史黎黎 黎銘 章雙

摘要：【目的】明確CTNNBL1基因在凡納濱對(duì)蝦抗病過(guò)程中的功能作用，為深入探討對(duì)蝦抗病免疫機(jī)制提供參考依據(jù)?！痉椒ā坎捎肦ACE-PCR克隆凡納濱對(duì)蝦CTNNBL1基因（LvCTNNBL1），利用在線(xiàn)軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并進(jìn)一步分析其組織表達(dá)特征及應(yīng)答白斑綜合征病毒（WSSV）和副溶血弧菌感染的表達(dá)模式。【結(jié)果】LvCTNNBL1基因cDNA全長(zhǎng)1906 bp，其中開(kāi)放閱讀框（ORF）長(zhǎng)1692 bp，編碼563個(gè)氨基酸，含有1個(gè)CTNNBL結(jié)構(gòu)域。同源性分析發(fā)現(xiàn)LvCTNNBL1蛋白與大型溞（Daphnia magna）同源蛋白的相似度最高，為77%?；贑TNNBL1基因序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析結(jié)果顯示，凡納濱對(duì)蝦被聚為無(wú)脊椎動(dòng)物一類(lèi)，與同為節(jié)肢動(dòng)物的大型溞、西方蜜蜂（Apis mellifera）和美洲鱟（Limulus polyphemus）的親緣關(guān)系較近。LvCTNNBL1基因在凡納濱對(duì)蝦中呈組成型表達(dá)，以在腸道中的表達(dá)量最高、表皮中的表達(dá)量最低。注射感染W(wǎng)SSV后，LvCTNNBL1基因在凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞中的表達(dá)量呈先下降后上升趨勢(shì)，在所有檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組間存在顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01，下同）差異；注射感染副溶血弧菌后，LvCTNNBL1基因在凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞中的表達(dá)量呈先上升后下降趨勢(shì)，感染后12 h內(nèi)較對(duì)照組極顯著升高。【結(jié)論】LvCTNNBL1基因表達(dá)量在病毒和細(xì)菌感染時(shí)發(fā)生明顯變化，可能參與了凡納濱對(duì)蝦的抗病免疫途徑。

關(guān)鍵詞： 凡納濱對(duì)蝦；CTNNBL1基因；白斑綜合征病毒（WSSV）；副溶血弧菌；表達(dá)分析

中圖分類(lèi)號(hào)： S945.46 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）07-1203-06

0 引言

【研究意義】我國(guó)是世界對(duì)蝦養(yǎng)殖第一大國(guó)，養(yǎng)殖的對(duì)蝦品種有凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）、中國(guó)明對(duì)蝦（Fenneropenaeus chinensis）、斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）和日本囊對(duì)蝦（Marsupenaeus japonicus）等，其中凡納濱對(duì)蝦是最主要的養(yǎng)殖品種（Li and Xiang，2013；曾地剛等，2014）。近年來(lái)，以白斑綜合征（White spot syndrome，WSS）和急性肝胰腺壞死綜合征（Acute hepatopancreatic necrosis disease，AHPND）為主的多種病害給我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失，養(yǎng)殖效益大幅度下降（Flegel et al.，2008；張彬等，2015）。因此，借助現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)開(kāi)展對(duì)蝦自身生理抗病機(jī)制，尤其是先天性免疫防御機(jī)理研究，對(duì)于推動(dòng)我國(guó)對(duì)蝦產(chǎn)業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前的研究已證實(shí)，有多個(gè)免疫信號(hào)通路在對(duì)蝦抗病免疫過(guò)程中發(fā)揮重要功能作用。Zhu和Zhang（2013）研究發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)果蠅S2細(xì)胞對(duì)白斑綜合征病毒（White spot syndrome virus，WSSV）的吞噬作用；Chen等（2013）對(duì)WSSV感染前后凡納濱對(duì)蝦肝胰腺轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因在WSSV感染前后的表達(dá)量存在顯著差異。這些研究結(jié)果提示W(wǎng)nt信號(hào)通路可能參與對(duì)蝦的先天性免疫應(yīng)答，但具體機(jī)理尚需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是一條多環(huán)節(jié)、多作用位點(diǎn)的關(guān)鍵信號(hào)通路，參與機(jī)體生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝等生物學(xué)過(guò)程，而β-鏈蛋白（β-catenin）是Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵作用因子（Kestler and Kühl，2008）。Zhang等（2016）的研究結(jié)果表明，凡納濱對(duì)蝦β-catenin基因被沉默后，其抗WSSV和副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的能力均顯著降低，說(shuō)明β-catenin基因在凡納濱對(duì)蝦抗病免疫中可能發(fā)揮重要作用。【本研究切入點(diǎn)】CTNNBL1全稱(chēng)為β-catenin like protein 1，其與β-catenin基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)相似，在功能上與β-catenin基因亦有關(guān)聯(lián)（Liu et al.，2008），但至今在對(duì)蝦類(lèi)物種中未見(jiàn)該基因的相關(guān)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】克隆凡納濱對(duì)蝦CTNNBL1基因（LvCTNNBL1），并進(jìn)一步分析其組織表達(dá)特征及應(yīng)答WSSV和副溶血弧菌感染的表達(dá)模式，旨在明確CTNNBL1基因在凡納濱對(duì)蝦抗病過(guò)程中的功能作用，為深入探討對(duì)蝦抗病免疫機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

凡納濱對(duì)蝦（8～10 g）購(gòu)自湛江騰飛實(shí)業(yè)有限公司，試驗(yàn)前在水族箱循環(huán)系統(tǒng)中暫養(yǎng)7 d，使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖環(huán)境。攜帶WSSV的凡納濱對(duì)蝦及副溶血弧菌由廣東海洋大學(xué)營(yíng)養(yǎng)與飼料實(shí)驗(yàn)室保存提供。RNeasy Mini Kit購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit購(gòu)自美國(guó)Clontech公司；PrimerScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit、LaTaq酶、pMD20-T載體、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、SYBR Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）購(gòu)自日本TaKaRa公司；膠回收試劑盒及DNA Marker購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1. 2 LvCTNNBL1基因cDNA全長(zhǎng)克隆及測(cè)序

根據(jù)前期凡納濱對(duì)蝦轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，獲得LvCTNNBL1基因的EST序列，利用Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)5'RACE和3'RACE特異性引物（表1），所有引物均由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。參照SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit使用說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄合成5'RACE和3'RACE所需的cDNA第一鏈模板，按照說(shuō)明要求進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，62～57 ℃（每循環(huán)遞減0.5 ℃）30 s，72 ℃ 2 min，進(jìn)行10個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，進(jìn)行28個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。RACE擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用膠回收試劑盒回收目的片段，然后與pMD20-T載體連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，陽(yáng)性克隆經(jīng)PCR鑒定后送至英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1. 3 LvCTNNBL1基因序列生物信息學(xué)分析

在NCBI網(wǎng)站上對(duì)測(cè)序所得結(jié)果進(jìn)行載體序列去除和拼接，然后進(jìn)行序列比對(duì)，利用EditSeq進(jìn)行開(kāi)放閱讀框（ORF）預(yù)測(cè)和氨基酸序列翻譯，并對(duì)蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域等信息進(jìn)行預(yù)測(cè)。在NCBI的Protein BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)中搜尋具有較高同源性的CTNNBL1蛋白質(zhì)序列，采用Clustal X進(jìn)行多序列比對(duì)和聚類(lèi)分析，再以Neighbour-Joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1. 4 LvCTNNBL1基因組織表達(dá)分析

凡納濱對(duì)蝦暫養(yǎng)1周后，隨機(jī)捕撈15尾，每5尾為一組，分別采集血細(xì)胞、肝胰腺、鰓、眼柄、肌肉、表皮、胃、腸、后盲囊、神經(jīng)和心臟等11個(gè)組織樣品，置于RNAlater中，室溫下放置1 h或4 ℃過(guò)夜后轉(zhuǎn)移至-80 ℃下保存。樣品總RNA的提取使用RNeasy Mini Kit試劑盒，并采用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒合成熒光定量PCR所需的cDNA模板。參照SYBR Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）說(shuō)明，對(duì)不同組織中LvCTNNBL1基因的表達(dá)情況進(jìn)行定量分析，以延伸因子1α（EF1α，GenBank序列號(hào)GU136229）基因作內(nèi)參基因，所用引物序列見(jiàn)表1；擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃ 5 s，57 ℃ 30 s，78 ℃ 5 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果采用2-△△Ct進(jìn)行分析。

1. 5 LvCTNNBL1基因應(yīng)答WSSV及副溶血弧菌感染的表達(dá)分析

WSSV懸液制備及副溶血弧菌培養(yǎng)鑒定分別參照Melena等（2015）和Balcázar等（2007）的方法。將凡納濱對(duì)蝦分為3組，每組80尾，分別注射WSSV懸液（106拷貝/g）、副溶血弧菌菌液（5.5×106 CFU/g）及PBS（對(duì)照），注射0、4、8、12、24、48和72 h后采集凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞，每3尾對(duì)蝦為一個(gè)混合樣品，每組同一個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3個(gè)平行，RT-PCR檢測(cè)LvCTNNBL1基因的表達(dá)情況，檢測(cè)結(jié)果經(jīng)2-△△Ct分析后采用t 檢驗(yàn)分析組間差異性。

2 結(jié)果與分析

2. 1 LvCTNNBL1基因cDNA全長(zhǎng)及序列分析結(jié)果

LvCTNNBL1基因（GenBank注冊(cè)號(hào)KX058563）全長(zhǎng)cDNA 1906 bp，包含127 bp的5'端非編碼區(qū)（5'UTR）、1692 bp的ORF區(qū)及87 bp的3'端非編碼區(qū)（3'UTR），編碼的蛋白序列含563個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量63.87 ku，等電點(diǎn)5.01（圖1）。SMART分析結(jié)果顯示，LvCTNNBL1氨基酸序列含有1個(gè)CTNNBL保守結(jié)構(gòu)域（殘基65～ 170）（圖2）。

2. 2 LvCTNNBL1蛋白多重序列比對(duì)分析結(jié)果

不同物種間的CTNNBL1蛋白保守性較強(qiáng)。經(jīng)同源性分析，發(fā)現(xiàn)LvCTNNBL1蛋白與其他物種CTNNBL1蛋白間的相似度較接近，相似性在72%～77%，其中與大型溞（Daphnia magna）CTNNBL1蛋白的相似性最高，為77%（圖3）。利用MEGA 5.0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析，結(jié)果顯示，LvCTNNBL1基因與多種無(wú)脊椎動(dòng)物CTNNBL基因聚為一類(lèi)，與同為節(jié)肢動(dòng)物的大型溞、西方蜜蜂（Apis mellifera）和美洲鱟（Limulus polyphemus）的親緣關(guān)系較近（圖4）。

2. 3 LvCTNNBL1基因的組織表達(dá)分析結(jié)果

采用RT-PCR對(duì)不同組織中LvCTNNBL1基因的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（圖5）顯示，LvCTNNBL1基因在凡納濱對(duì)蝦被檢測(cè)的11種組織中均有表達(dá)，以在神經(jīng)、血細(xì)胞、心臟、鰓、肝胰腺、胃及腸道中的表達(dá)量較高，在表皮、后盲囊、肌肉和眼柄中的表達(dá)量較低，其中在腸道中的表達(dá)量最高，約是眼柄中的74.32倍。

2. 4 LvCTNNBL1基因應(yīng)答WSSV感染的表達(dá)變化特征

注射感染W(wǎng)SSV后，凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞中LvCTNNBL1基因的表達(dá)量呈先下降后上升趨勢(shì)（圖6），在所有檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，該基因的表達(dá)量與對(duì)照組間存在顯著（P<0.05，下同）或極顯著（P<0.01，下同）差異。在注射感染W(wǎng)SSV后4、8和12 h，凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞中LvCTNNBL1基因的表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，并于注射后12 h達(dá)最低值，僅為對(duì)照組的57%；在注射感染W(wǎng)SSV后24、48和72 h，凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞中LvCTNNBL1基因的表達(dá)量極顯著高于對(duì)照組，并于注射后72 h達(dá)最大值，為對(duì)照組的3.04倍。

2. 5 LvCTNNBL1基因應(yīng)答副溶血弧菌感染的表達(dá)變化特征

由圖7可以看出，注射感染副溶血弧菌后4 h，凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞中LvCTNNBL1基因的表達(dá)量較對(duì)照組極顯著升高，在注射感染后8 h達(dá)最大值，為對(duì)照組的1.89倍；在注射感染24 h后，凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞中LvCTNNBL1基因的表達(dá)量又降至與對(duì)照組相當(dāng)?shù)乃剑唛g無(wú)顯著差異（P>0.05）。

3 討論

CTNNBL1基因最早在人類(lèi)細(xì)胞凋亡過(guò)程中被認(rèn)識(shí)（Jabbour et al.，2003），隨后的研究發(fā)現(xiàn)其多態(tài)性與人類(lèi)肥胖及記憶密切相關(guān)（Liu et al.，2008；Papassotiropoulos et al.，2013）。本研究從凡納濱對(duì)蝦中克隆獲得CTNNBL1基因，并發(fā)現(xiàn)其在應(yīng)答病原感染時(shí)的表達(dá)量產(chǎn)生顯著變化，提示LvCTNNBL1基因可能參與凡納濱對(duì)蝦抗病免疫。LvCTNNBL1基因編碼的蛋白包含一個(gè)CTNNBL結(jié)構(gòu)域，與已報(bào)道的其他物種CTNNBL1蛋白結(jié)構(gòu)一致（Chandra et al.，2013）。經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析，發(fā)現(xiàn)CTNNBL1基因被分為脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物兩組，凡納濱對(duì)蝦與多種無(wú)脊椎動(dòng)物聚集在一個(gè)分支上，且與同為節(jié)肢動(dòng)物的大型溞、西方蜜蜂和美洲鱟親緣關(guān)系較近，說(shuō)明在不同動(dòng)物中CTNNBL1基因進(jìn)化相對(duì)保守。

雖然目前已在多個(gè)物種中發(fā)現(xiàn)CTNNBL1基因，但絕大多數(shù)是通過(guò)高通量測(cè)序手段進(jìn)行鑒定，僅掌握相關(guān)序列的信息，缺乏深入研究，有關(guān)其表達(dá)及功能的信息主要集中在人類(lèi)。與人類(lèi)相似，LvCTNNBL1基因在凡納濱對(duì)蝦中也呈組成型表達(dá)，不具有組織特異性，但在不同組織中的表達(dá)量存在明顯差異。在人類(lèi)中，CTNNBL1基因在骨骼肌、胎盤(pán)、心臟、腎臟、睪丸及甲狀腺中表達(dá)量尤其高（Jabbour et al.，2003），而在凡納濱對(duì)蝦中，LvCTNNBL1基因在腸道、胃、肝胰腺、鰓、心臟、血細(xì)胞及神經(jīng)中表達(dá)量較高。可見(jiàn)，不同物種中CTNNBL1基因的表達(dá)模式存在較大差異，可能與物種的特異性相關(guān)。此外，作為β-catenin基因的類(lèi)似物，CTNNBL1基因在凡納濱對(duì)蝦中的表達(dá)模式與其比較相似，在腸道、鰓、血細(xì)胞及神經(jīng)組織中的表達(dá)量均較高（Zhang et al.，2016），提示CTNNBL1基因可能與β-catenin基因具有相似的功能。

在凡納濱對(duì)蝦的相關(guān)研究中已發(fā)現(xiàn)，Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵因子β-catenin基因被沉默后增強(qiáng)了機(jī)體應(yīng)答WSSV和副溶血弧菌感染的易感性，即β-catenin基因在凡納濱對(duì)蝦抗細(xì)菌和病毒感染的過(guò)程中發(fā)揮了積極作用（Chen et al.，2013；Zhang et al.，2016）。本研究結(jié)果顯示，在應(yīng)答WSSV和副溶血弧菌感染過(guò)程中，凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞中LvCTNNBL1基因的表達(dá)量均產(chǎn)生顯著變化，提示LvCTNNBL1基因可能也參與了凡納濱對(duì)蝦抗病免疫，具體原因可能與β-catenin基因類(lèi)似有關(guān)，但相關(guān)作用機(jī)制有待深入研究。本研究中，β-catenin基因在凡納濱對(duì)蝦感染W(wǎng)SSV后24 h內(nèi)的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，可能與對(duì)蝦處于WSSV潛伏期有關(guān)；而在感染24 h后β-catenin基因表達(dá)量極顯著升高，推測(cè)WSSV潛伏期已過(guò)，β-catenin基因通過(guò)正向調(diào)控來(lái)抵御病毒。相比之下，副溶血弧菌感染后4 h，凡納濱對(duì)蝦β-catenin基因表達(dá)量極顯著升高，提示細(xì)菌感染后β-catenin基因即發(fā)揮正向調(diào)控作用。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，LvCTNNBL1基因表達(dá)量在病毒和細(xì)菌感染時(shí)發(fā)生明顯變化，提示CTNNBL1基因可能參與了凡納濱對(duì)蝦的抗病免疫途徑。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）