馬　亮，許永濤，佘遠(yuǎn)舉

(湖北省荊州市中心醫(yī)院，湖北 荊州 434020)

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千金藤素對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞遷移、侵襲能力影響的體外研究

馬亮，許永濤，佘遠(yuǎn)舉

(湖北省荊州市中心醫(yī)院，湖北 荊州 434020)

[摘要]目的探討千金藤素對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響及其相關(guān)機(jī)制。方法將培養(yǎng)的MG-63細(xì)胞分為10 μmol/L千金藤素組、40 μmol/L千金藤素組和對(duì)照組,觀察3組劃痕遷移試驗(yàn)、Transwell小室侵襲試驗(yàn)骨肉瘤MG-63細(xì)胞遷移、侵襲能力，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)3組基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)濃度。結(jié)果10 μmol/L千金藤素組、40 μmol/L千金藤素組細(xì)胞向劃痕處遷移明顯減少，且隨著千金藤素濃度的增加，細(xì)胞向劃痕處遷移明顯減少。10 μmol/L千金藤素組、40 μmol/L千金藤素組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯少于對(duì)照組(P均<0.05)，且40 μmol/L千金藤素組明顯少于10 μmol/L千金藤素組。骨肉瘤MG-63細(xì)胞培養(yǎng)液中MMP-2濃度隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，10 μmol/L千金藤素組、40 μmol/L千金藤素組培養(yǎng)24 h、48 h、72 h的MMP-2濃度均明顯低于對(duì)照組，且40 μmol/L千金藤素組均明顯低于10 μmol/L千金藤素組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。結(jié)論千金藤素可抑制骨肉瘤MG-63細(xì)胞遷移和侵襲能力，這種抑制效應(yīng)可能是通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞MMP-2的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

[關(guān)鍵詞]千金藤素；骨肉瘤； 遷移；侵襲；細(xì)胞外基質(zhì)

骨肉瘤是多發(fā)于青少年的一種增殖及侵襲性極強(qiáng)的惡性腫瘤，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是患者死亡的重要原因，所以抑制骨肉瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移是其治療的關(guān)鍵[1]。千金藤素作為一種升白細(xì)胞藥物應(yīng)用于臨床已取得較好效果，其具有免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、抗病毒、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥、抑制血管生成和調(diào)控細(xì)胞周期等作用[2-3]，可以抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[4]。但其對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的影響報(bào)道少見(jiàn)。本研究探討了千金藤素對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞遷移、侵襲力的影響，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1實(shí)驗(yàn)資料

1.1材料千金藤素購(gòu)于昆明長(zhǎng)春花科技有限公司。人骨肉瘤細(xì)胞株MG-63購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品；MEM/EBSS培養(yǎng)基為美國(guó)Hyclone公司產(chǎn)品。 基質(zhì)膠、二甲基亞砜(DMSO)、胰蛋白酶凍干粉(含EDTA)為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；Transwell小室和培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶為美國(guó)Corning公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)人骨肉瘤MG-63細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清及青-鏈霉素的MEM/EBSS培養(yǎng)液中，在37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，生長(zhǎng)至80%融合時(shí)， 0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，棄去消化液，用少許培養(yǎng)基洗滌后再用培養(yǎng)基反復(fù)輕輕吹打后制備細(xì)胞懸液，以1∶4 的比例傳代培養(yǎng)。

1.2.2劃痕遷移實(shí)驗(yàn)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MG-63細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，接種密度為1×106mL-1，細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。將培養(yǎng)的MG-63細(xì)胞分為10 μmol/L千金藤素組、40 μmol/L千金藤素組和對(duì)照組,待24 h后細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)為單層細(xì)胞后，用200 μL槍頭在培養(yǎng)板底部劃一直線(xiàn)，用PBS漂洗2次，洗去劃落的懸浮細(xì)胞，千金藤素2組分別加入含10 μmol/L及40 μmol/L千金藤素的培養(yǎng)液，對(duì)照組加入等量的常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞向劃痕中遷移情況。

1.2.3Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分為10 μmol/L千金藤素組、40 μmol/L千金藤素組和對(duì)照組。基質(zhì)膠使用前以無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋至50 mg/L，取50 μL加于小室的聚碳酸酯膜上，37 ℃孵育1 h使其成為凝膠狀態(tài)。以含2%胎牛血清的培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106mL-1，在上室中，千金藤素2組分別加入以10，40 μmol/L千金藤素處理后的MG-63細(xì)胞懸液200 μL，對(duì)照組加入MG-63細(xì)胞懸液200 μL。下室加入400 μL完全培養(yǎng)液和NIH3T3成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基作為趨化劑，常規(guī)培養(yǎng)24 h后取出小室，甲醇固定下室已經(jīng)侵入的細(xì)胞5 min,0.1%結(jié)晶紫染色15 min后光鏡下觀察腫瘤細(xì)胞侵襲情況，并計(jì)數(shù)上、中、下及左、右5個(gè)視野中的透膜細(xì)胞數(shù),每個(gè)標(biāo)本重復(fù)3次。以侵襲細(xì)胞的數(shù)目來(lái)表示腫瘤細(xì)胞的相對(duì)侵襲力。

1.2.4基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)濃度檢測(cè)實(shí)驗(yàn)分為10 μmol/L千金藤素組、40 μmol/L千金藤素組和對(duì)照組。每組用相應(yīng)的培養(yǎng)液處理骨肉瘤MG-63細(xì)胞，在培養(yǎng)24 h、48 h及72 h時(shí)收集培養(yǎng)上清液，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值，并用不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),根據(jù)實(shí)驗(yàn)樣品OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖上查出對(duì)應(yīng)的MMP-2濃度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析透膜細(xì)胞數(shù)及MMP-2表達(dá)水平差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.13組骨肉瘤MG-63細(xì)胞遷移情況10 μmol/L千金藤素組、40 μmol/L千金藤素組與對(duì)照組比較，細(xì)胞向劃痕處遷移明顯減少，隨著千金藤素濃度的增加，細(xì)胞向劃痕處遷移明顯減少。見(jiàn)圖1～3。

2.23組骨肉瘤MG-63細(xì)胞侵襲情況對(duì)照組和10 μmol/L千金藤素組、40 μmol/L千金藤素組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(145.3±6.7)個(gè)、(94±8.9)個(gè)、(42±5.8)個(gè)，10 μmol/L千金藤素組、40 μmol/L千金藤素組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯少于對(duì)照組(P均<0.05)，且40 μmol/L千金藤素組明顯少于10μmol/L千金藤素組(P均<0.05)。見(jiàn)圖4～6。

圖1　對(duì)照組24 h骨肉瘤MG-63細(xì)胞向劃痕處遷移情況(×40)

圖2　10 μmol/L千金藤素組24 h骨肉瘤MG-63細(xì)胞

圖3　40 μmol/L千金藤素組24 h骨肉瘤MG-63細(xì)胞

圖4　對(duì)照組24 h后骨肉瘤MG-63細(xì)胞侵襲情況(×40)

2.33組不同處理時(shí)間骨肉瘤MG-63細(xì)胞培養(yǎng)液中MMP-2濃度骨肉瘤MG-63細(xì)胞培養(yǎng)液中MMP-2濃度隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，10μmol/L千金藤素組、40μmol/L千金藤素組培養(yǎng)24 h、48 h、72 h的MMP-2濃度均明顯低于對(duì)照組，且40 μmol/L千金藤素組均明顯低于10 μmol/L千金藤素組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

圖5　10 μmol/L千金藤素組24 h后骨肉瘤MG-63細(xì)胞

圖6　40 μmol/L千金藤素組24 h后骨肉瘤MG-63細(xì)胞

表1　3組不同處理時(shí)間骨肉瘤MG-63細(xì)胞培養(yǎng)液中

注：①與培養(yǎng)24 h比較，P<0.05；②與培養(yǎng)48 h比較，P<0.05；③與對(duì)照組比較，P<0.05；④與10 μmol/L千金藤素組比較，P<0.05。

3討論

骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移多見(jiàn)，如何有效抑制骨肉瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移是治療中的難題[5]。腫瘤的侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移涉及腫瘤細(xì)胞穿破細(xì)胞外基質(zhì)屏障、侵入血管壁的基膜及遷徙到新部位等過(guò)程。大量研究證明,腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的強(qiáng)弱與腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)的降解及基底膜的破壞有關(guān)，而MMP在降解細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)程中起主要作用。MMP屬于高度保守的依賴(lài)于鋅離子的內(nèi)切蛋白水解酶，根據(jù)其結(jié)構(gòu)及作用底物的不同分為4類(lèi)[6]。MMP-2是該家族中與腫瘤的浸潤(rùn)、侵襲、轉(zhuǎn)移關(guān)系最為密切的一類(lèi)蛋白酶,其作用的底物是Ⅳ 型膠原，這是基膜的主要成分。MMP-2能破壞基底膜的完整性，切斷基底膜的支架即Ⅳ型膠原,破壞小血管、淋巴管的基底膜,從而引起血行和淋巴轉(zhuǎn)移；還可降低腫瘤細(xì)胞與宿主細(xì)胞之間黏附性，使腫瘤細(xì)胞便于游走，穿破細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)入到血管中向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；還可以促進(jìn)腫瘤新生血管的形成，加速腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[7]。MMP-2 能降解細(xì)胞外基質(zhì)，使血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等細(xì)胞因子的促血管新生活性增加，這些細(xì)胞因子也能間接或直接促進(jìn)MMP-2的表達(dá)[8]。Wen等[9]分析發(fā)現(xiàn)MMP-2表達(dá)水平高的骨肉瘤患者預(yù)后要差。Korpi等[10]研究發(fā)現(xiàn)在取活檢得樣本中有86%的骨肉瘤患者M(jìn)MP-2高表達(dá)，但在化療后染色強(qiáng)度明顯減弱，在化療后切除的樣本中只有50%的患者M(jìn)MP-2高表達(dá)；在肺轉(zhuǎn)移樣本中，MMP-2抗體染色陽(yáng)性，提示MMP-2在骨肉瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移中起重要作用，MMP-2高表達(dá)者預(yù)后不佳。

中藥千金藤為防己科植物千金藤屬的根或莖葉，其中活性成分眾多。千金藤屬植物主要含生物堿，按照其化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為6種類(lèi)型[11]:嗎啡二烯酮型、蓮花烷型、阿樸堿型、原阿樸堿型、原小蘗堿型、雙芐基異喹啉型。千金藤素是千金藤屬藥用植物中提取分離出來(lái)的有效成分，其屬于雙芐基異喹啉型[12]。千金藤素具有多種生物活性，可以通過(guò)多種機(jī)制參與腫瘤的預(yù)防和治療,包括誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性等[13]；還可以通過(guò)干擾質(zhì)膜跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的功能，促進(jìn)抗癌藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的積累，提高抗癌藥物的療效[14-15]；其可以通過(guò)作用于巨噬細(xì)胞、T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞等發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，從而產(chǎn)生抗腫瘤作用。Chen等[16]研究發(fā)現(xiàn)，千金藤素通過(guò)抑制STAT3 信號(hào)傳導(dǎo)途徑而發(fā)揮抗腫瘤作用。Harada等[17]報(bào)道千金藤素還可以通過(guò)作用于p27、p21等細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯發(fā)揮抗腫瘤作用。

本研究劃痕遷移試驗(yàn)、Transwell小室侵襲試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，千金藤素能有效抑制MG-63細(xì)胞的遷移和侵襲能力,并且隨著藥物濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)；千金藤素還能有效抑制MMP-2的表達(dá)，而且抑制程度呈劑量及時(shí)間依耐性。提示千金藤素是一個(gè)多靶點(diǎn)、多效應(yīng)的抗腫瘤藥物，其對(duì)骨肉瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移具有有效抑制作用，其作用機(jī)制可能與抑制MMP-2的表達(dá)有關(guān)，對(duì)于其他的作用機(jī)制及對(duì)各種相關(guān)基因表達(dá)水平的影響還需進(jìn)一步研究。

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Effect of Cepharanthine on migration and invasion of osteosarcoma MG-63 cells in vitro

MA Liang, XU Yongtao, SHE Yuanju

(Jingzhou Central Hospital of Hubei Province, Jingzhou 434020, Hubei, China)

Abstract：Objective It is to study the effect of Cepharanthine on migration and invasion of osteosarcoma MG-63 cells in vitro, and explore the related mechanism. Methods The cultured MG-63 cells were divided into 10 μmol/L Cepharanthine group, 40 μmol/L cepharanthine group and control group.Wound healing assay and Transwell chamber method were used to detect the migration and invasion respectively. The level of the expression of matrix metal enzyme-2 was detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Results The migration of the cells in 10 μmol/L Cepharanthine group, 40 μmol/L cepharanthine group to the scratch area after 24 hours significantly reduced, with cepharanthine concentration increased, cell migration to scratches significantly reduced. The number of penetrating cells were less in cepharanthine groups than that in control group, and the numbers in 40 μmol/L cepharanthine group were less than that in 10 μmol/L Cepharanthine group. The level of MMP-2 expression of MG-63 cells decreased with the increase of Cepharanthine concentration and extension of treat time. The concentrations of MMP-2 in cell culture solution were lower in cepharanthine groups than that in control group, and the concentration in 40 μmol/L cepharanthine group were less than that in 10 μmol/L Cepharanthine group, the differences were all significant (P<0.05). Conclusion Cepharanthine could inhibit the migration and invasion of the osteosarcoma MG-63 cells in vitro.The inhibitory effect may be achieved by inhibiting the expression of MMP-2 in tumor cells.

Key words:Cepharanthine; osteosarcoma; migration; invasion; extracellular matrix

[收稿日期]2015-12-10

[中圖分類(lèi)號(hào)]R-33

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1008-8849(2016)13-1388-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.13.007

[作者簡(jiǎn)介]馬亮，男，博士研究生，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)楣顷P(guān)節(jié)疾病的診治。