薛永康+王新莊+閆躍飛+楊文華+任小麗+閆磊

摘要：奶牛乳房炎是造成奶牛業(yè)損失最主要的原因。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，奶牛乳房炎的診斷方法也有了長足的發(fā)展。特別是現(xiàn)代生物技術(shù)在微生物檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用之后，奶牛乳房炎的診斷周期大大縮短、操作簡單快捷、檢測(cè)成本降低、靈敏度提高。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)在奶牛乳房炎主要病原診斷中的應(yīng)用也極大地推動(dòng)了奶牛乳房炎檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展。

關(guān)鍵詞：奶牛；乳房炎；診斷方法；PCR；基因芯片；LAMP

中圖分類號(hào)：S858.23 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：1007-273X（2016）08-0015-03

奶牛乳房炎（Bovine mastitis）是由病原微生物感染而引起的乳房組織及乳頭發(fā)炎的一種疾病，是造成奶牛業(yè)經(jīng)濟(jì)損失最主要的原因[1]。在中國，奶牛乳房炎每年造成的經(jīng)濟(jì)損失無法估量。奶?；疾『?，不但造成產(chǎn)乳量和乳品質(zhì)的下降，而且，還可能造成奶牛產(chǎn)后發(fā)情期和妊娠期延長，甚至危及人類健康。

1 概述

奶牛乳房炎，又稱奶牛乳腺炎，是一種由病原微生物感染、機(jī)械性傷害、物理性損傷和化學(xué)物質(zhì)刺激所引起的較為復(fù)雜的奶牛乳腺綜合征疾病，也是奶牛發(fā)病率最高、造成損失最嚴(yán)重的疾病之一。長期以來，該病一直困擾著中國乃至世界乳業(yè)發(fā)展，它不僅引起奶產(chǎn)量下降，而且嚴(yán)重影響乳的品質(zhì)，甚至危害到人類的健康。美國乳房炎委員會(huì)（NMC）在1978年，根據(jù)乳汁和乳房的肉眼可見變化情況，將乳房炎分為隱性乳房炎和臨床型乳房炎兩種，其中隱性乳房炎占總發(fā)病的77%～79%，臨床型乳房炎占奶?？偘l(fā)病的21%～23%。

1.1 臨床型乳房炎

臨床型乳房炎癥狀明顯，輕者表現(xiàn)為乳房皮膚發(fā)紅、乳汁稀薄，有少量絮狀物，用手觸摸患牛乳房，患牛乳房疼痛不明顯。重者表現(xiàn)為精神萎靡，食欲減退，體溫升高，產(chǎn)奶量明顯下降，乳汁稀薄且乳汁內(nèi)混有大量絮狀物、凝乳塊或血液，乳區(qū)質(zhì)地硬、腫脹，手觸患牛疼痛明顯。因此，臨床型乳房炎根據(jù)臨床表現(xiàn)的癥狀，極易做出判斷。

1.2 隱性乳房炎

隱性乳房炎不表現(xiàn)臨床癥狀，乳汁也無肉眼可見的變化，只是產(chǎn)奶量下降，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)乳汁略偏堿性，體細(xì)胞數(shù)多達(dá)5×105 個(gè)/mL以上。

2 診斷

奶牛乳房炎要早診斷、早治療，以降低養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)損失。

2.1 病原微生物檢查

乳房炎主要由多種非特定的病原微生物引起，如細(xì)菌、真菌、病毒等。較常見的有27種，其中細(xì)菌12種，霉形體2種，真菌和病毒7種。病原微生物的分離培養(yǎng)和鑒定是實(shí)驗(yàn)室診斷奶牛乳房炎病原的一種重要方法，它不僅可以鑒別病原種類也能確定細(xì)菌的數(shù)量。首先將無菌采集的新鮮奶樣接種于培養(yǎng)基，經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)、乳汁涂片、革蘭氏染色、鏡檢等反復(fù)純化病原菌。然后，對(duì)已經(jīng)純化的細(xì)菌用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行鑒定。選擇性培養(yǎng)基的應(yīng)用，也提高了病原分離鑒定的效率。如改良愛德華培養(yǎng)基（Modified Edwards Medium Base，MEM）用于選擇性分離鏈球菌、卻普曼瓊脂（Chapman Agar，CA）用于選擇性分離金黃色葡萄球菌、麥康凱培養(yǎng)基（Mac Conkey Agar，MCA）用于選擇性分離腸桿菌、PPLO培養(yǎng)基（Pleuropneumonia-Like Organisms，PPLO）用于選擇性分離支原體、腦心浸液培養(yǎng)基（Brian Heart Infusion，BHI）和血平板培養(yǎng)基（Blood Agar，BA）用于病原菌盲篩。

病原微生物分離鑒定法只能根據(jù)檢測(cè)出病原菌的種類、數(shù)量對(duì)乳房炎發(fā)病情況進(jìn)行大致判斷。從分離培養(yǎng)到利用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定需24 h才能確診，該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)操作人員要求較高且檢測(cè)速度較慢。

2.2 乳汁體細(xì)胞檢測(cè)

奶牛發(fā)生乳房炎后，白細(xì)胞數(shù)顯著增加，這是因?yàn)樵谌橄偈艿郊?xì)菌感染后，細(xì)菌的代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)大量的多形核白細(xì)胞（PMN）進(jìn)入乳腺細(xì)胞，隨后損傷脫落的上皮細(xì)胞也進(jìn)入乳中，致使乳汁中的體細(xì)胞增加。所以，奶牛是否患有隱性乳房炎可以通過檢測(cè)乳汁中體細(xì)胞數(shù)目來判斷。

國外專家發(fā)明了直接顯微鏡計(jì)數(shù)法來推斷體細(xì)胞數(shù)目，明確規(guī)定乳汁中體細(xì)胞數(shù)超過5×105個(gè)/mL可診斷為乳房炎。但是，中國農(nóng)科院中獸醫(yī)研究所根據(jù)試驗(yàn)，提出治療乳房炎判定療效標(biāo)準(zhǔn)，每毫升乳汁中細(xì)胞數(shù)降至1×106個(gè)/mL以下就可定為正常。

CMT（加州乳房炎測(cè)試法），在CMT試液的作用下，乳汁細(xì)胞中的脂類物質(zhì)發(fā)生乳化，乳汁細(xì)胞被破壞，釋放出的DNA發(fā)生沉淀或凝塊，根據(jù)其量的多少來間接判定乳中細(xì)胞數(shù)的多少而達(dá)到診斷的目的方法[2]。有學(xué)者在現(xiàn)有各種診斷方法的比較試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采取各種不同新合成的國產(chǎn)表面活性劑組成多種配方進(jìn)行篩選，選定了SMT-Ⅰ，SMT-Ⅱ，SMT-Ⅲ3種隱性乳房炎診斷液。試驗(yàn)結(jié)果表明，SMT系列診斷液反應(yīng)敏感，尤其是SMT-Ⅰ試液，只需5s即可顯示結(jié)果。其他間接檢驗(yàn)，有2%苛性鈉凝乳法和過氧化氫酶法。過氧化氫酶法是通過檢測(cè)白細(xì)胞中的過氧化氫酶來推斷乳中白細(xì)胞含量的。

2.3 乳汁pH檢查

泌乳奶牛乳汁的正常pH在6.2～6.6之間，且堿性會(huì)隨著乳房炎癥狀的加劇而升高。原因在于牛奶pH值的變化與體細(xì)胞和炎性細(xì)胞的含量呈正相關(guān)，隨著炎癥反應(yīng)的加重，血管滲透性增加，導(dǎo)致牛乳pH逐漸升高，因此可以通過檢測(cè)乳汁pH值的方法來檢測(cè)乳房炎[3，4]。現(xiàn)在這種診斷方法已在美、法、德等國家多個(gè)牧場作為檢測(cè)和控制奶牛乳房炎的重要措施進(jìn)行推廣。在國內(nèi)，研究人員研制的奶牛乳房炎pH試紙已經(jīng)在牧場應(yīng)用和推廣。日本研制出以乳汁中分離出的乳清為檢測(cè)樣品的BPB濾紙片診斷乳房炎的方法。有關(guān)專家對(duì)BPB法進(jìn)行進(jìn)一步改進(jìn)，利用試驗(yàn)證明，全乳BPB診斷法的準(zhǔn)確性可靠而且靈敏性較高。

2.4 乳汁導(dǎo)電性檢查

奶牛乳腺有炎癥后，乳腺上皮細(xì)胞造乳糖功能下降，血-乳屏障的滲透性改變，致使血液成分滲入乳汁的能力加強(qiáng)，乳汁中的Na+、Cl-、K+和Ca2+進(jìn)入乳汁，使乳汁電導(dǎo)率值升高[5]。乳汁電導(dǎo)率法是通過檢測(cè)乳汁的電導(dǎo)率的變化來監(jiān)測(cè)奶牛乳房炎的。研究表明，奶牛乳房炎乳汁的電導(dǎo)率均高于正常值，但在不同的個(gè)體及不同的飼養(yǎng)管理狀況下，乳汁的電導(dǎo)率變化較大，因此，判斷隱性乳房炎的關(guān)鍵是確定不同牛群正常乳汁電導(dǎo)率的閾值[6]。

1983年，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)郝慶銘教授研制出同類型奶牛乳房炎診斷儀，命名為SX-IE型。隨后，他又研制出具有國際領(lǐng)先水平的ZRD（以前稱CN）型乳牛乳腺炎電子檢測(cè)儀。ZRD型乳牛乳腺炎電子檢測(cè)儀重量輕，體積小，可在牛舍旁進(jìn)行測(cè)定。相信隨著科技的發(fā)展，畜牧科研人員一定能研究出診斷更為準(zhǔn)確，便于操作和掌握的新方法，為奶牛養(yǎng)殖戶做出貢獻(xiàn)。

2.5 酶檢驗(yàn)法

酶檢測(cè)法是目前國內(nèi)外奶牛乳房炎診斷方法的研究熱點(diǎn)之一。乳房炎會(huì)導(dǎo)致乳汁中一些酶的生物活性升高，例如乳酸脫氫酶（LDH）、黃嘌呤氧化酶L8J、過氧化氫酶、N-乙?；?β-D-氨基葡萄糖苷酶、β葡糖苷酸和乳酸過氧化氫酶（LP）等，其活性與SCC的相關(guān)性很高[7]。其中一些酶（如過氧化氫酶、NAGnse和抗胰蛋白酶）的活性變化特點(diǎn)已用于診斷奶牛乳房炎及評(píng)價(jià)奶牛乳房炎的健康狀況[8]。

2.6 PCR檢測(cè)

PCR技術(shù)檢測(cè)法是一種在分子水平分離和檢測(cè)乳房炎主要病原的方法，基于細(xì)菌rRNA操縱元 16S rRNA和23S rRNA間隔區(qū)序列的PCR技術(shù)作為一種新的細(xì)菌分類和鑒定方法[9]得到了廣泛的應(yīng)用，并取得了較好的應(yīng)用效果。該方法優(yōu)點(diǎn)是對(duì)某些細(xì)菌不經(jīng)過培養(yǎng)過程，直接用奶樣就可以進(jìn)行細(xì)菌學(xué)鑒定，減少了病原菌間的所需的時(shí)間和費(fèi)用，經(jīng)濟(jì)有效、快速、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)，具有重要的應(yīng)用價(jià)值[10，11]。張普瑞等[12]在對(duì)金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、大腸桿菌3種主要的乳房炎致病菌建立多重PCR檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)多重PCR方法的特異性為100%，最低檢測(cè)濃度為1.25×103 CFU/mL，充分證明了該方法具有快速、準(zhǔn)確和特異性的優(yōu)點(diǎn)。Riffon等[13]研制出用PCR方法檢測(cè)誘發(fā)乳房炎的6種病原菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌和副乳房鏈球菌）的技術(shù)。

2.7 被毛微量元素檢測(cè)法

田鳳林等[14]在研究微量元素含量與乳房炎的相關(guān)性時(shí)發(fā)現(xiàn)患有乳房炎的奶牛乳汁中Cu、Fe、Co和Zn含量顯著低于正常乳汁（P<0.05或P<0.01），乳房炎與微量元素含量具有相關(guān)性。還有研究發(fā)現(xiàn)隱性乳房炎奶牛被毛中的Zn、Co、Mn的含量比正常牛只有一定相關(guān)性，隱性乳房炎病牛被毛中Zn、Ca顯著低于正常牛被毛中含量。但是，由于個(gè)體差異、營養(yǎng)、季節(jié)等影響，該診斷方法并不是非常準(zhǔn)確，還有待進(jìn)一步地研究。

2.8 蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)法

蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics）是基因組學(xué)的重要組成部分，在功能基因組學(xué)研究中占據(jù)重要地位，近年來對(duì)白細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)、差異蛋白組學(xué)、病原微生物蛋白組學(xué)等的研究有了突破性的進(jìn)展，使得蛋白質(zhì)組學(xué)成為診斷乳房炎的一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。

2.9 基因芯片檢測(cè)法

基因芯片技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)多種病原微生物的同時(shí)檢測(cè)，大大縮短了奶牛乳房炎的診斷時(shí)間，使那些不能培養(yǎng)或很難培養(yǎng)的病原微生物也能被快速檢出[15]。邢會(huì)杰等[16]建立了一套基于16S rRNA的檢測(cè)奶牛乳房炎4種主要致病菌（無乳鏈球菌、肺炎克雷伯菌、奇異變形桿菌、金黃色葡萄球菌）的基因芯片方法，通過對(duì)雜交條件進(jìn)行優(yōu)化，研制了與之相應(yīng)的價(jià)格低廉、易于推廣的小型操作平臺(tái)，其檢測(cè)靈敏度是PCR檢測(cè)的10倍。目前，國外已有商品化的奶牛乳房炎專用基因芯片，它可以同時(shí)檢出包含7種導(dǎo)致奶牛乳房炎的細(xì)菌，即金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、乳房鏈球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、牛鏈球菌和牛支原體，在組裝的試劑盒中包括了能從DNA提取到的基因芯片的所有試劑，使檢測(cè)程序標(biāo)準(zhǔn)化，并且可以在6 h內(nèi)得到檢測(cè)結(jié)果[17]。2009年，李守軍等[18]以大腸桿菌16S rRNA保守區(qū)為基底序列，在6種奶牛乳房炎主要致病菌（無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、大腸桿菌、克雷伯氏菌、變形桿菌和金黃色葡萄球菌）的可變區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)了特異性寡核苷酸雜交探針，發(fā)明了奶牛乳房炎主要致病菌的檢測(cè)基因芯片，該技術(shù)操作步驟簡單，便于推廣使用。

2.10 LAMP快速分子診斷法

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）技術(shù)是在體外等溫條件下進(jìn)行的、一種新型的用于擴(kuò)增特異性核酸片段的方法，為2000年日本榮研株式會(huì)社學(xué)者Notomi等人所發(fā)明。該反應(yīng)只需耍將鏈置換型DNA合成酶、引物、基因模板、反應(yīng)液共同置于一定的溫度條件下（60～65 ℃），經(jīng)一個(gè)反應(yīng)步驟即可完成。該技術(shù)突破了傳統(tǒng)的PCR技術(shù)需耍多個(gè)循環(huán)變溫，即每個(gè)循環(huán)進(jìn)行熱變性以獲得單鏈DNA模板、反復(fù)升溫降溫實(shí)現(xiàn)退火、延伸的耗時(shí)過程，LAMP技術(shù)實(shí)現(xiàn)并完成了在恒溫條件下進(jìn)行核酸DNA的連續(xù)快速擴(kuò)增的目的，且具有相較于普通PCR更為高效的擴(kuò)增效率與靈敏度。

由于LAMP兩對(duì)引物在設(shè)計(jì)時(shí)針對(duì)于靶基因DNA鏈上的6個(gè)特異性的區(qū)域位點(diǎn)，因而極大提高了LAMP擴(kuò)增反應(yīng)的特異性，且只需根據(jù)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的有無、即可確認(rèn)靶基因序列是否存在。LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物可通過傳統(tǒng)常規(guī)的核酸電泳、焦磷酸鎂濁度檢測(cè)、簡易直視的熒光目測(cè)比色進(jìn)行結(jié)果判斷。LAMP技術(shù)簡單、快速、特異性強(qiáng)，作為嶄新的核酸擴(kuò)增方法，擺脫了昂貴復(fù)雜的儀器設(shè)備和反應(yīng)試劑的限制，反應(yīng)時(shí)間短，檢測(cè)結(jié)果判斷簡單，十分利于在基層機(jī)構(gòu)推廣與應(yīng)用。目前，以LAMP技術(shù)為代表的分子快速診斷技術(shù)已日漸成熟，并已經(jīng)在人類生命醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用，但在動(dòng)物疫病診斷與防控中的應(yīng)用目前尚不多見，發(fā)展?jié)摿薮蟆?/p>

目前，國內(nèi)已經(jīng)有了商品化的基于LAMP技術(shù)基因芯片，該芯片上有24個(gè)反應(yīng)室，其中包含16種引起奶牛乳房炎的主要病原菌、2種耐藥基因、陰陽性對(duì)照各1個(gè)以及4個(gè)空白室。該芯片采用人工提取核酸，機(jī)器校準(zhǔn)核酸濃度，實(shí)時(shí)濁度儀監(jiān)測(cè)反應(yīng)室濃度變化等方法來快速鑒別診斷病原菌，整個(gè)過程僅需4 h。

3 小結(jié)

奶牛乳房炎發(fā)病急，造成損失快，如何能夠快速準(zhǔn)確地診斷該病一直是奶牛業(yè)的首要難題?，F(xiàn)階段降低奶牛乳房炎的發(fā)生的主要措施有：抗病奶牛選育、提高飼養(yǎng)管理和及時(shí)地診斷治療。其中抗病奶牛選育是一個(gè)長期的過程，目前有不少學(xué)者在研究預(yù)防乳房炎的疫苗，雖然有一定效果，但并不理想[15]。因此，提高飼養(yǎng)管理和及時(shí)診斷治療成為目前控制乳房炎發(fā)病的關(guān)鍵。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，PCR、LAMP等分子診斷技術(shù)作為一種檢測(cè)方法在奶牛乳房炎、尤其是隱性乳房炎上表現(xiàn)出巨大的診斷潛力。應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行早期、快速、準(zhǔn)確地診斷將成為控制奶牛乳房炎的趨勢(shì)，這對(duì)于奶牛乳房炎的診療十分關(guān)鍵，應(yīng)用前景廣闊。

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