李 強(qiáng), 閆靜靜， 卓其斌, 章樹業(yè), 陳 良

復(fù)旦大學(xué)附屬公共衛(wèi)生臨床中心 1.肝炎一科; 2.科學(xué)研究部，上海 201508

SLC10A1 基因p．S267F 位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性對(duì)慢性乙型肝炎患者肝功能的影響

李 強(qiáng)1, 閆靜靜2， 卓其斌1, 章樹業(yè)2, 陳 良1

復(fù)旦大學(xué)附屬公共衛(wèi)生臨床中心 1.肝炎一科; 2.科學(xué)研究部，上海 201508

目的 探討SLC10A1基因p.S267F位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)對(duì)慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者肝功能的影響。方法 納入初治CHB患者153例，其中p.S267F位點(diǎn)野生型(C/C)132例，突變型(C/T)21例。T檢驗(yàn)比較p.S267F位點(diǎn)野生型與突變型CHB患者各項(xiàng)肝功能指標(biāo)間的差異。結(jié)果 SLC10A1基因p.S267F位點(diǎn)突變型CHB患者的ALT、AST、TBIL和DBIL水平均顯著低于野生型患者(P<0.05)；兩組患者ALP、GGT和TBA水平間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)論 SLC10A1基因p.S267F位點(diǎn)突變型CHB患者的肝功能損傷程度低于野生型CHB患者，SLC10A1基因p.S267F位點(diǎn)突變可能是CHB患者肝損加重的保護(hù)因素。

乙型肝炎病毒; 慢性乙型肝炎; 鈉離子-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)多肽; 單核苷酸多態(tài)性; 肝功能

慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是全球性公共衛(wèi)生問題[1-2]。SLC10A1基因編碼的鈉離子-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)多肽(sodium-taurocholate cotransporting polypeptide, NTCP)是肝細(xì)胞膜上一種具有膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)功能的多肽類物質(zhì)[3]。2012年北京生命科學(xué)研究所李文輝團(tuán)隊(duì)首次證實(shí)NTCP是HBV感染肝細(xì)胞的功能受體[4]。隨后，Yan等[5]的體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NTCP基因p.Ser267Phe點(diǎn)突變可導(dǎo)致其HBV受體功能缺失。然而，p.Ser267Phe點(diǎn)突變導(dǎo)致HBV受體功能缺失后的臨床意義尚不明確，相關(guān)研究也較少。本研究初步探討SLC10A1基因p.S267F位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)對(duì)CHB患者肝功能的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本課題組前期檢測(cè)了2014年7月-2015年2月在上海市(復(fù)旦大學(xué)附屬)公共衛(wèi)生臨床中心就診的1 268例HBV感染者SLC10A1基因p.S267F位點(diǎn)的SNPs情況。其中，初治CHB患者共153例，132例p.S267F野生型(C/C型)、21例p.S267F突變型(C/T型)，納入初治患者作為研究對(duì)象。本研究中CHB的診斷均符合我國(guó)《慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。排除標(biāo)準(zhǔn)如下：經(jīng)抗病毒或保肝治療的患者、伴有其他病毒性肝炎(甲型、丙型、丁型、戊型)、合并HIV感染、非酒精性脂肪性肝病、酒精性肝病、自身免疫性肝病或遺傳代謝性肝病的患者。研究方案符合上海市公共衛(wèi)生臨床中心倫理委員會(huì)制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)并得到該倫理委員會(huì)批準(zhǔn)；本研究中所有研究對(duì)象均被告知研究目的并獲知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 獲取DNA樣本：用EDTA抗凝管留取受試者3 ml靜脈血。取其中200 μl靜脈血，采用TIANamp DNA抽提試劑盒(Biotake公司，北京)，按試劑公司操作說明進(jìn)行DNA抽提。抽提出的DNA保存在-80 ℃冰箱待用。

1.2.2 SLC10A1基因p.S267F位點(diǎn)SNPs分析：SLC10A1基因p.S267F位點(diǎn)SNPs的檢測(cè)均采用片長(zhǎng)多態(tài)性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)。PCR反應(yīng)體系為25 μl，包括12.5 μl的2×Taq PCR Mix(西安潤(rùn)德生物有限公司)、2 μl基因組DNA(0.05 mg/ml)、上游引物(5′-ATATGGCAATGAGGAGAAGC-3′)和下游引物(5′-TTCCCTCTGAGTGTATGTGG-3′)各1.0 μl、8.5 μl無(wú)菌雙蒸餾水。PCR擴(kuò)增程序如下：94 ℃ 3 min→擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)(循環(huán)程序?yàn)?4 ℃ 30 s→58 ℃ 30 s→72 ℃ 30 s)→72 ℃ 10 min。擴(kuò)增完成后，按公司操作說明使用HphI(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室北京有限公司)對(duì)DNA進(jìn)行酶切，獲得p.S267F位點(diǎn)的限制性酶切片段。采用3%的瓊脂糖凝膠對(duì)p.S267F酶切片段進(jìn)行電泳，隨后采用紫外透射光源進(jìn)行紫外顯像。依據(jù)紫外顯像結(jié)果判斷NTCP基因在p.S267F位點(diǎn)的SNPs：基因CC型僅有一個(gè)長(zhǎng)度為204個(gè)堿基的片段；基因CT型有3個(gè)片段，長(zhǎng)度分別為204、120、84個(gè)堿基；基因TT型有2個(gè)片段，長(zhǎng)度分別為120和84個(gè)堿基。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析：分別采用T檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)比較SLC10A1基因p.S267F位點(diǎn)野生型與突變型CHB患者的年齡、性別構(gòu)成比和HBV DNA定量值的差異；T檢驗(yàn)比較野生型和突變型患者肝功能各項(xiàng)指標(biāo)間的差異；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 入組患者的基線特征 SLC10A1基因p.S267F位點(diǎn)野生型與突變型CHB患者在年齡和性別構(gòu)成比方面的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；突變型CHB患者血清HBV DNA載量低于野生型CHB患者(P=0.006, 見表1)。

表1 入組患者的基線特征

Tab 1 Baseline characteristics of enrolled patients

野生型突變型統(tǒng)計(jì)值P值例數(shù)13221男/女87/4515/62．390．611年齡(x±s，歲)36．5±1238．4±111．170．737HBVDNA(log10IU/ml)7．3(3．5～8．4)5．2(2．7～6．8)12．470．006

2.2 SLC10A1基因p.S267F位點(diǎn)野生型與突變型患者的肝功能比較 p.S267F位點(diǎn)突變型CHB患者的ALT、AST、TBIL和DBIL水平均明顯低于野生型且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組患者的ALP、GGT和TBA水平間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

肝功能指標(biāo)野生型突變型t值P值A(chǔ)LT(U/L)187．5±123．3115．7±93．489．270．008AST(U/L)166．6±104．2101．4±86．559．540．010TBIL(μmol/L)89．6±72．953．3±45．2129．240．007DBIL(μmol/L)64．7±50．836．6±25．766．150．001ALP(U/L)167．5±93．6 116±64．71．170．587GGT(U/L)105．5±89．299±96．30．190．748TBA(μmol/L)61．4±49．259．7±42．50．020．115

注：ALT：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；AST：天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；TBIL：總膽紅素；DBIL：直接膽紅素；ALP：堿性磷酸酶；GGT：L-γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶；TBA：總膽汁酸。

3 討論

目前已明確NTCP是HBV進(jìn)入肝細(xì)胞的功能受體，且有多項(xiàng)臨床前期研究表明SLC10A1基因p.S267F位點(diǎn)突變(野生型→突變型)會(huì)導(dǎo)致NTCP表達(dá)水平下降或NTCP與HBV的親和力降低，進(jìn)而減少HBV對(duì)肝細(xì)胞的感染[5,7]。依據(jù)臨床前期研究結(jié)論，不難得出以下科學(xué)假設(shè)：與SLC10A1基因p.S267F位點(diǎn)野生型患者相比，突變型患者肝細(xì)胞膜表面NTCP的表達(dá)水平下降或NTCP與HBV的親和力降低，肝臟內(nèi)被HBV感染并最終被機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別并破壞的肝細(xì)胞的數(shù)量相對(duì)較少，其肝功能損傷程度較野生型患者輕。然而這只是一種基于臨床前期研究得出的科學(xué)假設(shè)，尚需要臨床數(shù)據(jù)證實(shí)。因此我們納入初治CHB患者，從臨床角度觀察SLC10A1基因p.S267F位點(diǎn)突變是否會(huì)對(duì)CHB患者的肝功能產(chǎn)生影響。

從本研究結(jié)果看，SLC10A1基因p.S267F位點(diǎn)突變型患者的ALT、AST、TBIL和DBIL水平均明顯低于野生型患者，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這印證了“SLC10A1基因p.S267F位點(diǎn)突變型患者肝功能損傷程度較野生型患者輕”的假設(shè)，也從臨床角度進(jìn)一步支持SLC10A1基因編碼的NTCP為HBV侵入肝細(xì)胞的功能受體。ALT、AST、TBIL和DBIL是臨床醫(yī)生判斷CHB患者病情嚴(yán)重程度的常用生化指標(biāo)，突變型患者中這些指標(biāo)的水平明顯低于野生型患者，提示SLC10A1基因p.S267F位點(diǎn)的SNPs與CHB患者的病情嚴(yán)重程度存在相關(guān)性，S267F位點(diǎn)突變可能是CHB重癥化的保護(hù)因素之一。SLC10A1基因p.S267F位點(diǎn)突變型CHB患者血清HBV DNA載量顯著低于野生型CHB患者，從臨床角度進(jìn)一步證明了Yan等[5]和Romero等[7]在細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的“SLC10A1基因p.S267F位點(diǎn)突變會(huì)導(dǎo)致NTCP表達(dá)水平下降或NTCP與HBV的親和力降低，進(jìn)而減少HBV對(duì)肝細(xì)胞的感染”的結(jié)論。

NTCP具有TBA轉(zhuǎn)運(yùn)功能，是調(diào)控TBA腸肝循環(huán)的關(guān)鍵[8]。目前研究表明腸道重吸收入肝臟的TBA有90%經(jīng)過NTCP轉(zhuǎn)運(yùn)，另外10%經(jīng)過非NA+依賴的有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(organic anion transporting polypeptide，OATP)轉(zhuǎn)運(yùn)[9]。SLC10A1基因p.S267F位點(diǎn)突變導(dǎo)致NTCP表達(dá)水平降低，會(huì)不會(huì)通過影響TBA的腸肝循環(huán)導(dǎo)致血中TBA水平升高呢？我們的臨床數(shù)據(jù)顯示SLC10A1基因p.S267F位點(diǎn)野生型與突變型CHB患者的TBA水平無(wú)明顯差異。Pan等[10]報(bào)道SLC10A1基因p.S267F位點(diǎn)T/T型突變的患者，其NTCP的膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)功能幾乎完全喪失，然而這部分患者臨床上并未出現(xiàn)血膽汁酸水平的升高，與我們的研究結(jié)果一致。Li等[11]的研究發(fā)現(xiàn)SLC10A1基因p.S267F位點(diǎn)突變導(dǎo)致NTCP表達(dá)下調(diào)后，機(jī)體可通過上調(diào)OATP的表達(dá)水平，通過OATP對(duì)TBA轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行充分的代償。總而言之，我們的研究表明SLC10A1基因p.S267F位點(diǎn)突變對(duì)CHB患者的血膽汁酸水平影響不大，機(jī)制可能與OATP的充分代償有關(guān)。

[1]World Health Organization (2014). Hepatitis B [EB/OL].http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs204/en/.

[2]胡曉麗, 趙宏偉, 吳曉巖, 等. 乙型肝炎病毒感染的流行現(xiàn)狀 [J]. 臨床肝膽病雜志, 2012, 28(6): 413-416. Hu XL, Zhao HW, Wu XY, et al. Prevalence of hepatitis B virus infection [J]. J Clin Hepatol, 2012, 28(6): 413-416.

[3]D?ring B1, Lütteke T, Geyer J, et al. The SLC10 carrier family: transport functions and molecular structure [J]. Curr Top Membr, 2012, 70: 105-168.

[4]Yan H, Zhong G, Xu G, et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus [J]. Elife, 2012, 1: e00049.

[5]Yan H, Peng B, Liu Y, et al. Viral entry of hepatitis B and D viruses and bile salts transportation share common molecular determinants on sodium taurocholate cotransporting polypeptide [J]. J Virol, 2014, 88 (6): 3273-3284.

[6]中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì),中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì).慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)[J].中華肝臟病雜志, 2011, 3(1): 13-23. Chinese Society of Hepotology AND Chinese Society of Infectious Diseases, Chinese Medical Association. The guideline of prevention and treatment for chronic hepatitis B (2010 verson) [J]. Chin J Hepatol, 2011, 3(1): 13-23.

[7]Romero MR, Monte MJ, Marin JJ. Pathophysiological and pharmacological implications of elucidating the molecular bases of the interaction between HBV and the bile acid transporter NTCP [J]. Ann Hepatol, 2015, 14(1): 143-144.

[8]李強(qiáng), 卓其斌, 黃玉仙, 等. HBV受體及進(jìn)入抑制劑的研究進(jìn)展[J]. 臨床肝膽病雜志, 2015, 31(4): 607-610. Li Q, Zhuo QB, Huang YX, et al. Research advances in receptor and inhibitors of hepatitis B virus entry [J]. J Clin Hepatol, 2015, 31(4): 607-610.

[9]Stieger B. The role of the sodium-taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) and of the bile salt export pump (BSEP) in physiology and pathophysiology of bile formation [J]. Handb Exp Pharmacol, 2011, (201): 205-259.

[10]Pan W, Song IS, Shin HJ, et al. Genetic polymorphisms in Na+-taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) and ileal apical sodium-dependent bile acid transporter (ASBT) and ethnic comparisons of functional variants of NTCP among Asian populations [J]. Xenobiotica, 2011, 41(6): 501-510.

[11]Li XL, Guo ZT, Wang YD, et al. Potential role of organic anion transporting polypeptide 1B1 (OATP1B1) in the selective hepatic uptake of hematoporphyrin monomethyl ether isomers [J]. Acta Pharmacol Sin, 2015, 36(2): 268-280.

(責(zé)任編輯：王全楚)

Influence of p.S267F single nucleotide polymorphisms in SLC10A1 gene on the liver function of chronic hepatitis B patients

LI Qiang1, YAN Jingjing2， ZHUO Qibin1, ZHANG Shuye2, CHEN Liang1

1.Department of NO.1 Hepatitis; 2.Department of Scientific Research, Public Health Clinical Center Affiliated to Fudan University, Shanghai 201508, China

Objective To investigate influence of p.S267F single nucleotide polymorphisms (SNPs) in SLC10A1 gene on the liver function of chronic hepatitis B (CHB) patients. Methods One hundred and fifty-three initial treatment CHB patients including 132 cases of p.S267F wild type (C/C) and 21 cases of p.S267F mutant (C/T) were enrolled. The differences of liver function between patients of C/C genotype and C/T genotype were compared. Results The level of ALT, AST, TBIL and DBIL of patients with p.S267F mutant type was lower than that of patients with p.S267F wild(P<0.05). There was no significant difference between the two groups in ALP, GGT and TBA(P>0.05).Conclusion The degree of liver damage of patients with p.S267F mutant is lower than that of patients with p.S267F wild type. The p.S267F mutant may be a protective factor of aggravation of liver function of patients with CHB.

Hepatitis B virus; Chronic hepatitis B; Sodium taurocholate cotransporting polypeptide; Single nucleotide polymorphism; Liver function

上海市科委“科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃”醫(yī)學(xué)與農(nóng)業(yè)領(lǐng)域重點(diǎn)項(xiàng)目(13401902100)；上海市市級(jí)醫(yī)院新興前沿技術(shù)聯(lián)合攻關(guān)項(xiàng)目(SHDC12015129)；上海市公共衛(wèi)生臨床中心院級(jí)課題(201504)

李強(qiáng)，碩士，研究方向：慢性肝病治療策略優(yōu)化。E-mail： liqiang66601@163.com

陳良，教授，碩士，研究方向：慢性肝病治療策略優(yōu)化。E-mail： chenliang@shaphc.org

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.10.026

512.6+2

A

1006-5709(2016)10-1179-03

2015-12-29