賈建磊，張利平，丁　強，楊志文

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

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綿羊BMPR-IB基因第7外顯子多態(tài)性與產(chǎn)羔性狀的相關(guān)性研究

賈建磊，張利平，丁強，楊志文

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

[摘要]【目的】 探索綿羊BMPR-IB基因第7外顯子多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)性，尋找控制綿羊繁殖力的分子標記位點?！痉椒ā?以相同飼養(yǎng)管理條件下同齡已有產(chǎn)羔記錄的蒙古羊(單胎母羊和雙胎母羊)、無角陶賽特羊(單胎母羊和雙胎母羊)、小尾寒羊(多胎母羊)為試驗材料，采用PCR-SSCP結(jié)合DNA直接測序的方法，對BMPR-IB基因第7外顯子進行多態(tài)性檢測與分析?！窘Y(jié)果】 試驗羊只存在AA型和AB型2種基因型；AB型個體在BMPR-IB基因第864位點發(fā)生C→T突變，出現(xiàn)T/C的雜合，所有試驗樣本的優(yōu)勢基因型均為AA型，優(yōu)勢等位基因均為A基因。χ2適合性檢驗表明，無角陶賽特羊、蒙古羊和小尾寒羊均處于Hardy-weinberg平衡狀態(tài)，BMPR-IB基因第7外顯子不同基因型在不同產(chǎn)羔類型綿羊中的分布差異顯著，最小二乘法分析表明，綿羊BMPR-IB第7外顯子多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)有一定的相關(guān)性。【結(jié)論】 BMPR-IB基因第7外顯子第864位點的突變在不同繁殖力母羊群體中分布不同，表明綿羊BMPR-IB基因第7外顯子多態(tài)性與綿羊產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)，可以作為控制綿羊繁殖力的潛在遺傳標記位點進行下一步研究。

[關(guān)鍵詞]綿羊；BMPR-IB基因第7外顯子；PCR-SSCP；DNA直接測序；多態(tài)性；產(chǎn)羔數(shù)

我國是世界綿羊主要生產(chǎn)國，綿羊飼養(yǎng)數(shù)量和綿羊品種遺傳資源均居世界第一位。在我國農(nóng)牧區(qū)，肉羊業(yè)已成為重要產(chǎn)業(yè)和主要經(jīng)濟來源。繁殖性能是綿羊重要的經(jīng)濟性狀，其中產(chǎn)羔性能是影響生產(chǎn)效率的最主要因素，直接影響到養(yǎng)羊業(yè)生產(chǎn)的效率和成本，對養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展起到了關(guān)鍵性的作用[1]。產(chǎn)羔性狀分為單羔性狀、雙羔性狀和多羔性狀3種，不同品種間的產(chǎn)羔率差異較大。綿羊產(chǎn)羔性狀選育最有效的方法是，從DNA分子角度尋找到產(chǎn)羔性狀的主效基因和分子標記進行分子選育[2]。

骨形態(tài)蛋白受體IB(Bone morphogenetic protein receptor IB，BMPR-IB)基因是編碼轉(zhuǎn)移生長因子β亞基(TGF-β)受體家族的成員之一，存在于許多類型細胞中，在綿羊卵巢的卵母細胞和顆粒細胞中有特異性表達，具有影響顆粒細胞分化和卵泡發(fā)育、促進排卵數(shù)的作用[3-4]。BMPR-IB基因編碼區(qū)共存在22個突變位點，G192A、A746G、G922T、T1043C等4個位點的突變造成了氨基酸的變化[5]，其中編碼區(qū)第746位點上發(fā)生A→G突變后，導(dǎo)致突變體BB對配體生長分化因子5(Growth differentiation factor 5，GDF5)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(Bone morphiogenetic protein 4，BMP4)不敏感，從而使高劑量的GDF5抑制了孕胴的分泌，促使排卵率上升[6-7]，這稱為FECB突變。目前研究表明，BMPR-IB基因的FECB突變位點是Booroola Merino羊、劍橋羊[8]、小尾寒羊[9]等的多胎主效基因。有研究證實，BMPR-IB基因的mRNA表達水平與蒙古羊雙羔有關(guān)，但并非蒙古羊雙羔的主效基因，可能與雙羔性狀的主效基因或QTL相連鎖[10]。另有研究證明，BMPR-IB基因突變與綿羊的繁殖性狀密切相關(guān)[9]。目前對于BMPR-IB基因4個造成氨基酸變化的突變位點研究較多，而對于18個未造成氨基酸變化的突變位點報道較少。

本試驗以相同飼養(yǎng)管理條件下同齡已有產(chǎn)羔記錄的蒙古羊(單胎母羊和雙胎母羊)、無角陶賽特羊(單胎母羊和雙胎母羊)、小尾寒羊(多胎母羊)為試驗材料，采用PCR-SSCP技術(shù)結(jié)合DNA直接測序的方法，對BMPR-IB基因第7外顯子多態(tài)性進行檢測與分析，運用有互作的最小二乘模型對該基因多態(tài)性與不同產(chǎn)羔數(shù)綿羊(單羔蒙古羊、雙羔蒙古羊、單羔無角陶賽特羊、雙羔無角陶賽特羊和多羔小尾寒羊)進行相關(guān)性分析，以期在該基因中找到與產(chǎn)羔性狀相關(guān)的遺傳標記位點，為綿羊產(chǎn)羔性狀標記的輔助選擇提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

試驗所需無角陶賽特羊(單胎、雙胎母羊各60只)由甘肅省蘭州市榆中縣奉特科技有限公司種羊場提供，小尾寒羊(多胎母羊62 只)和蒙古羊(單胎母羊57 只，雙胎母羊55只)由甘肅臨洮華嘉牧業(yè)有限公司提供，供試羊只年齡均為3～4歲、產(chǎn)羔胎次2～3胎的成年經(jīng)產(chǎn)母羊。頸靜脈采集試驗羊血樣，ACD抗凝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｔ囼炛兴枰闹饕噭┌ǎ旱鞍酌窴、PCRTaq預(yù)混酶、dNTP、PCR 產(chǎn)物回收試劑盒、瓊脂糖、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨等，均由上海生工生物工程公司提供。

1.2方法

1.2.1綿羊基因組DNA的提取參照文獻[11]以及本課題組改進的常規(guī)酚-氯仿抽提法提取綿羊血液基因組DNA。

1.2.2引物設(shè)計和PCR 擴增參照GenBank 中綿羊BMPR-IB基因序列(登錄號：NM_001009431.1)，利用Primer 5.0 設(shè)計引物，擴增BMPR-IB基因外顯子7序列，預(yù)期產(chǎn)物長度為304 bp。引物由上海生工生物工程公司合成，序列如下:F 5′-TCTTGGGCTTCATTGCTGCCGAT-3′，R 5′-TAAACTTAACAGCCAAGCCCAGGTC-3′。

PCR 擴增體系為25 μL，包括PCRTaq預(yù)混酶0.5 μL，ddH2O 19.0 μL，10 pmol/L 引物1.0 μL(上、下游各0.5 μL)，dNTP 1.0 μL，10×PCR Loading Buffer 2.5 μL，100 ng/μL的DNA模板1.0 μL。PCR擴增條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，56.0 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃延伸10 min，30 個循環(huán)；4 ℃保存。取PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3SSCP分析取3 μL PCR產(chǎn)物和7 μL上樣緩沖液(購于SIGMA公司)振蕩混勻，98 ℃變性10 min，冰浴10 min， 然后于110 V電壓下在14%非變性聚丙烯酰胺Acr∶bis(39∶1)凝膠中電泳80 min，電泳結(jié)束后凝膠銀染。

1.2.4產(chǎn)物回收與測序根據(jù)SSCP分析結(jié)果，挑選出不同帶型的PCR產(chǎn)物各4個，用2%的瓊脂糖凝膠進行檢測，利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收，并將回收后的產(chǎn)物送至上海生工生物工程公司進行測序。

1.3統(tǒng)計與分析

BLAST網(wǎng)站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)結(jié)合BioEdit、Chromas2和MEGA 5.05軟件進行序列翻譯及比對分析；Popgene Version 1.32 生物軟件計算多態(tài)信息含量(PIC)、等位基因頻率、基因型頻率、遺傳雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)；利用SAS 9.0軟件對綿羊BMPR-IB基因第7外顯子的多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)進行相關(guān)性分析。

2結(jié)果與分析

2.1綿羊BMPR-IB基因第7外顯子的PCR擴增

圖1結(jié)果表明，擴增產(chǎn)物片段與目標片段長度一致(304 bp)，且特異性良好，可直接用于SSCP分析。

圖 1　綿羊BMPR-IB基因第7外顯子的PCR擴增結(jié)果(304 bp)

2.2綿羊BMPR-IB基因第7外顯子的SSCP分析

對擴增產(chǎn)物進行SSCP分析，結(jié)果(圖2)出現(xiàn)2種帶型(基因型)，分別定義為野生型AA型和突變型AB型。

圖 2　綿羊BMPR-IB基因第7外顯子擴增片段的SSCP分析

2.3綿羊BMPR-IB基因第7外顯子的測序分析

根據(jù)PCR-SSCP結(jié)果，挑選不同帶型的PCR產(chǎn)物各4份，經(jīng)回收純化后進行測序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型(AA型)相比，突變型(AB型)個體中BMPR-IB基因第864位點出現(xiàn)T和C的雜合，密碼子由UCA變?yōu)閁CG(兩者均編碼絲氨酸)(圖3)。

圖 3　綿羊BMPR-IB基因第7外顯子AA型和AB型測序結(jié)果比較

2.4綿羊BMPR-IB基因外顯子7的群體遺傳學(xué)分析

供試的294個樣本的PCR-SSCP檢測結(jié)果(表1)表明，無角陶賽特羊(單胎母羊和雙胎母羊)、蒙古羊(單胎母羊和雙胎母羊)和小尾寒羊(多胎母羊)的優(yōu)勢基因型均為AA型，優(yōu)勢等位基因均為A基因。群體遺傳多樣性計算結(jié)果(表2)表明，無角陶賽特單胎母羊和蒙古羊(單胎母羊和雙胎母羊)屬于中度多態(tài)(0.250.05)。

表 1　綿羊BMPR-IB基因第7外顯子的基因型和基因型頻率

注： AA型為野生型，AB型為突變型；突變型等位基因為B，野生型等位基因為A。

Note：AA is wild-type ofBMPR-IBgene exon7,AB is mutation-type ofBMPR-IBgene exon7；Mutant allele forBMPR-IBgene (B),wild type allele forBMPR-IBgene (A).

表 2　綿羊BMPR-IB基因第7外顯子的遺傳多樣性指數(shù)

2.5不同產(chǎn)羔類型綿羊基因型分布的顯著性檢驗

采用SAS 9.0 軟件對BMPR-IB基因第7外顯子AB基因型在不同產(chǎn)羔類型綿羊中的分布差異進行顯著性檢驗，結(jié)果(表3)表明：AB基因型分布在無角陶賽特羊單胎母羊與無角陶賽特羊雙胎母羊之間、無角陶賽特羊雙胎母羊與蒙古羊單胎母羊之間以及蒙古羊單胎母羊與小尾寒羊多胎母羊之間差異顯著(P<0.05)，在無角陶賽特羊單胎母羊與蒙古羊雙胎母羊之間、無角陶賽特羊單胎母羊與小尾寒羊多胎母羊之間以及蒙古羊單胎母羊與蒙古羊雙胎母羊之間差異極顯著(P<0.01)；在無角陶賽特羊單胎母羊與蒙古羊單胎母羊之間、無角陶賽特羊雙胎母羊與蒙古羊雙胎母羊之間、無角陶賽特羊雙胎母羊與小尾寒羊多胎母羊之間以及蒙古羊雙胎母羊與小尾寒羊多胎母羊之間差異不顯著(P>0.05)。

表 3　AB基因型在不同產(chǎn)羔類型綿羊中分布差異的T檢驗結(jié)果

注：aa代表差異不顯著(P>0.05)，ab代表差異顯著(0.01

Note:aa indicates no significant difference (P>0.05),ab indicates significant difference (0.01

2.6綿羊BMPR-IB第7外顯子多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)性

2.6.1方差分析就綿羊品種、基因型及品種與基因型互作對綿羊產(chǎn)羔數(shù)的影響進行方差分析，結(jié)果表明，不同品種個體之間F=238.82，P<0.000 1，差異極顯著(P<0.01)；不同基因型個體之間F=9.07，P=0.000 6<0.01，差異極顯著(P<0.01)；不同品種與基因型互作的F=2.19，P=0.113 4>0.05，差異不顯著(P>0.05)。說明綿羊品種和基因型均對產(chǎn)羔數(shù)有顯著影響，而二者的互作效應(yīng)對產(chǎn)羔數(shù)影響不顯著。

2.6.2最小二乘分析(1)不同品種間最小二乘分析結(jié)果。無角陶賽特羊、蒙古羊和小尾寒羊的產(chǎn)羔數(shù)之間最小二乘均數(shù)(標準誤)分別為1.549 7(0.044 9)，1.580 1(0.046 4)和3.000 0(0.057 2)。多重比較結(jié)果顯示，無角陶賽特羊與蒙古羊之間產(chǎn)羔數(shù)差異不顯著(P=0.638 5>0.05)，無角陶賽特羊與小尾寒羊之間、蒙古羊與小尾寒羊之間產(chǎn)羔數(shù)差異極顯著(P<0.01)。另外，小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)最多，蒙古羊次之，無角陶賽特羊最低。

(2)不同基因型間最小二乘分析結(jié)果。AA型和AB型個體產(chǎn)羔數(shù)的最小二乘均數(shù)(標準誤)分別為1.956 7(0.031 6)和2.129 9(0.048 1)。多重比較結(jié)果顯示，不同基因型個體間P=0.002 8，差異極顯著(P<0.01)。

(3)不同品種與基因型互作效應(yīng)的最小二乘分析結(jié)果和多重比較結(jié)果(表4)。

表 4　品種與基因型互作效應(yīng)在不同產(chǎn)羔類型綿羊中分布差異的T檢驗結(jié)果

注：D×AA.無角陶賽特羊×AA型；D×AB.無角陶賽特羊×AB；M×AA.蒙古羊×AA型；M×AB.蒙古羊×AB型；S×AA.小尾寒羊×AA型；S×AB.小尾寒羊×AB。

Note：D×AA indicates Dorset ewes and AA genotype;D×AB indicates Dorset ewes and AB genotype;M×AA indicates Mongolia ewes and AA genotype;M×AB indicates Mongolia ewes and AB genotype;S×AA indicates Small Tail Han ewes and AA genotypes;S×AB indicates Small Tail Han ewes and AB genotype.

3個綿羊品種(無角陶賽特羊、蒙古羊和小尾寒羊)和2種基因型(AA型和AB型)共有6種互作效應(yīng)，互作效應(yīng)的最小二乘均數(shù)分別為：無角陶賽特羊×AA型(D×AA，下同)為1.443 2，無角陶賽特羊×AB(D×AB)為1.656 3，蒙古羊×AA型(M×AA)為1.426 8，蒙古羊×AB型(M×AB)為 1.733 3，小尾寒羊×AA型(S×AA)為3.000 0，小尾寒羊×AB(S×AB)為3.000 0。不同品種與基因型互作效應(yīng)的多重比較結(jié)果(表4)表明，D×AA與D×AB、D×AB與M×AA、M×AB與S×AA間差異顯著(P<0.05)；D×AA與M×AA、D×AB與M×AB間差異不顯著(P>0.05)；D×AA與M×AB、M×AA與M×AB、D×AA與S×AA、D×AB與S×AA、M×AA與S×AA、D×AA與S×AB、D×AB與S×AB、M×AA與S×AB、M×AB與S×AB、S×AA與S×AB間差異極顯著(P<0.01)。

3討論

3.1BMPR-IB基因群體的遺傳學(xué)分析

近年來，國內(nèi)外學(xué)者對于綿羊BMPR-IB基因在編碼區(qū)第746位點 (A→G)突變與綿羊多胎性狀的相關(guān)性進行了大量的研究，并且確定FECB基因為Booroola Merino羊、劍橋羊、小尾寒羊等的多胎主效基因[6]；也有學(xué)者以綿羊FECB基因為雙羔候選基因，從單核苷酸多態(tài)性、mRNA的表達差異方面對蒙古羊和灘羊產(chǎn)羔性狀進行了研究[12-13]；而對于綿羊其他突變位點多態(tài)性與繁殖性狀相關(guān)性的研究報道比較少。本試驗利用PCR-SSCP技術(shù)結(jié)合DNA直接測序的方法，分析單羔蒙古羊、雙羔蒙古羊、單羔無角陶賽特羊、雙羔無角陶賽特羊和多羔小尾寒羊BMPR-IB基因第7外顯子多態(tài)性與綿羊產(chǎn)羔性狀的關(guān)聯(lián)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)供試的294個樣本只檢測到AA型和AB型2種基因型，即AB基因型在BMPR-IB基因第864位點出現(xiàn)了T和C的雜合，沒有發(fā)現(xiàn)突變純合體(BB型個體)。造成這種情況的原因可能是：①羊只中存在BB基因型，但是RCR-SSCP和DNA測序不適用于無角陶賽特羊、蒙古羊和小尾寒羊BMPR-IB基因第7外顯子的檢測，或者是B等位基因頻率過低，所檢測羊只數(shù)量少，沒有能夠檢測到BB型個體；②羊只中不存在BB基因型，可能是B等位基因為隱形致死基因，BB型個體不能存活。這與Davis[14]的研究結(jié)果相似。

通過χ2適合性檢驗表明，無角陶賽特羊、蒙古羊和小尾寒羊均處于Hardy-weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)，說明試驗羊只已經(jīng)形成了適應(yīng)各自生存環(huán)境的遺傳特性，該突變位點在所在群體內(nèi)能夠穩(wěn)定遺傳。所有羊只PIC值均低于0.5，說明BMPR-IB基因第7外顯子多態(tài)性不高，遺傳變異不大，其中在無角陶賽特羊單胎母羊、蒙古羊單胎母羊和蒙古羊雙胎母羊中，PIC值大于0.25，而無角陶賽特羊雙胎母羊和小尾寒羊多胎母羊的PIC值小于0.25，說明此位點作為性狀與標記間連鎖分析的候選標記位點，對提高綿羊繁殖力的標記輔助選擇和育種工作有一定的可能性。

3.2不同基因型與母羊產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)性

本試驗在綿羊BMPR-IB基因第864位點發(fā)現(xiàn)了T和C的雜合，雖然該位點突變沒有造成氨基酸序列的變化，但該位點突變后，AB型個體在無角陶賽特羊單胎母羊與無角陶賽特羊雙胎母羊、無角陶賽特羊雙胎母羊與蒙古羊單胎母羊、蒙古羊單胎母羊與小尾寒羊多胎母羊之間差異顯著(P<0.05)，在無角陶賽特羊單胎母羊與蒙古羊雙胎母羊、小尾寒羊多胎母羊，蒙古羊單胎母羊與蒙古羊雙胎母羊之間差異極顯著(P<0.01)。本試驗中BMPR-IB基因第864位點的突變沒有造成氨基酸序列的變化，但不同基因型在不同繁殖力母羊群體中的分布有一定的差異。造成這種現(xiàn)象的原因可能是：①BMPR-IB基因864位點的突變雖然為同義突變，但是密碼子由UCA變成了UCG，UCG為稀有密碼子，由于稀有密碼子的使用會影響翻譯速度，進而影響蛋白質(zhì)的折疊，從而影響其功能的發(fā)揮；②BMPR-IB基因864位點的突變導(dǎo)致mRNA表達量減少，或者是在mRNA修飾時特定等位基因差異影響氨基酸的拼接、處理或者翻譯調(diào)控；③BMPR-IB基因864位點的突變可能使供體本來的剪切位點失活，從而導(dǎo)致過早終止密碼子或外顯子遺漏，形成多個剪切變異體，從而在特定條件下影響顆粒細胞的分化或者卵泡的發(fā)育；④BMPR-IB基因864位點的同義突變可能與常規(guī)不同義突變位點連鎖不平衡，這與Kimchi-Sarfaty等[15]的研究結(jié)果相似。因此，BMPR-IB基因第864位點的突變是否可以作為控制綿羊繁殖力的潛在遺傳標記位點，需要進一步加大樣本量及綿羊品種數(shù)量進行深入研究。

4結(jié)論

1)對試驗綿羊共294個樣本的BMPR-IB基因第7外顯子進行多態(tài)性檢測，在BMPR-IB基因第864位點發(fā)現(xiàn)有T和C的雜合出現(xiàn)，但沒有發(fā)現(xiàn)突變純合體(BB型個體)。

2)BMPR-IB基因編碼區(qū)第864位點的突變在不同產(chǎn)羔性狀綿羊中的分布存在顯著差異，其是否可以作為控制綿羊繁殖力的潛在遺傳標記位點，需進一步探索。

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Correlation between polymorphism ofBMPR-IBgene exon7 and lambing performance of sheep

JIA Jian-lei,ZHANG Li-ping,DING Qiang,YANG Zhi-wen

(FacultyofAnimalSci-Tech,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou,Gansu730070,China)

Abstract:【Objective】 This study aimed to explore the correlation between polymorphism of BMPR-IB gene exon7 and lambing performance in sheep and find locus to control reproduction of sheep.【Method】 The breeding ewes including Mongolia ewes,Small Tail Han ewes and Poll Dorest ewes with different lambing performances (e.g.multiples,twins and singletons) were selected for studying polymorphism of BMPR-IB gene exon7 detected by PCR-SSCP and DNA sequencing.【Result】 AA and AB genotypes were found in tested ewes.AB genotype had C→T mutation in coding region of 864 with heterozygous T/C.Genotype AA was dominant genotype and allele A was dominant allele in all samples.All sheep were in Hardy-weinberg equilibrium based on χ2 test.There were significant differences in distribution of different genotypes of BMPR-IB gene exon7 in different sheep types.Least squares analysis showed that there was correlation between polymorphism of BMPR-IB gene exon7 and lambing performance.【Conclusion】 There was correlation between polymorphism of BMPR-IB gene exon7 and lambing performance of sheep.The mutation in locus 846 of BMPR-IB gene exon7 could be considered as a potential locus to control reproduction of sheep.

Key words:sheep;BMPR-IB gene exon7;PCR-SSCP;DNA sequencing;polymorphism;lambing performance

[文章編號]1671-9387(2016)01-0007-07

[中圖分類號]S826.2

[文獻標志碼]A

[作者簡介]賈建磊(1987-)，男，山東萊州人，在讀博士，主要從事羊遺傳育種與繁殖研究。E-mail：jianlei_1@sina.com[通信作者]張利平(1962-)，女，甘肅隴南人，教授，博士，主要從事羊遺傳育種與繁殖研究。E-mail：zhangliping@gsau.edu.cn

[基金項目]甘肅省農(nóng)牧廳生物技術(shù)專項(GNSW-2012～24)；國家自然科學(xué)基金(地方基金)項目(31260547)

[收稿日期]2014-04-25

DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時間:2015-12-0214:2510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.01.002

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20151202.1425.004.html