠維持還原狀態(tài)，繼而通過增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子的活性保持細(xì)胞抗凋亡的特性[5-6]。因此Trx入核是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的關(guān)鍵因素，而抑制其入核可以作為腫瘤臨床治療的一種有效策略。

甘草(GlycyrrhizauralensisFisch)系多年生草本植物，是我國重要的傳統(tǒng)中藥材。甘草中的主要活性成分為皂苷類與黃酮類物質(zhì)，代表物分別是甘草酸(glycyrrhizic acid，GCA)和甘草苷(liquiritin，LQ)[7]。相關(guān)研究表明甘草中的有效成分具有體外抗腫瘤的活性，它對凋亡相關(guān)蛋白有重要作用[8]，但目前國內(nèi)外尚缺乏其對Trx作用的研究報(bào)道。本研究通過設(shè)置一系列藥物實(shí)驗(yàn)組，探索了甘草的主要單藥活性成分GCA和LQ對Trx在HeLa細(xì)胞核中的定位影響，旨在通過將低毒的中藥有效成分與化療藥物進(jìn)行聯(lián)用，從而降低后者的使用劑量，以期達(dá)到與單純高濃度化療藥物作用相近的效果，進(jìn)而減輕患者的不良反應(yīng)。

1材料與方法

1.1試劑與儀器

細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強(qiáng)型)、MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔源性抗Trx多克隆抗體、兔源性抗Histone-H3多克隆抗體、鼠源性抗β-actin單克隆抗體、過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)、過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；甘草酸(GCA，上海源葉生物科技有限公司，純度≥99%)；甘草苷(LQ，上海晶純生化科技股份有限公司，純度≥98%)；紫杉醇(PTX，?？谑兄扑帍S有限公司，5 mL 30 mg)；鹽酸表柔比星(EPI，輝瑞制藥無錫有限公司，5 mL 10 mg)。

主要儀器：CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(HF90/240型，力康生物醫(yī)療科技控股集團(tuán)公司)；蛋白質(zhì)電泳及轉(zhuǎn)膜裝置(Bio-Rad，美國)；高速冷凍離心機(jī)(HC-3018R型，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；倒置生物顯微鏡(奧特光學(xué)儀器有限公司)；酶標(biāo)測定儀(M2E/DE05665型，美谷分子儀器上海有限公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

人宮頸癌傳代細(xì)胞(HeLa)，由本實(shí)驗(yàn)室液氮儲藏罐冷凍保藏。HeLa細(xì)胞用DMEM高糖培養(yǎng)液，內(nèi)含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素(青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL)雙抗溶液，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組

1.3.1Western blot檢測分組①GCA/LQ用藥：實(shí)驗(yàn)分組情況詳見表1。②聯(lián)合用藥：將GCA和LQ分別與臨床化療藥物PTX或EPI進(jìn)行兩兩聯(lián)用，并設(shè)置相同作用時(shí)間(20 h，即：單藥先處理HeLa細(xì)胞10 h，再與化療藥物共處理10 h)，不同作用濃度(即：空白對照；高劑量化療藥物濃度A μg/mL；低劑量化療藥物濃度B μg/mL；低劑量化療藥物濃度B μg/mL+低劑量單藥濃度200 μg/mL；低劑量化療藥物濃度B μg/mL+高劑量單藥濃度600 μg/mL)。實(shí)驗(yàn)分組情況詳見表2。

表1　GCA/LQ實(shí)驗(yàn)組分組情況

表2　聯(lián)合用藥實(shí)驗(yàn)組分組情況

1.3.2MTT比色法檢測分組實(shí)驗(yàn)組將GCA和LQ分別與臨床化療藥物PTX或EPI進(jìn)行兩兩聯(lián)用，并設(shè)置相同作用時(shí)間(20 h，即：單藥先處理HeLa細(xì)胞10 h，再與化療藥物共處理10 h)，不同作用濃度(即：空白對照與溶媒陰性對照；高劑量單藥濃度1 000 μg/mL；高劑量化療藥物濃度A μg/mL；低劑量化療藥物濃度B μg/mL +高劑量單藥濃度1 000 μg/mL)。實(shí)驗(yàn)分組情況詳見表3。

表3　MTT檢測實(shí)驗(yàn)組分組情況

1.4Western blot法檢測Trx表達(dá)含量

將通過抽提得到并經(jīng)BCA蛋白濃度測定后的細(xì)胞核蛋白，進(jìn)行SDS-凝膠電泳，保證每孔蛋白絕對含量一致。積層膠電泳時(shí)電壓為60 V，進(jìn)入分離膠時(shí)電壓升至130 V。電泳結(jié)束后，根據(jù)預(yù)染Marker截取目的蛋白所在的凝膠片段。此后進(jìn)行200 mA恒流轉(zhuǎn)膜，洗膜封閉后，加入一抗4℃過夜。第2天洗膜后孵育二抗(37℃，1 h)，再洗膜30 min，進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光檢測。細(xì)胞核蛋白以兔源性抗Histone-H3多克隆抗體的檢測作為內(nèi)參對照。

1.5MTT比色法檢測細(xì)胞增殖抑制率

取對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞，以5.0×104個(gè)/mL的密度分別接種于96孔板中，而后按照表3中的分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。待作用于HeLa細(xì)胞20 h后(每個(gè)濃度點(diǎn)設(shè)7個(gè)復(fù)孔)，加入MTT工作液，孵育4 h后加入Formazan溶解液。至結(jié)晶完全溶解后，在酶標(biāo)測定儀上測定570 nm波長下各孔的吸光度(A)值。計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率[細(xì)胞增殖抑制率(%)=(對照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/對照組A值×100%]。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0軟件對所獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1GCA/LQ對Trx在HeLa細(xì)胞核定位的影響

隨著GCA、LQ濃度的增加，細(xì)胞核中Trx表達(dá)量均呈現(xiàn)依次減弱趨勢；并且當(dāng)2種單藥濃度同為200 μg/mL時(shí)，胞核中Trx表達(dá)量與空白組相比，其入核的情況幾乎被2種單藥所抑制(圖1)。另外，細(xì)胞核中Trx表達(dá)量亦隨GCA或LQ作用時(shí)間的延長呈逐漸下降趨勢(圖2)。

1：空白對照組；2：GCA/LQ 100 μg/mL組；3：GCA/LQ 200 μg/mL組圖1　Western blot檢測不同濃度GCA/LQ對Trx核內(nèi)表達(dá)影響Fig.1 Western blot analysis of the impact of different concentrations of GCA/LQ on Trx expression in the HeLa cell nuclei

1：空白對照組；2：GCA/LQ作用12 h組；3：GCA/LQ作用24 h組圖2　Western blot檢測不同作用時(shí)間下GCA/LQ對Trx核內(nèi)表達(dá)影響Fig.2 Western blot analysis of the impact of different action time of GCA/LQ on Trx expression in the HeLa cell nuclei

2.2聯(lián)合用藥對Trx在HeLa細(xì)胞核定位的作用

2.2.1PTX與GCA/LQ聯(lián)合用藥當(dāng)PTX濃度為60 μg/mL時(shí)，隨著GCA、LQ濃度增加，細(xì)胞核中Trx表達(dá)均呈逐漸下降趨勢；且當(dāng)?shù)蛣┝縋TX(60 μg/mL)聯(lián)合高劑量GCA或LQ(600 μg/mL)作用于HeLa細(xì)胞時(shí)，胞核中Trx的表達(dá)量，不僅較單純低劑量PTX(60 μg/mL)用藥組下降明顯，而且與單純高劑量PTX(120 μg/mL)用藥組相比，也呈現(xiàn)下降或處于相近水平(圖3)。

1：空白對照組；2：PTX高劑量組(120 μg/mL)；3：PTX低劑量組(60 μg/mL)；4：PTX低劑量組(60 μg/mL)+GCA/LQ低劑量組(200 μg/mL)；5：PTX低劑量組(60 μg/mL)+GCA/LQ高劑量組(600 μg/mL)圖3　Western blot檢測PTX聯(lián)合用藥實(shí)驗(yàn)組Trx核內(nèi)表達(dá)Fig.3 Western blot analysis of the impact of PTX combination therapy on Trx expression in the HeLa cell nuclei

2.2.2EPI與GCA/LQ聯(lián)合用藥當(dāng)EPI濃度為50 μg/mL時(shí)，隨著GCA、LQ藥物濃度增加，細(xì)胞核中Trx表達(dá)逐漸下降；且當(dāng)?shù)蛣┝縀PI(50 μg/mL)與高劑量GCA或LQ(600 μg/mL)聯(lián)合用藥時(shí)，與單純低劑量EPI(50 μg/mL)或單純高劑量EPI(200 μg/mL)用藥組相比，細(xì)胞核中Trx表達(dá)量均出現(xiàn)下降(圖4)。

1：空白對照組；2：EPI高劑量組(200 μg/mL)；3：EPI低劑量組(50 μg/mL)；4：EPI低劑量組(50 μg/mL)+GCA/LQ低劑量組(200 μg/mL)；5：EPI低劑量組(50 μg/mL)+GCA/LQ高劑量組(600 μg/mL)圖4　Western blot檢測EPI聯(lián)合用藥實(shí)驗(yàn)組Trx核內(nèi)表達(dá)Fig.4 Western blot analysis of the impact of EPI combination therapy on Trx expression in the HeLa cell nuclei

2.3聯(lián)合用藥對HeLa細(xì)胞增殖抑制作用

通過MTT法對聯(lián)合用藥實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，GCA、LQ兩種單藥作用HeLa細(xì)胞20 h，分別與單純高劑量化療藥物(PTX、EPI)和幾種聯(lián)合用藥情況相比，都對細(xì)胞的抑制較少(①②之間無明顯差異，P>0.05)，從而提示兩種單藥成分對于細(xì)胞的毒性相對較小。此外，幾種聯(lián)合用藥對HeLa細(xì)胞的抑制情況與單純高劑量化療藥物(PTX、EPI)作用結(jié)果相似(③④⑤之間亦無明顯差異，P>0.05)。上述結(jié)果提示由于聯(lián)合用藥會使Trx在HeLa細(xì)胞核中的表達(dá)出現(xiàn)明顯下降，因而在一定程度上降低了腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐受性(圖5、6)。

①：GCA；②：LQ；③：單純高劑量PTX；④：低劑量PTX與單藥GCA聯(lián)合；⑤：低劑量PTX與單藥LQ聯(lián)合圖5　PTX聯(lián)合實(shí)驗(yàn)對HeLa細(xì)胞增殖抑制率比較Fig.5 Effects of PTX combination therapy on cell proliferation rate

①：GCA；②：LQ；③：單純高劑量EPI；④：低劑量EPI與單藥GCA聯(lián)合；⑤：低劑量EPI與單藥LQ聯(lián)合圖6　EPI聯(lián)合實(shí)驗(yàn)對HeLa細(xì)胞增殖抑制率比較Fig.6 Effects of EPI combination therapy on cell proliferation rate

3討論

在正常人體血清中，Trx含量應(yīng)維持在10～80 ng/mL之間。但通過對許多癌癥患者血清檢測發(fā)現(xiàn)，其體內(nèi)Trx含量約為正常人的2倍甚至更高[9]。與此同時(shí)，免疫組織化學(xué)技術(shù)相關(guān)檢測結(jié)果也表明，在多種惡性腫瘤組織或細(xì)胞中，Trx的表達(dá)也存在明顯過量的問題[10]。由于Trx轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核會使多種腫瘤細(xì)胞系產(chǎn)生抗藥現(xiàn)象[6，11]，因此Trx入核是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的重要因素。尋找可抑制Trx核定位的藥物并與臨床化療藥物聯(lián)合使用，則有望抑制腫瘤細(xì)胞的耐藥性和加強(qiáng)腫瘤治療的效果。

甘草藥用的記錄始于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其具有低毒、較強(qiáng)的防癌抗癌生物活性特點(diǎn)和較高的藥用價(jià)值。因此本實(shí)驗(yàn)旨在研究其主要活性成分對Trx在HeLa細(xì)胞核中的定位影響及其治療應(yīng)用方面的價(jià)值。GCA、LQ的分組實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Trx在細(xì)胞核中的表達(dá)均隨2種單藥濃度的增大與藥物作用時(shí)間的延長呈現(xiàn)下降趨勢，從而提示2種單藥可抑制Trx入核，但具體相關(guān)機(jī)制目前不詳，有待進(jìn)一步研究。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)GCA、LQ對細(xì)胞的毒性較小，且它們分別與低劑量化療藥物聯(lián)用能夠顯著抑制Trx在細(xì)胞核中的水平，對細(xì)胞生長的抑制率也可達(dá)到單純高劑量化療藥物的效果。

綜上所述，GCA與LQ同臨床化療藥物聯(lián)合使用，可以加強(qiáng)腫瘤治療效果，其機(jī)制是GCA與LQ抑制了Trx在腫瘤細(xì)胞細(xì)胞核中的表達(dá)，從而降低了腫瘤細(xì)胞的耐藥性。

參考文獻(xiàn)

[1]Sun Y，Rigas B.The thioredoxin system mediates redox-induced cell death in human colon cancer cells：implications for the mechanism of action of anticancer agents[J].Cancer Res，2008，68(20)：8269-8277.

[2]Arai R J，Ogata F T，Batista W L，et al.Thioredoxin-1 promotes survival in cells exposed to S-nitrosoglutathione：Correlation with reduction of intracellular levels of nitrosothiols and up-regulation of the ERK1/2 MAP kinases[J].Toxicol Appl Pharmacol，2008，233(2)：227-237.

[3]Kim S J，Miyoshi Y，Taguchi T，et al.High thioredoxin expression is associated with resistance to docetaxel in primary breast cancer[J].Clin Cancer Res，2005，11(23)：8425-8430.

[4]Iwao K K，Matoba R，Ueno N，et al.Prediction of docetaxel response in human breast cancer by gene expression profiling[J].J Clin Oncol，2005，23(3)：422-431.

[5]Wei S J，Botero A，Hirota K，et al.Thioredoxin nuclear translocation and interaction with redox factor-1 activates the activator protein-1 transcription factor in response to ionizing radiation[J].Cancer Res，2000，60(23)：6688-6695.

[6]Shan W H，Zhong W X，Zhao R，et al.Thioredoxin-1 as a subcellular biomarker of redox imbalance in human prostate cancer progression[J].Free Radic Biol Med，2010，49(12)：2078-2087.

[7]楊式華，孔蘭芬，董勝強(qiáng)，等.UPLC同時(shí)測定甘草及甘草浸膏中的甘草苷和甘草酸[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19(17)：157-160.

[8]商瀟云，李鑫，于波，等.甘草提取物(GC-3)體外誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡及機(jī)制研究[J].中華臨床醫(yī)師雜志，2013，7(23)：10798-10801.

[9]Burke-Gaffney A，Callister M E，Nakarnura H.Thioredoxin：friend or foe in human disease[J].Trends Pharmacol Sci，2005，26(8)：398-404.

[10]Powis G，Montfort W R.Properties and biological activities of thioredoxins[J].Annu Rev Pharmacol Toxicol，2001，41(1)：261-295.

[11]Chen X P，Liu S，Tang W X，et al.Nuclear thioredoxin-1 is required to suppress cisplatin-mediated apoptosis of MCF-7 cells[J].Biochem Biophys Res Commun，2007，361(2)：362-366.

(2015-04-02收稿)

Effects of Glycyrrhizic Acid and Liquiritin on the Thioredoxin Expression in the Nuclei of Tumor Cells

Pan Boyu，Wang Hehua，Zhang Xiaojietal

KeyLaboratoryforGreenChemicalProcessofMinistryofEducation，SchoolofChemicalEngineeringandPharmacy，WuhanInstituteofTechnology，Wuhan430073，China

AbstractObjectiveTo investigate the impact of active components of main single drugs from licorice on the expression of thioredoxin-1(Trx)in the nuclei of human cervical carcinoma HeLa cells.MethodsThe experimental groups were established according to the concentration gradient and different treatment time of glycyrrhizic acid(GCA)and liquiritin(LQ).Additionally，GCA and LQ at certain concentrations were separately combined with clinical chemotherapy drugs paclitaxel(PTX)or epirubicin(EPI)to set up the combined experimental groups.The changes of Trx expression levels in HeLa cell nuclei were measured by immunoblotting，and the effects of the drugs on cell proliferation were tested by methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)assay.ResultsThe expression levels of Trx in the nuclei of HeLa cells were decreased in a dose- and time-dependent manner after treatment with GCA and LQ.Both GCA and LQ were found less toxic to cells.The effects of GCA and LQ combined with low-dose chemotherapy drugs on the expression levels of Trx were similar to those in high-dose chemotherapy drug groups.ConclusionGCA and LQ can decrease the Trx expression levels in HeLa cell nuclei.Their combination with clinical chemotherapy drugs are expected to reduce the dosage of chemotherapy drugs，which have great potential clinical application values.

Key wordsglycyrrhizic acid；liquiritin；thioredoxin-1；tumor cell；nuclear localization

中圖分類號：R737.33

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.02.013

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81172178)

潘博宇，男，1990年生，碩士研究生，E-mail:pbywhh@126.com

△通訊作者，Corresponding author, E-mail:chenxiaoping@mail.wit.edu.cn