張敏娜,羅聲棟，胡　燕，貌盼勇△

(中國人民解放軍第三○二醫(yī)院:1.感染性疾病診療與研究中心；2.臨床研究管理中心，北京 100039)

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·論著·

人上皮細胞黏附分子的真核表達及鑒定

張敏娜1,羅聲棟2，胡燕2，貌盼勇2△

(中國人民解放軍第三○二醫(yī)院:1.感染性疾病診療與研究中心；2.臨床研究管理中心，北京 100039)

摘要:目的構建人上皮細胞黏附分子(EpCAM)全基因的真核表達質粒，研究其在HepG2細胞中的表達。方法將EpCAM 基因克隆入真核表達載體pcDNA3.1(+)，構建真核表達質粒pcDNA3.1(+)-EpCAM，轉染人肝癌HepG2細胞。通過免疫熒光、Western Blotting及流式細胞檢測對轉染后細胞內EpCAM蛋白的表達進行鑒定。結果雙酶切鑒定結果表明重組質粒構建成功。免疫熒光、Western Blotting及流式細胞檢測結果一致表明，轉染后EpCAM基因在HepG2細胞中表達成功。結論成功構建了人EpCAM 的真核表達載體，并在HepG2細胞中表達，為研究高表達人EpCAM的肝癌細胞的功能打下基礎。

關鍵詞:人上皮細胞黏附分子；真核表達；載體

人上皮細胞黏附分子(EpCAM) 是最早在結腸癌中發(fā)現(xiàn)的一種跨膜糖蛋白，也是第一個用單克隆抗體技術鑒定出來的人腫瘤相關抗原[1]。EpCAM 廣泛表達于上皮來源的正常組織[2]，并在多種上皮源性癌組織中不同程度的過表達[3]。已被多項研究證實與腫瘤的診斷和預后密切相關。在肝細胞癌中，雖然EpCAM 表達率較低，但由于近年來的研究認為EpCAM 為肝癌干細胞標記，而受到越來越多的關注[4]。本研究對人肝細胞癌組織來源的EpCAM 全基因序列在肝癌細胞系中進行了真核表達研究，為探討高表達EpCAM的肝癌細胞功能打下基礎。

1材料與方法

1.1材料EpCAM RNA 由本院行肝癌切除術患者的肝癌組織中提取。HepG2細胞由醫(yī)院臨床研究管理中心保存。逆轉錄試劑盒(SuperScriptⅢ Reverse Transcriptase)、轉染試劑盒(LipofectamineTM2000)、RIPA裂解液均購自Invitrogen公司。DNA片段純化試劑盒(EasyPure Quick Gel Extration Kit)、Anti-his 鼠單克隆抗體、 FITC標記羊抗鼠-IgG抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔IgG 抗體、Trans1-T1感受態(tài)細胞均購于全式金公司。鼠抗人EpCAM單克隆抗體MOC-31(EpCAM細胞外結構域抗體)購自AbD Serotec 公司，兔抗人Ep-ICD單克隆抗體(EpCAM細胞內結構域抗體)購自Abcam 公司，anti-EpCAM-PE抗體購自BD公司。限制性核酸內切酶KpnⅠ、XbaⅠ購自NEB公司。質粒中量提取試劑盒購自Qiagen 公司。

1.2引物合成根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫中提交的EpCAM基因序列(ID：DQ891338)設計兩對引物，對EpCAM 全基因序列進行巢式PCR擴增。外引物正向序列5′-3′：TCC CGC GCC CCT CTT CTC，反向序列5′-3′：ATT TGC TAT TTC CCT TCT TCT，用于第1輪PCR擴增。內引物正向序列5′-3′：GGT ACC ATG TAC CCA TAC GAC GTC CCA GAC TAC GCT GCG CCC CCG CAG GTC CT，添加KpnⅠ酶切位點及HA-tag序列，反向序列5′-3′：TCT AGA TTA ATG GTG ATG GTG ATG ATG TGC ATT GAG TTC CCT AT，添加 XbaⅠ酶切位點及His-tag序列，用于第2輪PCR擴增。擴增產(chǎn)物預計大小為1 002 bp，按照pcDNA3.1(+) 載體進行翻譯，可用His-tag及HA-tag抗體進行蛋白表達鑒定。

1.3EpCAM基因的擴增將肝癌組織提取的RNA逆轉錄為cDNA(操作過程嚴格按照試劑盒說明書)。以EpCAM cDNA為模板,用合成的內、外兩對引物進行巢式PCR擴增。第一輪擴增反應體系：5×TransStart FastPu DNA聚合酶緩沖液 10 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，上游外引物2 μL，下游外引物2 μL，5×TransStart FastPu DNA聚合酶1 μL，EpCAM cDNA 1 μL，dH2O 30 μL。反應條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，擴增30個循環(huán)；72 ℃ 延伸5 min。第2輪擴增反應體系：5×TransStart FastPu DNA聚合酶緩沖液10 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，上游內引物2 μL，下游內引物2 μL，5×TransStart FastPu DNA聚合酶 1 μL，第1輪PCR產(chǎn)物 1 μL，dH2O 30 μL。反應條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，擴增2個循環(huán)；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，擴增2個循環(huán)；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，擴增22個循環(huán)；72 ℃ 延伸5 min。將瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確的EpCAM基因序列連接到平末端載體pEASY-Blunt Simple，轉化至Trans1-T1 感受態(tài)細胞，擴增培養(yǎng)單克隆菌落并提取質粒。PCR及酶切鑒定正確的重組質粒送Sangon Biotech公司測序。

1.4EpCAM真核表達載體的構建用限制性核酸內切酶KpnⅠ和XbaⅠ同時酶切測序正確的重組質粒及真核表達載體pcDNA3.1(+)，膠回收純化目的片段。連接反應體系：10×T4 DNA連接酶緩沖液 10 mmol/LATP 1 μL，pcDNA3.1(+)酶切片段 1 μL，重組質粒酶切片段7 μL，T4 DNA連接酶1 μL。連接反應條件：25 ℃連接反應1 h，16 ℃過夜。轉化至Trans1-T1感受態(tài)細胞，擴增培養(yǎng)單克隆菌落并提取質粒，將酶切鑒定及測序均正確的重組質粒命名為pcDNA3.1(+)-EpCAM。中提質粒，應用紫外分光光度計檢測質粒的濃度，備轉染用。

1.5重組質粒pcDNA3.1(+)-EpCAM轉染HepG2細胞HepG2細胞用含有10%胎牛血清、1% 非必需氨基酸及雙抗(鏈霉素+青霉素)的DMEM 培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。將對數(shù)生長期的細胞接種于六孔板，待細胞貼壁生長密度達70%～80%時，換無抗菌藥物培養(yǎng)液。按照質粒質量與轉染試劑體積2∶5的比例對其進行轉染，用Opti-MEM (每孔250 μL)稀釋轉染試劑(每孔10 μL)，混勻后靜置5 min；Opti-MEM(每孔250 μL)稀釋質粒(每孔4 μg)；轉染試劑稀釋液與質粒稀釋液混勻后靜置20 min后加入六孔板培養(yǎng)液中。于37 ℃培養(yǎng)6 h后更換為含抗菌藥物的DMEM 全培養(yǎng)液，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)。

1.6間接免疫熒光轉染前1 d于六孔板中放入無菌蓋玻片,將胰酶消化的HepG2細胞鋪于六孔板。轉染pcDNA3.1(+)-EpCAM質粒的HepG2 細胞繼續(xù)于37 ℃孵育24～48 h，至細胞長至單層密度約90%，將細胞玻片取出，PBS洗片，冷丙酮固定，晾干。取制備好的細胞片置于載玻片上，放置于黑色濕盒內，PBS洗片；擬行抗-EpICD染色的細胞片加0.1% Trixon 100 破膜處理5 min，PBS洗片；加5%牛血清白蛋白封閉30 min；分別加一抗：抗-his鼠單克隆抗體(濃度1∶200)或鼠抗人EpCAM單克隆抗體MOC-31(濃度1∶200)或兔抗人抗-EpICD抗體(濃度1∶200)，4 ℃孵育過夜；洗片后加FITC標記山羊抗鼠單抗(濃度1∶200)、伊文藍襯染胞核，濕盒內室溫避光孵育40 min；PBS洗片后用10%甘油封片。于熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.7Western Blotting檢測EpCAM真核表達蛋白收集轉染pcDNA3.1(+)-EpCAM質粒24及48 h后的HepG2細胞，用RIPA裂解液冰上裂解細胞，加入蛋白上樣液，煮沸5 min，12 000 g 離心5 min，取上清進行SDS-PAGE電泳；轉膜及脫脂牛奶封閉后，加兔抗人抗-EpICD抗體(濃度1∶5 000)，4 ℃孵育過夜。用PBST洗膜，加HRP標記羊抗兔IgG(濃度1∶3 000)，室溫孵育1 h，PBST洗膜后顯影成像。

1.8流式細胞儀檢測HepG2細胞EpCAM表達率收集轉染pcDNA3.1(+)-EpCAM質粒48 h的HepG2細胞；PBS洗細胞2次；100 μL PBS重懸后加入抗-EpCAM-PE抗體，室溫避光染色20 min；PBS洗細胞2次；用200 μLPBS重懸細胞，流式細胞儀檢測。

2結果

2.1EpCAM基因擴增電泳結果經(jīng)巢式PCR 擴增后，1%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示1條約1 000 bp 的DNA片段，與預計條帶大小相符，見圖1。測序分析后與Genbank中EpCAM基因(ID：DQ891338)ORF 序列比對，完全一致，表明EpCAM 基因擴增成功。

泳道1：Trans2K Plus Ⅱ DNA標記物；泳道2：EpCAM 基因擴增產(chǎn)物。

圖1EpCAM 基因的擴增

2.2EpCAM真核表達質粒的酶切鑒定結果用KpnⅠ和XbaⅠ酶切重組真核表達質粒pcDNA3.1(+)-EpCAM，電泳結果顯示大小約5.4 kbp和1 000 bp的兩條DNA條帶,其中5.4 kbp的條帶為載體pcDNA3.1(+)，1 000 bp的條帶為插入的EpCAM基因,均與預計大小相符,表明EpCAM基因重組真核表達質粒構建成功,酶切電泳圖見圖2。

泳道1：Trans2K Plus Ⅱ DNA標記物；泳道2：EpCAM重組質粒的酶切產(chǎn)物。

圖2重組真核表達質粒的酶切分析

2.3pcDNA3.1(+)-EpCAM質粒轉染HepG2細胞的免疫熒光檢測結果 熒光顯微鏡下觀察到成功轉染入pcDNA3.1(+)-EpCAM質粒的HepG2細胞，經(jīng)EpCAM胞外域抗體(MOC-31)、胞內域抗體(抗-EpICD)、抗-His抗體染色均可于胞漿見翠綠色熒光。對照組HepG2細胞呈暗紅色，未見熒光。見圖3(見《國際檢驗醫(yī)學雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”)。

2.4Western Blotting檢測EpCAM表達的結果pcDNA3.1(+)-EpCAM質粒轉染入HepG2細胞的蛋白提取物進行SDS-PAGE電泳，Western Blotting結果顯示轉染重組質粒24 h及48 h后的細胞蛋白樣品均在約40×103處出現(xiàn)目的條帶，提示EpCAM融合蛋白的成功表達，并驗證了所表達蛋白的抗原活性。如圖4所示。

1.EpCAM蛋白陽性對照(EpCAM原核表達融合蛋白)；2.轉染pcDNA3.1(+)-EpCAM質粒24 h后的蛋白樣品；3.轉染48 h后；4.陰性對照(HepG2細胞蛋白樣品)。

圖4Western Blotting分析EpCAM真核表達

蛋白的特異性

2.5流式細胞儀檢測HepG2細胞EpCAM陽性率的結果未轉染質粒的HepG2細胞EpCAM陽性細胞率0.6%，轉染pcDNA3.1(+)-EpCAM重組質粒后EpCAM陽性細胞率升高到20.2%。見圖5(見《國際檢驗醫(yī)學雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”)。

3討論

EpCAM為Ⅰ型跨膜糖蛋白，相對分子質量約為40×103，由314個氨基酸構成，分子結構包括：細胞外結構域(EpEX)、單次跨膜結構域和細胞內結構域(EpICD)。EpCAM 可介導非Ca2+依賴性同源細胞間的黏附，促進細胞周期和細胞增殖[5]，并與腫瘤的發(fā)生、進展、侵襲及轉移等相關[6]。近年來，EpCAM被多項研究證實為腫瘤干細胞標記。由于EpCAM 是目前表達最強和最廣泛的腫瘤抗原之一,可能成為大多數(shù)上皮源性腫瘤免疫治療的靶點。目前，EpCAM 抗體對于結腸癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌等的治療主要還處于臨床試驗階段。已經(jīng)在德國上市的鼠來源抗EpCAM 單克隆抗體Edrecolomab(ED) 是第一個用于治療人類胃腸道腫瘤并顯示出延長整體生存期的臨床療效的單克隆抗體[7-8]。EpCAM 雙特異性抗體Catumaxomab 也于2009年被歐盟委員會批準應用于EpCAM 表達陽性腫瘤患者的惡性腹水的治療，并顯示出僅次于上皮癌的明確的臨床獲益[9]。在肝細胞癌方面，近年研究認為EpCAM 為肝癌干細胞標記物，EpCAM表達陽性的肝癌細胞也同時表達其他肝干細胞標記，具備自我更新和分化能力及較高的侵襲性,能夠在NOD/SCID 小鼠(非肥胖糖尿病嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠)中誘生高侵襲性的肝癌[10]。但對于EpCAM在肝癌中的作用機制及未來可能的診療方面的應用還有待于進一步研究。本研究為最大程度地模擬表達EpCAM的肝癌細胞的生物學行為，選擇HepG2細胞系作為EpCAM的真核表達細胞。前期流式細胞儀及細胞免疫熒光檢測均顯示其EpCAM天然表達率很低。HepG2細胞轉染EpCAM真核表達重組質粒后，應用EpCAM特異性胞外域、胞內域抗體及抗-His標簽抗體行免疫熒光檢測，均觀察到表達EpCAM蛋白的細胞胞漿翠綠色熒光染色；Western Blotting分析顯示轉染真核表達質粒的細胞蛋白樣品呈現(xiàn)EpCAM的特異性條帶；流式細胞儀檢測顯示，轉染后的HepG2細胞EpCAM陽性率顯著升高。以上結果均表明EpCAM重組質粒真核表達成功，與原核表達系統(tǒng)相比，真核表達產(chǎn)物更接近于天然分子的構象，為研究EpCAM表達陽性的肝癌細胞的生物學行為奠定了基礎。

參考文獻

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Expression and identification of human EpCAM eukaryotic recombinant plasmid

ZhangMinna1,LuoShengdong2,HuYan2,MaoPanyong2△

(1.TreatmentandResearchCenterforInfectiousDiseases;2.ResearchCenterforClinicalMedicine,the302HospitalofPLA,Beijing100039,China)

Abstract:ObjectiveTo construct human EpCAM eukaryotic recombinant plasmid,and to study the expression of EpCAM protein in HepG2 cells.MethodsThe recombinant plasmid,named pcDNA3.1(+)-EpCAMwas constructed by cloning EpCAM gene into eukaryotic vector pcDNA3.1(+).Then HepG2 cells were transfected with EpCAMrecombinant plasmid.The eukaryotic expression of EpCAM protein was verified by immunofluorescence，Western Blotting and flow cytometry.ResultsThe construction of EpCAM recombinant eukaryotic plasmid was identified by restriction enzyme digestion.The results of immunofluorescence,Western Blotting,and flow cytometry consistently indicated that EpCAM protein were successfully expressed in HepG2 cells.ConclusionHuman EpCAM eukaryotic vector is constructed and EpCAM protein could be expressed well in HepG2 cells,which laid a foundation for further research on the function ofhepatocarcinoma cells highly expressing EpCAM.

Key words:epithelia cell adhesion molecule;eukaryotic expression;vector

(收稿日期：2016-01-02)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.09.028

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)09-1223-03

作者簡介：張敏娜，女，主治醫(yī)師，主要從事感染性疾病診療研究?！魍ㄓ嵶髡撸珽-mail:maopy302@163.com。