朱小甫，吳旭錦

(咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所 動(dòng)物疫病分子生物學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽 712000)

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PRRSV經(jīng)典株和變異株RT-nPCR鑒別診斷方法的建立

朱小甫，吳旭錦

(咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所 動(dòng)物疫病分子生物學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽 712000)

[摘要]【目的】 建立一種能夠區(qū)分豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)經(jīng)典株和變異株的RT-nPCR診斷方法，能夠從病料組織、血清或精液中直接進(jìn)行目的基因檢測(cè)，達(dá)到快速診斷的目的?！痉椒ā?根據(jù)GenBank上發(fā)表的豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因序列，設(shè)計(jì)并合成了2對(duì)引物，通過改變不同的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，建立PRRSV經(jīng)典株和變異株的RT-nPCR診斷方法，并通過靈敏性試驗(yàn)、特異性試驗(yàn)、病料組織和血清或精液樣品檢測(cè)，驗(yàn)證建立RT-nPCR方法的適用性?！窘Y(jié)果】 建立了PRRSV經(jīng)典株和變異株的RT-nPCR診斷方法，該方法檢測(cè)的cDNA含量極限為1.3×10-7pg/μL；且僅能從PRRSV毒株中擴(kuò)增到目的條帶，從CH-1R經(jīng)典株擴(kuò)增出649 bp條帶，從SXXY/2013變異株擴(kuò)增出562 bp條帶，電泳后能清晰區(qū)別，而從其他參考毒株中均不能擴(kuò)增出目的條帶。從48份疑似病料組織和血清中能直接檢測(cè)出31份陽性結(jié)果?！窘Y(jié)論】 建立了一種靈敏度高、特異性好、可直接從病料組織和血清中快速鑒別PRRSV經(jīng)典株和變異株的RT-nPCR方法。

[關(guān)鍵詞]豬繁殖與呼吸綜合征；經(jīng)典株；變異株；診斷方法

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)又稱藍(lán)耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒 (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一種豬群重大疫病[1-2]。1987年，本病首次在美國(guó)北卡羅來納州爆發(fā)，隨后迅速擴(kuò)散到世界各地[3]。1996年，我國(guó)郭寶清首次從北京地區(qū)發(fā)病的豬群中分離出PRRSV，從而證實(shí)了本病在我國(guó)的存在[4]。2006年，首先在我國(guó)南方爆發(fā)的“豬無名高熱”疫情中，農(nóng)業(yè)部最終調(diào)查結(jié)果表明，豬繁殖與呼吸障礙綜合征變異株是該疫病的元兇[5]。2008年，我國(guó)農(nóng)業(yè)部規(guī)定高致病性豬藍(lán)耳病為一類動(dòng)物疫病，經(jīng)典藍(lán)耳病為二類動(dòng)物疫病，本病成為嚴(yán)重威脅養(yǎng)豬業(yè)的重大疫病之一。

PRRSV屬于尼多病毒目、動(dòng)脈炎病毒科、動(dòng)脈炎病毒屬的成員，根據(jù)病毒的抗原性質(zhì)、基因組及致病性的差異，PRRSV分為歐洲型(LV株為代表株)和美洲型(ATCC-VR2332株為代表株)。PRRSV基因組為不分節(jié)段的單鏈正股RNA，大小約為15 kb[6]。目前診斷藍(lán)耳病的技術(shù)手段主要有病毒分離鑒定、病毒中和試驗(yàn)、熒光抗體技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和RT-PCR技術(shù)[7]。大多數(shù)診斷方法耗時(shí)較長(zhǎng)，不能滿足臨床快速診斷的需要，RT-PCR技術(shù)是目前診斷方法中最為靈敏和快速的技術(shù)，但目前建立的大多數(shù)方法不能直接區(qū)分經(jīng)典毒株和變異株。由于我國(guó)豬群經(jīng)典藍(lán)耳毒株和變異株共存，急需開發(fā)快速、準(zhǔn)確的鑒別診斷技術(shù)。序列比較分析表明，與經(jīng)典毒株相比，變異株在NSP2基因上連續(xù)缺失87個(gè)核苷酸[8]。針對(duì)這一特點(diǎn)，本研究旨在建立一種能夠直觀區(qū)分經(jīng)典藍(lán)耳毒株和變異株的RT-nPCR診斷方法，以期提供一種快速、準(zhǔn)確的診斷手段，為臨床防控豬藍(lán)耳病提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病毒藍(lán)耳病毒變異株是由本實(shí)驗(yàn)室從旬邑縣某豬場(chǎng)采集病料，用Marc-145細(xì)胞傳代分離獲得，測(cè)定了NSP2基因序列，命名為SXXY/2013株。參考毒株中，藍(lán)耳經(jīng)典毒株CH-1R、豬瘟病毒疫苗C株、偽狂犬Bartha-K毒株疫苗，均為普萊柯生物工程股份有限公司生產(chǎn)；圓環(huán)病毒2型(PCV-2)、細(xì)小病毒(PPV)、流行性腹瀉病毒(PEDV)、傳染性胃腸炎病毒(TGEV)，均為本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.1.2病料本實(shí)驗(yàn)室采集或豬場(chǎng)送檢病料組織(肺臟、淋巴結(jié)、脾臟、肝臟和腎臟)、血清或精液，分別來自咸陽、渭南、西安和寶雞等地區(qū)不同規(guī)模豬場(chǎng)，共計(jì)48份，組織病料研磨處理后，12 000 r/min離心10 min，收集上清液-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3試劑TRIzol Reagent、DNAzol Reagent為Invitrogen公司生產(chǎn)；AMV反轉(zhuǎn)錄酶(10 U/μL)、RNA酶抑制劑(40 U/μL)、DEPC處理水、rTaq酶(5 U/μL)、dNTP(各成分均為10 mmol/L)等，均購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司。DL 2000 Marker為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.4引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank上公開的PRRSV CH-1a株(登錄號(hào)：AY032626)、HUN4株(登錄號(hào)：EF635006)、JXA1株(登錄號(hào)：EF112445)和VR2332株(登錄號(hào)：AY150564)等全基因組序列，設(shè)計(jì)并合成了2對(duì)引物，NSP2-1F：5′- CGATCTGGTACCCGTCAA-3′(2 272～2 289，為相對(duì)于CH-1a株基因組位置，下同)，NSP2-1R：5′-CAATGGTCATGGCACC-3′(3 564～3 681)，NSP2-2F：5′-GAATGTCGCAGCTCACT-3′(2 726～2 744)，NSP2-2R：5′-GCGTCGCATGGTACCTA-3′(3 357～3 374)。預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度經(jīng)典毒株為649 bp，變異株為562 bp。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，均用DEPC處理水稀釋到20 μmol/L。

1.2方法

1.2.1PRRSV RNA的提取和第一鏈cDNA的合成取SXXY/2013株細(xì)胞培養(yǎng)液250 μL，按照TRIzol Reagent試劑說明提取總RNA，倒置離心管自然干燥。在核酸干燥過程中，按照以下體系配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液： DEPC處理水10.5 μL，上游引物NSP2-1R 1.0 μL，dNTP 4.0 μL，5×AMV Buffer 4.0 μL，AMV 0.25 μL，RNA酶抑制劑 0.25 μL，總體積20.0 μL。核酸干燥后用配制好的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液充分溶解核酸，置42 ℃水浴反轉(zhuǎn)錄90 min，取出后在微量紫外分光光度計(jì)上測(cè)定cDNA的含量。

1.2.2PRRSV RT-nPCR檢測(cè)方法的建立取已知濃度的cDNA溶液為模板，摸索擴(kuò)增條件。第1次擴(kuò)增反應(yīng)體系中10×PCR Buffer 2.5 μL，cDNA 2.0 μL， dNTP 1.0 μL，引物NSP2-1F和NSP2-1R各0.5 μL，改變r(jià)TaqDNA聚合酶用量(0.25～1.0 μL)和Mg2+用量(0.5～3.0 μL)，用超純水補(bǔ)足總體積25.0 μL。反應(yīng)條件設(shè)定為：95 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性50 s，退火溫度由52～58 ℃按1 ℃遞增設(shè)定退火1 min，72 ℃延伸 1 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。第2次擴(kuò)增時(shí)，取2.0 μL第1次擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，其他成分同第1次擴(kuò)增進(jìn)行設(shè)定摸索，只是引物更換為NSP2-2F、NSP2-2R。反應(yīng)條件設(shè)定為：95 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性 40 s，退火溫度由52～58 ℃按1 ℃遞增設(shè)定退火45 s，72 ℃ 延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

1.2.3PRRSV RT-nPCR方法靈敏性試驗(yàn)將cDNA溶液做10倍梯度稀釋至10-10倍，分別以各稀釋后cDNA溶液作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。按照摸索出的最優(yōu)反應(yīng)體系與條件進(jìn)行RT-nPCR反應(yīng)，取5.0 μL第2次擴(kuò)增產(chǎn)物，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)中照相。

1.2.4PRRSV RT-nPCR方法特異性試驗(yàn)提取PRRSV SXXY/2013株、PRRSV CH-1R株及CSFV C株、流行性腹瀉病毒(PEDV)、傳染性胃腸炎病毒(TGEV)等RNA病毒的核酸并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA；按照DNAzol Reagent試劑說明提取偽狂犬Bartha-K株、圓環(huán)病毒2型(PCV-2)、細(xì)小病毒(PPV)等DNA病毒DNA，用NSP2-1F/NSP2-1R、NSP2-2F/NSP2-2R引物對(duì)分別進(jìn)行第1次和第2次擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，成像系統(tǒng)中觀察照相。

1.2.5病料中PRRSV的檢測(cè)用以上建立的檢測(cè)方法對(duì)收集的48份組織病料進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證建立的RT-nPCR方法的實(shí)用性。

2結(jié)果與分析

2.1PRRSV RT-nPCR檢測(cè)方法的建立

通過改變反應(yīng)體系中rTaqDNA聚合酶用量和Mg2+用量，以及反應(yīng)條件中的退火溫度，優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，最終確定的最優(yōu)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為：第1次擴(kuò)增cDNA 2.0 μL，超純水16.0 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，Mg2+2.0 μL， dNTP 1.0 μL，引物NSP2-1F和NSP2-1R各0.5 μL，rTaqDNA聚合酶0.5 μL，總體積25.0 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 50 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。第2次擴(kuò)增反應(yīng)體系：取2.0 μL第1次擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，體系其余組分同第1次擴(kuò)增，引物為NSP2-2F/NSP2-2R。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 40 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

2.2PRRSV RT-nPCR檢測(cè)方法的靈敏性

經(jīng)測(cè)定，反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA含量為130 pg/μL，將其10倍梯度稀釋后進(jìn)行套式擴(kuò)增。從圖1可見，所建立的檢測(cè)方法能夠擴(kuò)增出可見目的條帶的最大稀釋度為10-9，即檢測(cè)的cDNA含量極限為1.3×10-7pg/μL，表明此方法靈敏度較高，可完全滿足PRRSV臨床檢測(cè)的需要。

圖 1　PRRSV NSP2基因 RT-nPCR檢測(cè)方法靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

2.3PRRSV RT-nPCR檢測(cè)方法的特異性

用所建立的方法對(duì)PRRSV SXXY/2013株、CH-1R株及CSFV C株、流行性腹瀉病毒(PEDV)、傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、偽狂犬Bartha-K株、圓環(huán)病毒2型(PCV-2)、細(xì)小病毒(PPV)等進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果只有PRRSV SXXY/2013株擴(kuò)增出了562 bp的目的條帶，PRRSV CH-1R株擴(kuò)增出了649 bp的目的條帶，與預(yù)期條帶長(zhǎng)度一致，其他6種毒株未擴(kuò)增出條帶(圖2)，提示所建立的檢測(cè)方法特異性好。

圖 2　PRRSV NSP2基因RT-nPCR檢測(cè)方法特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.4PRRSV RT-nPCR方法對(duì)臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果

用建立的RT-nPCR方法檢測(cè)陜西省部分地區(qū)采集的48份疑似PRRS的豬肺臟、淋巴結(jié)、脾臟、肝臟、腎臟等組織以及血清、精液等樣品，結(jié)果有31份樣品為陽性，陽性率為64.6%，部分病料檢測(cè)結(jié)果見圖3。由圖3可知，2～4號(hào)血清樣品為藍(lán)耳病毒變異株陽性，7號(hào)精液樣品為藍(lán)耳病毒變異株陽性，9、10、12、13號(hào)組織樣品為藍(lán)耳病毒變異株陽性，而15號(hào)組織樣品為藍(lán)耳病毒經(jīng)典株陽性。

圖 3　部分疑似PRRS病料中PRRSV NSP2基因檢測(cè)結(jié)果

3討論

豬繁殖與呼吸綜合征是近年嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的重大傳染病之一，其傳播迅速，發(fā)病率和死亡率均較高，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[9]。由于目前對(duì)PRRS尚無有效的治療藥物和辦法，因此建立快速有效的診斷方法是控制PRRS的重要前提。由于PRRS與多種豬繁殖障礙性疾病臨診癥狀相似，臨床診斷無法確診。血清學(xué)技術(shù)中目前應(yīng)用最廣的是ELISA技術(shù)[7]，但由于臨床應(yīng)用的PRRS疫苗無論是滅活苗還是弱毒苗均為非基因缺失苗，無法用ELISA技術(shù)區(qū)分疫苗免疫抗體和野毒感染抗體，不能用于診斷。

在我國(guó)《高致病性豬藍(lán)耳病防治技術(shù)規(guī)范》中規(guī)定，要確診高致病性豬藍(lán)耳病必須滿足病原學(xué)指標(biāo)，即高致病性豬藍(lán)耳病病毒分離鑒定陽性或高致病性豬藍(lán)耳病病毒反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)陽性。因此，在PRRS的診斷中最為可靠的方法是病毒分離鑒定和RT-PCR診斷。病毒分離鑒定的優(yōu)點(diǎn)是準(zhǔn)確可靠，并能獲得寶貴的病毒毒株，但缺點(diǎn)是需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)傳代，費(fèi)用高、耗時(shí)長(zhǎng)，不能滿足臨床快速診斷的需要。隨著分子生物學(xué)的興起，RT-PCR技術(shù)得到迅速發(fā)展，這一技術(shù)已廣泛應(yīng)用于PRRSV的快速診斷。周丹等[10]針對(duì)PRRSV普通株和變異株NSP2基因設(shè)計(jì)合成了3條引物，建立了一步鑒別診斷PRRSV普通株與變異株的RT-PCR檢測(cè)方法，通過不同長(zhǎng)度的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物將二者區(qū)分開來，該方法最低能檢測(cè)到1.5 pg的核酸含量。李和平等[11]建立了檢測(cè)PRRSV的套式RT-PCR，該方法具有極高的敏感性，將106.5TCID50的PRRSV細(xì)胞毒稀釋10 000倍后，依然能擴(kuò)增出相應(yīng)的目的片段，并且具有較好的重復(fù)性和特異性。Reicks等[12]發(fā)現(xiàn)，采用套式RT-PCR從接種感染24 h后的血清中能檢測(cè)出PRRSV。但是，以上學(xué)者建立的檢測(cè)方法中，李和平和Reicks 建立的套式RT-PCR不能區(qū)分經(jīng)典毒株和變異株，周丹建立的方法能夠區(qū)分但靈敏度稍低。本研究在分析PRRSV經(jīng)典毒株和變異株基因差異的基礎(chǔ)上，針對(duì)NSP2基因設(shè)計(jì)了2對(duì)引物，擴(kuò)增片段包含了變異株缺失的87個(gè)核苷酸，通過改變反應(yīng)體系和反應(yīng)條件等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化組合，建立了鑒別診斷PRRSV經(jīng)典株和變異株的RT-nPCR方法，結(jié)果表明，本方法檢測(cè)cDNA極限質(zhì)量濃度為1.3×10-7pg/μL，遠(yuǎn)優(yōu)于周丹等建立的一步法RT-PCR檢測(cè)方法，提示套式PCR方法靈敏度確實(shí)高于普通PCR。特異性試驗(yàn)表明，本方法能從變異株擴(kuò)增出562 bp特異性片段，從經(jīng)典株擴(kuò)增出649 bp特異性片段，但從其他常見豬病毒中均不能擴(kuò)增特異性條帶，提示建立的方法特異性高，且通過電泳圖能直觀區(qū)分經(jīng)典株和變異株，解決了李和平等建立的套式檢測(cè)方法不能區(qū)分PRRSV經(jīng)典毒株和變異株的問題，對(duì)臨床病例快速鑒別診斷提供了有力的技術(shù)手段，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

應(yīng)用建立的鑒別診斷方法，對(duì)收集的48份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)31份樣品為陽性，陽性率為64.6%，提示陜西咸陽地區(qū)不同規(guī)模的豬場(chǎng)均存在PRRSV感染且感染率高，而且檢測(cè)證實(shí)PRRSV變異株和經(jīng)典株在豬群中均有流行，以變異株感染為主，在PRRS防控上要引起重視，這一結(jié)果與國(guó)內(nèi)不同學(xué)者的研究結(jié)果[13-15]一致。在檢測(cè)的樣品中，包括組織樣、血清和精液，本方法從這3種樣品中均成功擴(kuò)增出特異性目的條帶，提示對(duì)PRRSV的檢測(cè)樣品選擇比較寬泛，尤其是血清來源較易，不需剖檢采集組織，為流行病學(xué)調(diào)查提供了便利手段。精液中檢測(cè)出PRRSV的存在，提示公豬精液帶毒并可能通過人工授精傳播，需要引起高度重視。

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Establishment of a RT-nPCR diagnostic method for PRRSV classical and variant strains

ZHU Xiao-fu,WU Xu-jin

(AnimalEpidemicDiseaseDiagnosticLaboratoryofMolecularBiology,InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,XianyangVocationalTechnicalCollege,Xianyang,Shaanxi712000,China)

Abstract:【Objective】 This study established a RT-nPCR diagnostic method to distinguish classical and variants strains of porcine reproductive and respiratory virus (PRRSV) quickly from tissue and serum.【Method】 Based on PRRSV gene sequences in GenBank,two pairs of primers were designed and synthesized and a RT-nPCR diagnostic method was established to distinguish classical and variants strains of PRRSV through sensitive test,specificity test,and detection of tissue and serum samples.【Result】 The established method had the detection limit of 1.3×10-7pg/μL and it only amplified target band from PRRSV.A total of 649 bp bands were amplified from classic strain CH-1R and 562 bp bands were amplified from variant strain SXXY/2013.These bands were clearly distinguished after electrophoresis,while no bands were amplified from other reference strains.31 out of the 48 suspected tissues and serum were detected positive.【Conclusion】 A highly sensitive and specific RT-nPCR method was established and it can directly differentiate PRRSV classic strains and variant strains from diseased tissues and serum.

Key words:porcine reproductive and respiratory syndrome;classical strains;variant strain;diagnostic methods

[文章編號(hào)]1671-9387(2016)01-0025-06

[中圖分類號(hào)]S852.65+1

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[作者簡(jiǎn)介]朱小甫(1977-)，男，陜西眉縣人，執(zhí)業(yè)獸醫(yī)師，碩士，主要從事動(dòng)物疫病分子病原學(xué)與免疫學(xué)研究。

[基金項(xiàng)目]咸陽市科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2014K02-21)；咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院重點(diǎn)科研項(xiàng)目(2013KYA01)

[收稿日期]2014-04-25

DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2015-12-0214:2510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.01.005

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20151202.1425.010.html

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