馬　鑫，高　卉，張俊會(huì)，薛泉宏

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

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真菌粗酶制劑脫氫酶活性測(cè)定條件的優(yōu)化

馬鑫，高卉，張俊會(huì)，薛泉宏

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

[摘要]【目的】 探究酶液制備及測(cè)定條件對(duì)真菌粗酶制劑脫氫酶活性的影響，確定真菌粗酶制劑脫氫酶活性測(cè)定方法?！痉椒ā?采用氯化三苯基四氮唑(TTC)還原法測(cè)定真菌粗酶制劑的脫氫酶活性，分析粗酶制劑與去離子水質(zhì)量比、活化時(shí)間、活化溫度、振蕩速率、攪拌時(shí)間、固液分離方法、活化劑種類、過(guò)濾介質(zhì)及顯色時(shí)間對(duì)脫氫酶活性的影響?！窘Y(jié)果】 ①真菌粗酶制劑活化、分離方式及顯色時(shí)間對(duì)真菌粗酶制劑脫氫酶活性測(cè)定有明顯影響。②確定真菌粗酶制劑脫氫酶活性測(cè)定優(yōu)化方法為：將粗酶制劑與去離子水按照質(zhì)量比1∶40裝入三角瓶，在28 ℃、120 r/min恒溫?fù)u床中振蕩15 h，用快速濾紙過(guò)濾獲得酶液；將酶液與TTC-葡萄糖溶液混勻，在40 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)顯色，待反應(yīng)液出現(xiàn)紅色后計(jì)時(shí)，維持90 min完成顯色反應(yīng)，取出后加乙酸乙酯充分搖勻，4 ℃冰箱中靜置5～6 h，取上層澄清有機(jī)相在波長(zhǎng)485 nm比色，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算脫氫酶活性?！窘Y(jié)論】 獲得了測(cè)定真菌粗酶制劑脫氫酶活性的測(cè)定方法。

[關(guān)鍵詞]TTC還原法；脫氫酶；真菌；粗酶制劑

脫氫酶(Dehydrogenase)是活細(xì)胞合成的用于有機(jī)物氧化的必需酶類。脫氫酶活性(Dehydrogenase activity,DHA)與活細(xì)胞數(shù)量及其生理代謝活性密切相關(guān)[1]。故常用DHA表示植物種子與根系活力[2]、微生物細(xì)胞數(shù)量與活力[3]及活性污泥等沉積體中的生物數(shù)量與活性[4]。氯化三苯基四氮唑(TTC)還原法[5]是測(cè)定DHA的常用方法之一，目前主要用于植物種子[6]活性鑒定，細(xì)菌[7]、藻類[8]及活性污泥[4]等材料中活細(xì)胞數(shù)量與生理活性測(cè)定，尚無(wú)用于真菌粗酶制劑DHA測(cè)定的報(bào)道。真菌粗酶制劑是產(chǎn)酶真菌的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物，其烘干粉碎制品中含有真菌菌體、真菌合成的纖維素酶、蛋白酶及糖化酶等胞外酶，這些真菌粗酶制劑或純酶制劑均有通用的測(cè)定方法[9]或國(guó)標(biāo)方法[10-11]，但目前尚無(wú)利用真菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)脫氫酶粗酶制劑的研究報(bào)道，更無(wú)測(cè)定真菌粗酶制劑DHA的方法。TTC還原法雖然比色方法成熟，但待測(cè)液因供試材料差異大無(wú)法用同一方法制備，現(xiàn)有的用于活細(xì)胞數(shù)及代謝活性測(cè)定的待測(cè)液制備法，無(wú)法直接用于真菌粗酶制劑DHA測(cè)定。鑒于真菌脫氫酶對(duì)有機(jī)污染物降解及環(huán)境修復(fù)的重要作用[12]，探索真菌脫氫酶粗酶制劑的酶液制備方法及條件，建立真菌粗酶制劑DHA測(cè)定方法，對(duì)真菌粗酶制劑DHA理論研究與應(yīng)用均有重要意義。本試驗(yàn)研究酶液制備及測(cè)定條件對(duì)真菌粗酶制劑DHA測(cè)定值的影響，旨在建立真菌粗酶制劑DHA測(cè)定方法。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試真菌米曲霉(Aspergillusoryzae)由西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院微生物資源研究室提供，是該研究室通過(guò)脫氫酶測(cè)定從保存的絲狀真菌中篩選出的脫氫酶活性較高的菌種，用于真菌粗酶制劑脫氫酶活性測(cè)定方法優(yōu)化研究，可代表霉菌類產(chǎn)酶真菌。

1.1.2真菌固態(tài)培養(yǎng)基小麥麩皮與無(wú)機(jī)鹽溶液(KNO35 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L)按質(zhì)量比10∶8拌勻。稱取60 g真菌固態(tài)培養(yǎng)基裝入600 mL組培瓶，121 ℃高溫濕熱滅菌30 min。

1.1.3TTC-葡萄糖溶液稱取0.1 g TTC與1.0 g葡萄糖溶于100 mL蒸餾水中，避光、4 ℃保存。

1.1.4Tris-HCl緩沖液稱取6.037 g Tris，溶于20 mL 1.0 mol/L HCl，定容至1 L，其pH為8.0。

1.1.5乙酸乙酯與硫化鈉均為分析純，其中硫化鈉溶液質(zhì)量濃度為100 g/L。

1.2方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線制作采用趙連梅等[13]的方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。還原劑為硫化鈉新配溶液[14]，參照尹軍等[15]的方法，萃取劑為乙酸乙酯，比色波長(zhǎng)為485 nm。TTC比色法標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法如下：稱取50 mg烘干的TTC溶于去離子水中，50 mL棕色容量瓶中定容，即為1 mg/mL TTC標(biāo)準(zhǔn)溶液；分別從1 mg/mL TTC標(biāo)準(zhǔn)溶液中吸取1，2，3，4，5，6，7 mL加入50 mL棕色容量瓶中，用去離子水定容，即得20，40，60，80，100，120，140 μg/mL不同質(zhì)量濃度的TTC標(biāo)準(zhǔn)溶液。取8支25 mL具塞刻度試管，其中1支加入去離子水1 mL為空白對(duì)照，其余7支分別加入20，40，60，80，100，120，140 μg/mL TTC標(biāo)準(zhǔn)系列溶液1 mL，再依次加入Tris-HCl緩沖液2 mL，100 g/L Na2S新配溶液1 mL，去離子水1 mL搖勻后，40 ℃水浴中放置20 min，使其充分反應(yīng)。再加入乙酸乙酯5 mL，充分搖勻，穩(wěn)定20 min，使其充分分層，取上層有機(jī)相溶液在722型分光光度計(jì)485 nm處比色，以空白對(duì)照調(diào)零點(diǎn)，測(cè)定其吸光度(A485)并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得高質(zhì)量濃度系列標(biāo)準(zhǔn)曲線；另取8支25 mL具塞刻度試管，其中1支加入去離子水1 mL為空白對(duì)照，其余7支依次加入20，40，60，80，100，120，140 μg/mL TTC標(biāo)準(zhǔn)系列溶液0.5 mL及去離子水0.5 mL，以同樣方法進(jìn)行顯色、比色，測(cè)定其吸光度(A485)并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得低質(zhì)量濃度系列標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2粗酶制劑的制備將供試真菌菌種接入 1.1.2 節(jié)的真菌固態(tài)培養(yǎng)基，28 ℃靜置培養(yǎng)3～4 d，待菌絲布滿基質(zhì)并開始產(chǎn)生孢子時(shí)取出，40 ℃烘干，粉碎裝袋，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3DHA影響因素研究(1) 粗酶制劑與去離子水質(zhì)量比。 將粗酶制劑與去離子水按照質(zhì)量比1∶20，1∶40，1∶60分別裝入100 mL三角瓶，在25 ℃下120 r/min振蕩10 h后，采用快速濾紙過(guò)濾進(jìn)行固液分離獲得酶液。

(2) 提取及活化時(shí)間。 粗酶制劑與去離子水按照質(zhì)量比1∶40配制，在25 ℃下120 r/min分別振蕩0，12，15，18，21，24及48 h，采用快速濾紙過(guò)濾進(jìn)行固液分離獲得酶液。

(3) 活化溫度和振蕩速率。 粗酶制劑與去離子水按照質(zhì)量比1∶40配制，分別置于20，37，45 ℃恒溫?fù)u床振蕩活化15 h，振蕩速率分別為0，120，220 r/min，振蕩結(jié)束后采用快速濾紙過(guò)濾進(jìn)行固液分離獲得酶液。

(4) 攪拌時(shí)間。粗酶制劑與去離子水按照質(zhì)量比1∶40配制，分別置于25 ℃恒溫?fù)u床振蕩活化15 h后，于4 000 r/min攪拌0，2，4，6 min，采用快速濾紙過(guò)濾進(jìn)行固液分離后獲得酶液。

(5) 活化劑種類、固液分離方法及過(guò)濾介質(zhì)。將粗酶制劑分別與去離子水和pH為8.0的Tris-HCl緩沖液按照質(zhì)量比1∶40配制，置于25 ℃恒溫?fù)u床振蕩活化15 h后，并分別采用4 000 r/min離心5 min、過(guò)濾及2種方式相結(jié)合將酶液與固相殘?jiān)蛛x，獲得酶液。研究過(guò)濾介質(zhì)分別為快速濾紙、慢速濾紙及脫脂棉時(shí)DHA的變化，具體方法為：選用口徑約8 cm的錐形漏斗，分別鋪上快速濾紙、慢速濾紙及0.8 g脫脂棉，倒入活化后液體并開始計(jì)時(shí)，直至全部過(guò)濾結(jié)束停止計(jì)時(shí)，將濾液搖勻后作為待測(cè)酶液。

1.2.4DHA測(cè)定采用TTC還原法[16]。取25 mL具塞刻度試管若干支，依次加入2 mL Tris-HCl緩沖液，2 mL TTC-葡萄糖溶液，1 mL粗酶制劑酶液。置40 ℃恒溫水浴反應(yīng)2 h后取出，加5 mL乙酸乙酯，劇烈振蕩混勻，在4 ℃冰箱中靜置5～6 h，取上層有機(jī)相萃取液于485 nm處比色。

顯色時(shí)間的確定：從試管放入40 ℃恒溫水浴后25 min開始，每10 min取樣1次，直至顯色時(shí)間達(dá)115 min結(jié)束，每次重復(fù)3管，每管加5 mL乙酸乙酯萃取后比色，計(jì)算DHA，求出最佳顯色時(shí)間。

DHA單位及計(jì)算：依1.2.4節(jié)的測(cè)定方法，將1 g粗酶制劑1 min產(chǎn)生1 μg三苯基甲臜(TF)的脫氫酶活性定義為1個(gè)酶活單位，用1 U表示，即1 U=1 μg/(g·min)。DHA按下式計(jì)算：

式中：DHA為真菌脫氫酶活性(U)，C為利用標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算得到的TF質(zhì)量濃度值(μg/mL)，V為萃取劑乙酸乙酯用量(mL)，k為粗酶制劑活化時(shí)的稀釋倍數(shù)，t為顯色時(shí)間(min)，m為粗酶制劑質(zhì)量(g)。

處理增率(Δ)=(某處理DHA測(cè)定值-參照處理DHA測(cè)定值)÷ 參照處理DHA測(cè)定值×100%。

式中：參照處理表示某低水平處理或?qū)φ铡?/p>

2結(jié)果與分析

2.1測(cè)定真菌粗酶制劑DHA時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

從圖1可以看出，根據(jù)1.2.1節(jié)方法獲得的高質(zhì)量濃度系列標(biāo)準(zhǔn)曲線和低質(zhì)量濃度系列標(biāo)準(zhǔn)曲線的吸光度分別為0.1～1.2和0.05～0.6；2條標(biāo)準(zhǔn)曲線均具有良好的線性關(guān)系，其決定系數(shù)(R2)分別為0.997 8和0.995 2，TF吸光度(A485)與TTC質(zhì)量濃度的相關(guān)性均達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。根據(jù)比爾-朗伯定律，吸光度在0.2～0.8時(shí)，讀數(shù)誤差較小，最佳比色度為0.4左右。故在測(cè)定DHA時(shí)應(yīng)盡量將吸光度(A485)控制在0.4左右。

圖 1　TTC質(zhì)量濃度與其反應(yīng)產(chǎn)物TF吸光度(A485)標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2真菌粗酶制劑DHA的影響因素

2.2.1粗酶制劑與去離子水的質(zhì)量比從表1可見(jiàn)，粗酶制劑提取及活化時(shí)，粗酶制劑與去離子水的質(zhì)量比對(duì)DHA有極顯著影響(P<0.01)。其中粗酶制劑與去離子水按質(zhì)量比1∶40提取及活化時(shí)DHA最高，達(dá)123.6 U，其次為質(zhì)量比1∶60的處理，以上二者的DHA分別較質(zhì)量比1∶20處理多2.4和1.8倍?？芍置钢苿┡c去離子水質(zhì)量比以1∶40為宜。

表 1　粗酶制劑與去離子水質(zhì)量比對(duì)

注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同大寫字母者表示差異極顯著(P<0.01)。下表同。

Note:Different uppercase letters stand for significant difference atP<0.01.The same below.

2.2.2提取及活化時(shí)間從圖2可見(jiàn)，隨著提取及活化時(shí)間延長(zhǎng)，粗酶制劑的DHA呈先增高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)提取及活化時(shí)間為0～15 h時(shí)DHA逐漸增高，15 h時(shí)達(dá)到峰值，為87.1 U；15～24 h時(shí)DHA迅速降低，至24 h時(shí)達(dá)到最低，為1.1 U；24～48 h，DHA很低且基本保持不變。由此可知15 h是粗酶制劑活化的最佳時(shí)間。

圖 2　粗酶制劑活化時(shí)間對(duì)真菌粗酶制劑DHA的影響

2.2.3活化溫度和振蕩速率由表2可知，活化溫度對(duì)DHA有極顯著影響(P<0.01)?；罨瘻囟葹?5 ℃時(shí)的DHA較20 ℃時(shí)降低了68.4 %(P<0.01)；37 ℃時(shí)與20 ℃無(wú)顯著差異。說(shuō)明活化溫度較高對(duì)脫氫酶的破壞作用明顯，20～37 ℃是活化適宜溫度，為方便實(shí)際操作，可選擇更接近室溫的28 ℃作為最佳活化溫度。

從表2還可以看出，提取及活化時(shí)的振蕩速率對(duì)DHA影響也極顯著(P<0.01)。當(dāng)振蕩速率為120 r/min時(shí)DHA最高，為24.3 U，較靜置對(duì)照(0 r/min)的DHA提高了125.8%，兩者差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)；而在220 r/min條件下DHA較靜置對(duì)照(0 r/min)降低20.4%。可知120 r/min是真菌粗酶制劑中脫氫酶酶蛋白活化的最佳振蕩速率。

表 2　活化溫度和振蕩速率對(duì)真菌粗酶制劑DHA的影響

2.2.4攪拌時(shí)間攪拌的目的是通過(guò)物理作用使附著在固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)上的酶蛋白脫離基質(zhì)表面進(jìn)入液相，提高酶液中游離酶蛋白數(shù)量，進(jìn)而提高酶液的DHA。由表3可知，將活化至一定時(shí)間的真菌粗酶制劑與去離子水形成的糊狀液體置于轉(zhuǎn)速為 4 000 r/min 的攪拌機(jī)內(nèi)處理0，2，4，6 min，隨著攪拌時(shí)間的增加，DHA降低；攪拌2 min處理的DHA較未攪拌處理(0 min)降低了14.7%，但是二者差異不顯著；但攪拌4，6 min處理的DHA分別較未攪拌處理(0 min)降低40.1%，66.6%，差異均達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。表明快速攪拌可大幅度降低DHA，這可能是高速物理攪拌破壞了脫氫酶結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致DHA降低，故活化一定時(shí)間的真菌粗酶制劑不需要攪拌。

表 3　攪拌時(shí)間對(duì)真菌粗酶制劑DHA的影響

2.2.5活化劑種類及分離方式由表4可知，活化劑種類對(duì)真菌粗酶制劑DHA有較大影響。其中用過(guò)濾法分離時(shí)，用去離子水、pH 8.0 Tris-HCl緩沖液為提取及活化劑時(shí)，供試粗酶制劑的DHA分別為161.8和59.2 U，去離子水為提取及活化劑時(shí)的DHA是pH 8.0 Tris-HCl緩沖液為活化劑時(shí)的 2.7 倍，二者的差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)；用離心法及離心+過(guò)濾法分離時(shí)，2種提取及活化劑處理的DHA均極顯著降低。

由表4還可知，固液分離方式對(duì)供試粗酶制劑DHA影響很大。以去離子水為提取及活化劑時(shí)，過(guò)濾法與離心分離法和離心+過(guò)濾分離法獲得酶液的DHA差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，過(guò)濾分離法獲得的酶液DHA分別為離心法和離心+過(guò)濾分離法的5.1和5.0倍。當(dāng)以pH 8.0 Tris-HCl緩沖液為提取及活化劑時(shí)，DHA變化也呈類似趨勢(shì)。由以上分析可知，以去離子水為活化劑且采用過(guò)濾方式進(jìn)行固液分離時(shí)測(cè)定的DHA效果較佳。

表 4　提取及活化劑種類和分離方式對(duì)真菌粗酶制劑DHA的影響

2.2.6過(guò)濾介質(zhì)由表5可知，過(guò)濾介質(zhì)對(duì)DHA的影響極顯著(P<0.01)。以脫脂棉為過(guò)濾介質(zhì)時(shí)，供試粗酶制劑的DHA為459.2 U，分別為快速濾紙、慢速濾紙?zhí)幚淼?.8和32.1倍。但脫脂棉過(guò)濾后，濾液混濁易沉淀，且TTC的反應(yīng)產(chǎn)物TF較多，乙酸乙酯萃取困難，且對(duì)TF的萃取不完全，導(dǎo)致DHA測(cè)定結(jié)果變異較大。而快速濾紙過(guò)濾后濾液較清亮，乙酸乙酯對(duì)TF萃取完全，DHA的測(cè)定結(jié)果較穩(wěn)定。此外，快速濾紙過(guò)濾速度也較快，所用時(shí)間僅為20 min，因此選用快速濾紙作為真菌粗酶制劑DHA測(cè)定的最佳過(guò)濾介質(zhì)。

表 5　過(guò)濾介質(zhì)對(duì)真菌粗酶制劑DHA的影響

2.2.7顯色反應(yīng)時(shí)間顯色反應(yīng)時(shí)間對(duì)真菌粗酶制劑DHA的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖 3　顯色反應(yīng)時(shí)間對(duì)真菌粗酶制劑DHA的影響

由圖3可知，當(dāng)顯色時(shí)間為25～45 min時(shí)，隨著顯色反應(yīng)時(shí)間增加DHA呈先升后降趨勢(shì)；45 min后DHA呈緩慢上升趨勢(shì)，至85～95 min，DHA達(dá)到峰值；之后DHA呈快速下降趨勢(shì)。為測(cè)得最大DHA，應(yīng)從反應(yīng)體系出現(xiàn)可見(jiàn)紅色后計(jì)時(shí)，維持至90 min后終止顯色反應(yīng)。

2.3真菌粗酶制劑DHA的測(cè)定方法

根據(jù)以上測(cè)定結(jié)果，可建立真菌粗酶制劑DHA的測(cè)定方法：將粗酶制劑與去離子水按照質(zhì)量比 1∶40 裝入三角瓶，在28 ℃、120 r/min恒溫?fù)u床中振蕩提取并活化15 h，用快速濾紙過(guò)濾獲得待測(cè)酶液；將酶液與TTC-葡萄糖液混勻后在40 ℃恒溫水浴鍋中顯色，待反應(yīng)液出現(xiàn)紅色后計(jì)時(shí)，維持90 min，取出后加乙酸乙酯充分搖勻，4 ℃冰箱中靜置5～6 h，取上層澄清有機(jī)相在波長(zhǎng)485 nm比色，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算反應(yīng)產(chǎn)物TF的質(zhì)量濃度及其對(duì)應(yīng)DHA。

3討論

本研究發(fā)現(xiàn)，提取時(shí)的活化過(guò)程對(duì)真菌粗酶制劑DHA影響很大，不能采用纖維素酶等真菌酶制劑的直接提取法[17]制備待測(cè)液。其原因是直接用干酶粉加水提取獲得的酶液測(cè)定的DHA值很低；將酶液在4 ℃冰箱放置一定時(shí)間后活性提高，且提高幅度隨放置時(shí)間延長(zhǎng)而增大。在4 ℃微生物生長(zhǎng)代謝及由此產(chǎn)生的酶活性提高可忽略不計(jì)。由此發(fā)現(xiàn)，酶液在低溫下放置可提高DHA，并由此推測(cè)DHA提高是酶蛋白膠體充分吸水后水化程度提高的結(jié)果，其原因在于真菌固態(tài)發(fā)酵制備的脫氫酶粗酶制劑干燥后，酶蛋白脫水失去或降低了催化活性，進(jìn)而提出了對(duì)真菌粗酶制劑中酶蛋白進(jìn)行活化的思路：將粗酶粉與去離子水按照質(zhì)量比1∶40裝入100 mL三角瓶，在28 ℃下恒溫振蕩15 h后固液分離獲得酶液。在此條件下，去離子水不能提供真菌生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)，僅靠粗酶粉中的殘留營(yíng)養(yǎng)，即使真菌孢子萌發(fā)也難以良好生長(zhǎng)并合成大量胞外酶蛋白，故活化后測(cè)得的DHA應(yīng)以粗酶粉中的脫氫酶為主。粗酶制劑活化預(yù)處理后DHA提高的主要原因有：粗酶制劑中的酶蛋白從干燥脫水無(wú)活性狀態(tài)通過(guò)吸水轉(zhuǎn)化為水化狀態(tài)，恢復(fù)催化活性；通過(guò)搖床振蕩使酶蛋白從固態(tài)發(fā)酵原料麩皮等固相基質(zhì)表面脫離進(jìn)入液相，成為游離態(tài)有催化活性的酶蛋白。通過(guò)上述活化處理獲得的酶液DHA可代表真菌粗酶制劑進(jìn)行催化反應(yīng)時(shí)的真實(shí)活性。

本研究還發(fā)現(xiàn)，酶液提取時(shí)的活化條件對(duì)DHA測(cè)定結(jié)果影響很大。首先，粗酶制劑與去離子水的質(zhì)量比影響DHA，且以1∶40時(shí)較合適，該比例可以使干燥的酶蛋白獲得充足的水分恢復(fù)催化活性。其次，活化時(shí)間應(yīng)控制在15 h左右。在15 h內(nèi)，DHA隨著活化時(shí)間的增加逐漸提高；時(shí)間過(guò)短(<15 h)，酶蛋白不能充分吸水活化；時(shí)間過(guò)長(zhǎng)(>15 h)，DHA迅速降低，這可能與粗酶制劑中雜質(zhì)蛋白酶對(duì)脫氫酶的水解作用等有關(guān)。第三，在20～37 ℃均可獲得較好的活化效果。第四，活化時(shí)振蕩速率為120 r/min較合適。因?yàn)檎袷幩俾蔬^(guò)快會(huì)破壞脫氫酶的三維結(jié)構(gòu)，而靜置活化時(shí)酶蛋白活化不充分，在這2種情況下DHA測(cè)定結(jié)果均較低。第五，強(qiáng)烈攪拌會(huì)降低真菌酶制劑的DHA值。酶蛋白吸水活化之后，仍有大量酶蛋白附著在粗酶制劑的雜質(zhì)顆粒上，采用物理攪拌的目的是將酶蛋白從固體顆粒上剝離下來(lái)。但本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，快速物理攪拌可使DHA降低，由此可知，脫氫酶三維結(jié)構(gòu)復(fù)雜，易在物理作用下破壞失活，故應(yīng)避免用強(qiáng)烈機(jī)械攪拌處理活化后的酶液，以減少對(duì)酶蛋白結(jié)構(gòu)的物理破壞。第六，用去離子水作活化劑時(shí)DHA較高。周春生等[18]在活性污泥的前處理中發(fā)現(xiàn)，純水的處理效果優(yōu)于生理鹽水，并推測(cè)可能與生理鹽水中大量Cl-不利于有機(jī)物脫氫反應(yīng)有關(guān)，使形成的紅色物質(zhì)TF較少。本研究還發(fā)現(xiàn)，不同分離方式對(duì)DHA影響很大。用脫脂棉過(guò)濾時(shí)DHA很高，而快速濾紙過(guò)濾時(shí)DHA相對(duì)較低，表明大量的脫氫酶蛋白能通過(guò)濾孔較大的脫脂棉進(jìn)入酶液，而有部分脫氫酶不能通過(guò)快速濾紙。但快速濾紙過(guò)濾后的濾液清亮，適合顯色反應(yīng)，且DHA測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定。故快速濾紙過(guò)濾是測(cè)定真菌粗酶制劑DHA的較好分離方法。但由于脫脂棉的過(guò)濾速度快、時(shí)間短、濾液DHA高，在實(shí)際應(yīng)用中可選用脫脂棉作過(guò)濾介質(zhì)，以減少脫氫酶的過(guò)濾損失，防止過(guò)濾引起的酶液DHA大幅度下降，提高酶促反應(yīng)時(shí)脫氫酶的催化效率。此外，粗酶制劑中存在的雜質(zhì)會(huì)影響反應(yīng)體系中TF萃取及比色結(jié)果，用4 000 r/min離心分離酶液時(shí)，可使大量酶蛋白吸附在雜質(zhì)上沉降到離心管底部，導(dǎo)致離心液的DHA大幅度下降。

關(guān)于顯色時(shí)間，齊魯青等[19]認(rèn)為，考慮到生物活性測(cè)定的快速和簡(jiǎn)便性，比色時(shí)應(yīng)控制吸光度在0.4左右，故選擇4 h作為顯色反應(yīng)時(shí)間。周恢等[20]則認(rèn)為，顯色2 h時(shí)的反應(yīng)產(chǎn)物TF已便于檢出。黃春花等[21]認(rèn)為，TTC不易擴(kuò)散進(jìn)入真菌細(xì)胞，反應(yīng)時(shí)間應(yīng)控制在3 h。這些研究?jī)H根據(jù)吸光度需要控制顯色時(shí)間，未充分考慮不同樣品DHA的巨大差異及酶促反應(yīng)的完全程度。在酶促反應(yīng)不完全的情況下，所得結(jié)果不能反映真正的脫氫酶活性。本研究發(fā)現(xiàn)，真菌粗酶制劑DHA差異很大，顯色速度相差甚遠(yuǎn)，僅以限定顯色反應(yīng)時(shí)間無(wú)法滿足不同酶制劑DHA測(cè)定需要。對(duì)DHA很高的酶制劑而言，在確定時(shí)間內(nèi)，脫氫反應(yīng)產(chǎn)生的TF過(guò)多，萃取劑萃取不完全；對(duì)DHA很低的酶制劑而言，在確定時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的TF過(guò)少，吸光度值很低，影響比色準(zhǔn)確度。故不能僅通過(guò)確定顯色反應(yīng)時(shí)間控制比色液的吸光度。

本研究認(rèn)為，要獲得適宜的吸光度和準(zhǔn)確的測(cè)定結(jié)果，首先要將酶液稀釋到適宜的質(zhì)量濃度。其次，要讓酶促反應(yīng)達(dá)到較完全的程度，即在顯色反應(yīng)中，紅色基本穩(wěn)定、顏色不再增加為止。達(dá)到上述目標(biāo)的具體方法如下：如顯色反應(yīng)很快、顯色液顏色很深，表明待測(cè)酶液DHA強(qiáng)，在后續(xù)處理中會(huì)出現(xiàn)萃取不完全，吸光度過(guò)大，測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確的問(wèn)題。此時(shí)，應(yīng)先將酶液稀釋至適當(dāng)質(zhì)量濃度后再測(cè)定DHA；若顯色反應(yīng)很慢、顯色液顏色很淺，表示待測(cè)酶液DHA弱，可降低酶液的稀釋倍數(shù)或?qū)⒎磻?yīng)體系中酶液量加大后再顯色測(cè)定。通過(guò)上述途徑可將待測(cè)液的吸光度值控制在0.4左右，既能確保脫氫反應(yīng)產(chǎn)生的TF萃取完全，又能使比色時(shí)的吸光度值處于合理范圍。在酶液質(zhì)量濃度調(diào)整到適當(dāng)稀釋倍數(shù)時(shí)，顯色時(shí)間用下述方法確定：在反應(yīng)體系出現(xiàn)紅色時(shí)計(jì)時(shí)，再維持90 min結(jié)束顯色反應(yīng)，冷卻靜置后比色。

本研究還發(fā)現(xiàn)，不同條件下制備的真菌粗酶制劑待測(cè)液的DHA差異很大，表明酶液制備條件對(duì)真菌粗酶制劑DHA有強(qiáng)烈影響；制備條件不同，所測(cè)DHA的值無(wú)可比性。因此，必須規(guī)范真菌粗酶制劑待測(cè)液制備方法，其測(cè)定值才具有可比性。

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Optimization of determination method for dehydrogenase activity of crude enzyme preparation from fungi

MA Xin,GAO Hui,ZHANG Jun-hui,XUE Quan-hong

(CollageofNaturalResourceandEnvironment,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

Abstract：【Objective】 The study explored the influencing factors on dehydrogenase activity of enzyme preparation from fungi to determine the test method.【Method】 Triphenyltetrazolium chloride (TTC)-reduction method was used to assay the dehydrogenase activity of fungal crude enzyme and analyze the effect of mass ratio of crude enzyme preparation to deionized water,activation time,activation temperature, oscillation rate,stirring time,solid-liquid separation method,activation agent,filter medium,and chromogenic time on dehydrogenase activity.【Result】 ①Activation,separation method and color reaction time had significant influence on dehydrogenase activity.②The measurement method of dehydrogenase activity was determined.Crude enzyme and deionized water were mixed at the mass ratio of 1∶40 in the triangle bottle before being shaken with oscillation rate of 120 r/min at 28 ℃ for 15 h.Then rapid filter paper was used to separate mixture and enzyme solution and TTC-glucose reacted in thermostatic water bath at 40 ℃.As the reaction mixture became reddish,it was maintained for 90 min before 5 mL CH3COOC2H5 was added.Finally,it was put into 4 ℃ refrigerator for 5-6 h before the clear organic layer was assayed by colorimetry at wavelength of 485 nm and dehydrogenase activity was calculated by comparing to standard curve.【Conclusion】 Determination method of dehydrogenase activity of crude enzyme preparation from fungi was optimized.

Key words:TTC-reduction method;dehydrogenase;fungi;crude enzyme preparation

[文章編號(hào)]1671-9387(2016)01-0155-07

[中圖分類號(hào)]Q814.4

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[作者簡(jiǎn)介]馬鑫(1988-)，男，山東高密人，在讀碩士，主要從事微生物資源利用研究。E-mail:maxin4561@163.com[通信作者]薛泉宏(1957-)，男，陜西白水人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事微生物生態(tài)與資源利用研究。

[基金項(xiàng)目]陜西博秦生物工程有限公司微生物增油項(xiàng)目

[收稿日期]2014-05-09

DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2015-12-0214:2510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.01.023

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20151202.1425.046.html

E-mail:xuequanhong@163.com