彭宏虎,石麗萍,周康仕,陽大慶,3△

(1.湖南醫(yī)藥學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗科,湖南懷化 418000;2.湖南醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，湖南懷化 418000;3.湖南醫(yī)藥學(xué)院檢驗醫(yī)學(xué)院，湖南懷化 418000)

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·論著·

鳥分枝桿菌脂類誘導(dǎo)的人肺泡巨噬細(xì)胞抗結(jié)核免疫反應(yīng)性的改變及機制的初步研究*

彭宏虎1,石麗萍2,周康仕1,陽大慶1,3△

(1.湖南醫(yī)藥學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗科,湖南懷化 418000;2.湖南醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，湖南懷化 418000;3.湖南醫(yī)藥學(xué)院檢驗醫(yī)學(xué)院，湖南懷化 418000)

摘要:目的研究鳥分枝桿菌脂類(MALs)對人肺泡巨噬細(xì)胞抗結(jié)核免疫反應(yīng)性的影響。方法平板計數(shù)法評價MALs對人肺泡巨噬細(xì)胞殺結(jié)核菌效應(yīng)的影響；ELISA檢測腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平；Greisse法檢測一氧化氮(NO)水平。結(jié)果MALs減弱了人肺泡巨噬細(xì)胞對牛結(jié)核分枝桿菌(BCG)的殺滅。MALs刺激后，結(jié)核分枝桿菌純蛋白衍生物(PPD)和干擾素γ(IFN-γ)誘導(dǎo)的人肺泡巨噬細(xì)胞TNF-α和NO的分泌均有所下降。結(jié)論MALs減弱了人肺泡巨噬細(xì)胞對結(jié)核分枝桿菌的免疫反應(yīng)性。

關(guān)鍵詞:鳥分枝桿菌脂類；人肺泡巨噬細(xì)胞；免疫功能

牛結(jié)核分枝桿菌(BCG)疫苗的接種是預(yù)防結(jié)核分枝桿菌感染的一種有效手段，然而在全世界大多數(shù)國家普及接種的現(xiàn)狀下，結(jié)核的發(fā)病率依然居高不下。造成這種現(xiàn)象的原因涉及多個因素，一方面與BCG疫苗中的一些關(guān)鍵基因的丟失有關(guān)。另一方面，也與環(huán)境中普遍存在的非結(jié)核分枝桿菌的誘導(dǎo)有關(guān)。盡管人們對這些已有所研究，但是這些非結(jié)核分枝桿菌究竟通過什么樣的機制來影響機體的抗結(jié)核免疫，仍然有待進一步的研究。鳥分枝桿菌是一種在環(huán)境中存在的主要機會致病菌，其細(xì)胞壁構(gòu)成的特點是具有大量的脂類。目前，對鳥分枝桿菌及其脂類的研究主要集中在其急性感染的致病機制方面，而對它與抗結(jié)核免疫之間的關(guān)系研究很少。研究者前期對小鼠的研究表明，鳥分枝桿菌脂類(MALs)可以影響巨噬細(xì)胞抗結(jié)核免疫反應(yīng)性的改變[1-2],但其對人類細(xì)胞是否也具有類似的效應(yīng)尚不清楚。本研究以人肺泡巨噬細(xì)胞為研究對象，以期闡明MALs對人肺泡巨噬細(xì)胞抗結(jié)核免疫反應(yīng)性的影響，從而為防治結(jié)核感染提供新的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1菌株及培養(yǎng)鳥分枝桿菌93008，大腸桿菌ATCC25922購自中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保存中心，牛結(jié)核分枝桿菌(BCG)購自成都生物制品研究所，其培養(yǎng)方法參照文獻[1]進行。

1.2MALs的提取及鑒定參照文獻[3-4]，采用弗爾徹(Folch)法提取MALs。將鳥分枝桿菌接種至MiddleBrook 7H9 液體培養(yǎng)基(BD公司)中，培養(yǎng)5 d，然后10 000 r/min無菌離心收集培養(yǎng)物，將培養(yǎng)物用兩倍體積左右的無菌水重懸后轉(zhuǎn)移至10 mL血清瓶中，121 ℃，15 min滅活裂解。將上述裂解物移入無菌塑料離心管(同時記錄離心管質(zhì)量)中，-70 ℃凍存24 h。凍存物在低壓冷凍干燥機中干燥48 h，獲得干粉。在干粉中加入20倍體積的氯仿：甲醇(2∶1)溶液，混勻后，在室溫下將整個混合物置于定軌搖床中振搖120 min。離心分離出液相后，用0.2倍體積的0.9%NaCl溶液洗滌。漩渦振蕩，2 000 r/min，5 min低速離心分離出兩相，棄去上層相，用氮氣流吹干底層相，確定質(zhì)量后，加入適量DMSO溶解，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3鱟試劑檢測MALs中內(nèi)毒素水平鱟試劑購自廈門鱟試劑公司，操作按試劑盒說明書進行。具體做法為在無熱原管中分別加入100 μL細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)液或待測樣品。然后每管中均加入100 μL鱟試劑溶液，搖勻，37 ℃孵育。溫育8 min后，加入100 μL顯色基質(zhì)溶液，混勻，37 ℃溫育。溫育6 min后，依次加入偶氮化試劑1溶液、偶氮化試劑2溶液和偶氮化試劑3溶液各500 μL，混勻，室溫靜置5 min，讀取545 nm波長處吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算內(nèi)毒素水平。

1.4人肺泡巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng)和誘導(dǎo)人肺泡巨噬細(xì)胞的分離與培養(yǎng)參考有關(guān)文獻[5]，行支氣管肺泡灌洗術(shù)。收集支氣管肺泡灌洗液,2 000 r/min離心5 min后，棄去上清，加入RPMI 1640培養(yǎng)液(含5%小牛血清)重懸細(xì)胞。將分離后的人肺泡巨噬細(xì)胞按2×105/孔鋪24孔板。分別加入終濃度為1 μg/mL MALs，1 μg/mL大腸桿菌脂類(ELs)， SC(溶劑對照，含0.05‰DMSO)誘導(dǎo)48 h，48 h后加入新鮮的無抗菌藥物的IMDM培養(yǎng)基(含10%小牛血清)恢復(fù)4 h。然后分別加入10 μg/mL PPD(丹麥血清研究所)和100 ng/mL 人重組IFN-γ(Biolegend公司)刺激24 h，離心收集上清液，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5人肺泡巨噬細(xì)胞胞內(nèi)BCG清除試驗將分離得到的人肺泡巨噬細(xì)胞按2×105/孔鋪24孔板。按實驗分組，分別加入終濃度為1 μg/mL MALs，1 μg/mL ELs，SC(含0.05‰DMSO的培養(yǎng)基)，37 ℃，5%CO2孵育48 h后棄去原有培養(yǎng)基，加入新鮮無抗菌藥物的IMDM培養(yǎng)基(含10%小牛血清)孵育4 h。然后在各實驗組中按細(xì)胞∶細(xì)菌=1∶1的比例加入BCG，37 ℃孵育2 h后用無菌PBS洗滌5次，去除胞外BCG，然后置于37 ℃，5%CO2分別培養(yǎng)0、24、48、72 h，于不同時間點加入0.1%Triton X100裂解細(xì)胞，將裂解液轉(zhuǎn)移至無菌EP管，10 000 r/min離心2 min，棄去上清后加入500 μLMiddleBrook 7H9培養(yǎng)液重懸，混勻，10倍倍比稀釋后，接種MiddleBrook 7H11(含10% OADC)平板，37 ℃培養(yǎng)14～21 d，計數(shù)菌落數(shù)。

1.6腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的檢測試劑盒購自Biolegend公司。采用雙抗體夾心ELISA，按試劑盒說明書進行。

1.7一氧化氮(NO)的測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司。采用Griess法，按試劑盒操作說明書進行。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0分析，多組間方差分析用One Way ANOVA檢驗，各組間兩兩比較用LSD檢驗 。菌落計數(shù)用析因設(shè)計的方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1MALs中內(nèi)毒素水平和蛋白成分的檢測提取的MALs中的內(nèi)毒素水平經(jīng)計算為小于0.05 EU/100 μg。SDS-PAGE結(jié)果表明20 μg MALs中未檢出可見的蛋白成分。見圖1、2。

2.2MALs預(yù)處理減弱人肺泡巨噬細(xì)胞對胞內(nèi)BCG的清除見圖3所示，結(jié)果表明，MALs誘導(dǎo)組的人肺泡巨噬細(xì)胞胞內(nèi)BCG的數(shù)量明顯高于ELs組和SC組。提示MALs處理后，人肺泡巨噬細(xì)胞對胞內(nèi)BCG生長的控制能力有所降低。

2.3MALs減弱了結(jié)核分枝桿菌抗原PPD誘導(dǎo)的人肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α和NO的能力見表1所示，與ELs誘導(dǎo)組和SC組比較，MALs預(yù)處理減弱了結(jié)核分枝桿菌抗原PPD誘導(dǎo)的人肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α和NO的能力。

圖1　MALs中的內(nèi)毒素水平

圖2　蛋白成分的鑒定

圖3　MALs誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞對BCG清除

2.4MALs誘導(dǎo)減弱干擾素-γ(IFN-γ)激活人肺泡巨噬細(xì)胞的TNF-α和NO產(chǎn)生見表2所示，與ELs組和SC組相比，MALs誘導(dǎo)組IFN-γ刺激的巨噬細(xì)胞TNF-α和NO的產(chǎn)生明顯降低。結(jié)果提示MALs的誘導(dǎo)減弱了人肺泡巨噬細(xì)胞對IFN-γ的反應(yīng)性。

表1　MALs預(yù)處理后PPD誘導(dǎo)的人肺泡巨噬細(xì)胞

表2　MALs預(yù)處理后IFN-γ誘導(dǎo)的人肺泡巨噬細(xì)胞

3討論

研究者前期對小鼠的研究提示，MALs可以影響巨噬細(xì)胞抗結(jié)核免疫的反應(yīng)性。本研究在此基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)用MALs預(yù)處理人肺泡巨噬細(xì)胞后，巨噬細(xì)胞控制胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌生長的能力有所減弱。這個結(jié)果提示，當(dāng)人們處于低劑量暴露于鳥分枝桿菌時，盡管不會表現(xiàn)出明顯的臨床表現(xiàn)，但卻可能增加機體對結(jié)核分枝桿菌的易感性。此外，MALs預(yù)處理后，人肺泡巨噬細(xì)胞對結(jié)核分枝桿菌抗原PPD及IFN-γ的反應(yīng)性均有所降低，其主要表現(xiàn)在TNF-α、NO的分泌能力下降。目前，大家普遍認(rèn)為TNF-α和NO在抗結(jié)核分支桿菌感染中發(fā)揮著重要的作用，用TNF-α阻斷劑處理后以及TNF-α受體的缺失均可導(dǎo)致機體對結(jié)核分枝桿菌繁殖的控制減弱，從而使機體更為易感[6-7]。因此，MALs誘導(dǎo)的人肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α和NO的能力降低可能是降低人肺泡巨噬細(xì)胞對結(jié)核分枝桿菌控制力的重要原因。

分析產(chǎn)生種現(xiàn)象的原因，研究者推測其可能與細(xì)菌產(chǎn)物引起的免疫細(xì)胞耐受有關(guān)。近年來，對細(xì)胞壁成分誘導(dǎo)耐受的研究主要體現(xiàn)在對炎癥反應(yīng)和細(xì)菌清除的影響。目前大部分研究主要集中在Toll樣受體(TLRs)激動劑，如LPS、PGN、Pam3CSK4和Nod樣受體(NLRs)激動劑，如MDP等[8-9]，而來源于鳥分枝桿菌的脂類能否誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的耐受而改變機體反應(yīng)性，尤其是針對結(jié)核分枝桿菌的反應(yīng)性尚不明確。本研究在這方面初步證實了鳥分枝桿菌的細(xì)胞壁成分——脂類也可以誘導(dǎo)人肺泡巨噬細(xì)胞對結(jié)核分枝桿菌抗原及IFN-γ的免疫耐受。但有意思的是，與本研究不同，肽聚糖(PGN)與LPS誘導(dǎo)的耐受主要表現(xiàn)為降低炎癥反應(yīng)和增強細(xì)菌清除率[10-11]。因此，PGN和LPS誘導(dǎo)的耐受對機體抗感染是有利的，而MALs誘導(dǎo)的人肺泡巨噬細(xì)胞的低反應(yīng)性卻減弱了對結(jié)核分枝桿菌的清除，這有可能增強對人體對結(jié)核感染的易感性。研究者推測存在這種差異的原因可能在于結(jié)核分枝桿菌和其他細(xì)菌的生長和清除機制不同有關(guān)。結(jié)核桿菌等分枝桿菌是一種典型的胞內(nèi)寄生菌，其生長方式是持久地寄生于巨噬細(xì)胞。機體控制和清除結(jié)核分枝桿菌有賴于TNF-α、IFN-γ、ROS和NO等多種生物活性物質(zhì)。通過這些活性介質(zhì)激活巨噬細(xì)胞，從而達到控制感染的目的；而對于葡萄球菌等其他感染的控制，機體更多地依賴中性粒細(xì)胞的功能以及抗體的產(chǎn)生。

本研究中，研究者僅證實了MALs可以導(dǎo)致人肺泡巨噬細(xì)胞對結(jié)核分枝桿菌的反應(yīng)性降低，并初步研究了出現(xiàn)這種現(xiàn)象的機制，然而這種現(xiàn)象所涉及的分子和細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)仍然有待后續(xù)工作進一步闡明。

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Mycobacterium avium-derived lipids attenuate immune response against Mycobacterium in human alveolar macrophages*

PengHonghu1,ShiLiping2,ZhouKangshi1,YangDaqing1,3△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofHunanMedicalCollege,Huaihua,Hunan418000,China;2.CollegeofPharmacy,HunanMedicalCollege,Huaihua,Hunan418000,China;3.LaboratoryMedicineCollege,HunanMedicalCollege,Huaihua,Hunan418000,China)

Abstract:ObjectiveTo evaluate the effects of exposure to MALs on immunity against Mycobacterium tuberculosis in human alveolar macrophages.MethodsPlate counting were used to evaluate the effect of resisting Mycobacterium tuberculosis in human alveolar macrophages.Culture supernatants were harvested and human TNF-α was measured by ELISA kit.Total nitrite levels in the media were measured using the Griess reagent.ResultsMALs stimulation attenuated the control of intracellular mycobacterial growth in human alveolar macrophages.The production of proinflammatory cytokines TNF-α and Nitric oxide in human alveolar macrophages induced by Mycobacterium tuberculosis purified protein derivatives tuberculin (Mt-PPD) and human interferon γ were attenuated by pretreatment in vitro with MALs.ConclusionMALs attenuated the responses of human alveolar macrophages against Mycobacterium tuberculosis ，which may provide the new evidence to explain the phenomena in which some component of Mycobacteria in environment impacts the immunity against Mycobacterium tuberculosis infection.

Key words:Mycobacterium avium-derived lipids;human alveolar macrophages;immunity function

(收稿日期：2015-11-28)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.09.006

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)09-1172-03

*基金項目：湖南省教育廳科學(xué)研究項目(2015-30)。

作者簡介：彭宏虎，男，主管技師，主要從事微生物檢驗及抗感染免疫研究?！魍ㄓ嵶髡?，E-mail:1050499790@qq.com。