沈進(jìn)娟 劉雪姣 冉廣葵 曾勝 于曉虎 楊仕偉 冷容 李娟 朱學(xué)棟

摘要：【目的】利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對莖瘤芥涪雜2號種子純度進(jìn)行檢測，為莖瘤芥及其他雜交種純度鑒定提供參考，也為加快涪雜2號的推廣應(yīng)用打下基礎(chǔ)?！痉椒ā恳郧o瘤芥雜交種涪雜2號、父母本及易混雜植株為試驗(yàn)材料，應(yīng)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合改良CTAB法快速提取DNA，進(jìn)行特異引物篩選及驗(yàn)證，對涪雜2號種子純度進(jìn)行快速檢測，并對檢測結(jié)果進(jìn)行田間表型鑒定?！窘Y(jié)果】從80對SSR特異引物中篩選出6對特異性強(qiáng)的引物，其中引物Na14-G06能清晰地?cái)U(kuò)增出父、母本的特異性條帶，并且雙親互補(bǔ)，該引物同時(shí)可將雜交種中的異源花粉植株分離出，其余5對引物可將機(jī)械混雜植株區(qū)分開；兩對引物聯(lián)用Na14-G06+Ol11-H02、Na14-G06+Na14-G10或Na14-G06+Ol12-D09能較好區(qū)分假雜株。利用所篩選引物對涪雜2號雜交種群體進(jìn)行SSR檢測，檢測結(jié)果顯示種子純度為95.8%，與田間生物學(xué)表現(xiàn)性狀檢測結(jié)果（96.7%）基本一致?！窘Y(jié)論】兩對引物聯(lián)用可用于涪雜2號雜交一代種子純度的快速檢測和準(zhǔn)確鑒定，SSR分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于莖瘤芥雜交種子純度檢測具有可行性。

關(guān)鍵詞： 莖瘤芥；種子純度；快速檢測；SSR分子標(biāo)記

中圖分類號： S339.31 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）07-1064-07

0 引言

【研究意義】莖瘤芥（Brassica juncea var. tumida Tsen & Lee）屬十字花科蕓薹屬植物，其加工產(chǎn)物榨菜是重慶市重要特色支柱產(chǎn)業(yè)之一。近年來，莖瘤芥鮮銷產(chǎn)物青菜頭已形成產(chǎn)業(yè)化并逐步發(fā)展壯大，不僅彌補(bǔ)了北方冬春新鮮蔬菜的淡季市場，還成為廣大菜農(nóng)增產(chǎn)增收、脫貧致富的重要途徑。涪雜2號是由重慶市渝東南農(nóng)業(yè)科學(xué)院（原重慶市涪陵區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所）選育出的瘤莖產(chǎn)量優(yōu)勢明顯、綜合性狀較好、提早播種15 d而不出現(xiàn)先期抽薹且收獲可提早45 d的優(yōu)良雜交一代新品種（范永紅等，2008），該品種可用作早市青菜頭的主栽品種（冷容等，2011），使用周期長，推廣面積大，目前對整個(gè)榨菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展有較大影響。涪雜2號種子的純度直接影響青菜頭的生產(chǎn)，莖瘤芥雜交種制種過程中易混入父母親本及異源花粉而造成純度下降，甚至存在一些不法商販人為摻入常規(guī)種出售假種子，致使大幅減產(chǎn)，嚴(yán)重影響菜農(nóng)的經(jīng)濟(jì)利益。因此，在莖瘤芥雜交種大面積種植之前快速準(zhǔn)確地鑒定種子質(zhì)量，是非常關(guān)鍵和必要的步驟?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】種子質(zhì)量優(yōu)劣通常利用田間生物學(xué)性狀進(jìn)行鑒定，但此法周期長、成本高，容易受外界環(huán)境和檢測人員水平的影響，難以適時(shí)準(zhǔn)確指導(dǎo)；酯酶同工酶（黎杰強(qiáng)等，2005）雖然對大多數(shù)品種能保證純度的鑒定，但對少數(shù)品種特別是雜種酶譜偏母本型的品種不能準(zhǔn)確鑒定。目前，作物品種鑒定和純度分析的檢驗(yàn)技術(shù)已經(jīng)從傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法發(fā)展到分子水平。在各種DNA分子標(biāo)記中，SSR分子標(biāo)記（孫海燕等，2014；周志成等，2014；李海梅等，2015；尤佳等，2015）在雜交種的鑒定和種子純度檢測方面具有很大優(yōu)越性且已得到廣泛應(yīng)用。SSR分子標(biāo)記技術(shù)直接反映品種的遺傳基礎(chǔ)差異，為種子的純度鑒定提供了一種更快速、高效的方法，具有試驗(yàn)操作簡單、結(jié)果穩(wěn)定可靠、引物序列易交流等優(yōu)點(diǎn)（李召華等，2006），可彌補(bǔ)和克服種子純度的形態(tài)學(xué)鑒定及同工酶電泳鑒定中的許多缺陷和難題，是對種子純度進(jìn)行快速、準(zhǔn)確鑒定的發(fā)展方向和必然選擇。隨著高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，海量EST、SNP數(shù)據(jù)被提交至數(shù)據(jù)庫并共享，為SNP的篩選創(chuàng)造了有利條件（蘭青闊等，2012），易于實(shí)現(xiàn)自動化。但由于莖瘤芥分子研究起步較晚，EST、SNP數(shù)據(jù)較少，目前還不便于SNP標(biāo)記?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】莖瘤芥雜交種涪雜2號種子從生產(chǎn)到播種時(shí)間間隔短，尤其是早市青菜頭比大面積生產(chǎn)播種提早10～15 d，能否快速準(zhǔn)確鑒定莖瘤芥雜交種涪雜2號種子純度非常關(guān)鍵，制約著早市青菜頭產(chǎn)業(yè)的快速健康發(fā)展。目前，對莖瘤芥雜交種種子純度的檢測常用田間種植法，而應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行莖瘤芥雜交種快速鑒定的研究尚無相關(guān)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】以涪雜2號、父母本及易混雜植株為試驗(yàn)材料，結(jié)合田間種子鑒定，利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)篩選出能清晰擴(kuò)增出父、母本的特異性條帶，并且雙親互補(bǔ)，同時(shí)可將雜交種中的機(jī)械混雜植株清晰分離出的SSR引物，建立一套快速檢測涪雜2號純度的方法，為莖瘤芥及其他雜交種的純度鑒定提供理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)參考，也為加快涪雜2號的推廣應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試材料為莖瘤芥雜交品種涪雜2號、其自交系父本920145和不育系母本96154-5A及易混雜植株，均由重慶市渝東南農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 基因組DNA提取 用于引物篩選的親本材料及雜交種基因組DNA，以及用于引物驗(yàn)證的人工混雜涪雜2號種子單株均采用CTAB法（曲士松等，2000）進(jìn)行提取。待鑒定的雜交種單株材料用改良CTAB法（王家保等，2006）提取并略有改進(jìn)（提取過程中不用液氮處理）。待種子發(fā)芽4～7 d后，剪取整株幼苗，置于研缽中，為減少泡沫，先加入200 μL CTAB快速研磨，再加入200 μL CTAB繼續(xù)研磨，轉(zhuǎn)移勻漿至1.5 mL離心管中；加入40 μL 5 mol/L醋酸鉀和400 μL氯仿，混勻；5000 r/min離心10 min，取上清液于新的離心管中；再用氯仿抽提1次，取上清液于新的離心管中；加入2/3體積預(yù)冷的異丙醇（或無水乙醇），混勻；12000 r/min離心5 min；沉淀用70%酒精清洗1～2次，晾干，加入適量ddH2O溶解DNA，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 SSR標(biāo)記驗(yàn)證和鑒定 試驗(yàn)參照Chen等（2011）已公布的SSR序列，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成80對SSR引物序列，分子標(biāo)記所用試劑及DNA Marker由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。經(jīng)PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序優(yōu)化，PCR反應(yīng)體系15.000 μL：10 μmol/L上、下游引物各0.400 μL，DNA模板1.000 μL，10×PCR Buffer 1.500 μL，25 mmol/L MgCl2 1.000 μL，10 mmol/L dNTP Mixture 0.225 μL，5 U/μL Tap DNA聚合酶0.150 μL，加ddH2O補(bǔ)足至15.000 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 40 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min（每個(gè)循環(huán)降1 ℃），進(jìn)行11個(gè)循環(huán)；95 ℃ 40 s，52 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min；4 ℃低溫保存（Chen et al.，2011）。擴(kuò)增產(chǎn)物在10%變性聚丙烯酞胺凝膠上電泳分離，0.2%硝酸銀染色，1.5%氫氧化鈉和0.4%甲醛顯色，顯色3～5 min后拍照。

1. 2. 3 田間表型性狀鑒定 2014年8～12月，人工混雜一小批涪雜2號種子，在重慶市渝東南農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)地種植，使其農(nóng)藝性狀充分展現(xiàn)，與篩選引物擴(kuò)增圖進(jìn)行一一比較，驗(yàn)證引物分離假雜株的準(zhǔn)確性，將SSR鑒定結(jié)果與田間種植鑒定結(jié)果進(jìn)行比對，驗(yàn)證SSR標(biāo)記鑒定的有效性。2015年6～8月，選擇一批待鑒定的涪雜2號種子進(jìn)行鑒定，將其均勻地撒播到苗床地，待植株長到4～5片真葉時(shí)開始鑒定，根據(jù)植株株型、葉型、葉緣、葉色、有無刺毛、有無臘粉等，對雜交種進(jìn)行田間純度鑒定。

2 結(jié)果與分析

2. 1 特異引物篩選

利用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行種子純度檢測的重要前提是篩選合適引物，共顯性是進(jìn)行雜交種純度檢測的理想類型，對篩選的引物應(yīng)同時(shí)具有較高的穩(wěn)定性和重復(fù)性。本研究利用80對特異性好的SSR引物，對涪雜2號、父母本及從涪雜2號群體中選擇性狀典型的油菜類、抱子芥類和白菜類雜株進(jìn)行引物篩選，最終獲得6對特異性引物（表1），其中1對共顯性的SSR引物Na14-G06能清晰地?cái)U(kuò)增出父、母本的特異性條帶，其余5對可將機(jī)械混雜植株分離開。擴(kuò)增結(jié)果表明，引物Na14-G06（圖1-A）可同時(shí)將父、母親本及雜交種中的機(jī)械混雜植株從涪雜2號中清晰分離出；引物Ol11-H02（圖1-B）可清晰分離機(jī)械混雜植株的類型和數(shù)量；引物Na14-G10（圖1-C）可清晰分辨機(jī)械混雜植株數(shù)量，但無法確定混入雜株的類型；引物Ol12-D09（圖1-D）能清晰分離油菜類雜株和抱子芥類雜株，但對白菜類雜株的分離效果不太清晰；引物Na12-C01（圖1-E）和Na10-G08（圖1-F）能清晰分離油菜類和白菜類雜株，但無法分離抱子芥類雜株。

2. 2 引物驗(yàn)證

為驗(yàn)證篩選出的引物對涪雜2號及其父母本，以及機(jī)械混雜植株分離的準(zhǔn)確性，將表型鑒定出的混雜單株與引物擴(kuò)增圖譜進(jìn)行逐一比對。隨機(jī)選擇32株人工混雜種子，統(tǒng)計(jì)田間鑒定雜株率及機(jī)械混雜種子的類型，田間調(diào)查結(jié)果顯示，3株為油菜類雜株，4株為抱子芥類雜株，3株為白菜類雜株，1株為母本雜株，1株為父本雜株，其余為涪雜2號。用CTAB法提取田間鑒定的植株DNA，分別用篩選出的分離效果較好的4對特異引物（Na14-G06、Ol11-H02、Na14-G10、Ol12-D09）進(jìn)行擴(kuò)增，SSR鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果一致，引物Na14-G06（圖2）鑒定出假雜株12株，引物Ol11-H02（圖3）鑒定出機(jī)械混雜植株10株及其類型；引物Na14-G10（圖4）鑒定出10株機(jī)械混雜植株；引物Ol12-D09（圖5）鑒定結(jié)果與引物Ol11-H02一致，但白菜類雜株分離不太清晰。引物擴(kuò)增結(jié)果顯示鑒定出的每個(gè)假雜單株類型與田間表型一致。

在種子生產(chǎn)過程中需既節(jié)約成本又?jǐn)?shù)據(jù)可靠，為確保機(jī)械混雜植株被全部鑒定出來，通常選擇2對引物進(jìn)行檢測，以期有效鑒定種子純度。本研究發(fā)現(xiàn)，通過引物Na14-G06對雜交種雜株數(shù)量及類型的初步鑒定，結(jié)合田間雜株類型的不同，可有針對性選擇特異性強(qiáng)的引物對機(jī)械混雜植株進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，引物Ol12-D09對油菜類和抱子芥類雜株、Ol11-H02對白菜類雜株能更有效鑒定出來，Na14-G10對所有機(jī)械混雜植株能更清晰分離出。因此，綜合SSR引物擴(kuò)增條帶的特異性，選擇兩對引物聯(lián)用Na14-G06+Ol11-H02、Na14-G06+Na14-G10或Na14-G06+Ol12-D09可準(zhǔn)確快速鑒定涪雜2號種子純度。

2. 3 雜交種純度鑒定

利用引物Na14-G06對120株涪雜2號雜交種群體進(jìn)行SSR檢測，對比莖瘤芥雜交種及其父、母本的譜帶特征，統(tǒng)計(jì)出涪雜2號雜交種樣品中具有雙親特異帶型的植株數(shù)量和只具有父、母本帶型的假雜種數(shù)量及機(jī)械混雜油菜和白菜類雜株的譜帶特征，電泳結(jié)果顯示，涪雜2號雜交種中異型株共5株，其中擁有母本條帶1株，父本條帶2株，油菜類雜株1株，白菜類雜株1株；用引物Ol11-H02、Na14-G10和Na14-G10分別進(jìn)行驗(yàn)證，均鑒定出油菜類和白菜類雜株各1株，與引物Na14-G06對機(jī)械混雜植株的鑒定結(jié)果一致，SSR標(biāo)記鑒定結(jié)果表明本批涪雜2號群體的種子純度為95.8%（圖6）。

2. 4 田間種植鑒定

大田種植涪雜2號雜交種及其父母本材料（圖7），通過植株株型、裂片數(shù)、葉形、葉色等表型癥狀鑒定，同時(shí)從涪雜2號群體中隨機(jī)選取300株植株進(jìn)行表型性狀鑒定，發(fā)現(xiàn)有290株表現(xiàn)為葉緣淺裂細(xì)鋸齒、葉形長橢，無臘粉，鑒定為涪雜2號；1株葉緣近全緣，葉面微皺、葉形倒卵圓，無臘粉，鑒定為母本雜株；3株葉面中皺、葉緣淺裂粗鋸齒、葉形長橢，無臘粉，鑒定為父本雜株；4株葉色灰綠、有臘粉、葉柄比葉片長，鑒定為油菜類雜株；2株葉色淺綠、葉柄寬厚，鑒定為白菜類雜株；田間檢測結(jié)果顯示該批涪雜2號群體種子純度為96.7%。

3 討論

SSR分子標(biāo)記具有多態(tài)性好、重復(fù)性高、操作簡便的特點(diǎn)，被認(rèn)為是一種發(fā)展前景良好的DNA指紋技術(shù)（蘇順宗等，2003），已被廣泛用于雜交種純度鑒定（劉軍等，2013；陰云伙等，2015；楊宏等，2016）、生物遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建（王兵偉等，2014；徐海風(fēng)等，2014；楊章旗等，2014；倪先林等，2015；王清明等，2016）等。SSR的高分辨力及其共顯性遺傳特點(diǎn)在雜交種純度鑒定方面具有快速穩(wěn)定、成本低廉、多態(tài)性豐富等特點(diǎn)（譚智丹等，2006）。盡管莖瘤芥材料遺傳基礎(chǔ)狹窄，但本研究結(jié)果表明，SSR分子標(biāo)記對莖瘤芥雜交種涪雜2號及其父母本有較好的區(qū)分效果，且SSR分子標(biāo)記鑒定與田間鑒定結(jié)果吻合度高。但由于表型鑒定屬傳統(tǒng)鑒定方法，鑒定時(shí)的外界生長環(huán)境必須嚴(yán)格控制，只有在植株生長整齊一致時(shí)的檢測結(jié)果才較可靠，若檢測時(shí)植株生長不整齊、外界環(huán)境發(fā)生變化，檢測結(jié)果均會受到影響。每年新生產(chǎn)榨菜雜交種的田間檢測正值高溫干旱時(shí)期，苗期管理難度大，極易造成鑒定用苗的損失，耽誤檢測時(shí)間并增大檢測誤差。進(jìn)行大田生產(chǎn)和大量種子純度檢測時(shí)，檢測結(jié)果因環(huán)境多變會受到一定影響，分子標(biāo)記檢測既節(jié)省時(shí)間又可隨到隨檢，能確保高效、快速、準(zhǔn)確地檢測出種子純度。盡管進(jìn)行引物篩選的過程較復(fù)雜，但篩選出適合的引物應(yīng)用時(shí)操作則非常簡單和便捷，其準(zhǔn)確性和快速性田間檢測在一定程度上無法比擬。雜交種在實(shí)際推廣應(yīng)用時(shí)最好將兩種方法相結(jié)合，既能確保雜交種安全生產(chǎn)，又能加快雜交新品種推廣進(jìn)程。

本研究結(jié)果測得田間種子檢測純度略高于SSR檢測純度，與前人在茄子（劉軍等，2013）、辣椒（吉振勇等，2014）、雜交粳稻（孫海燕等，2014）及甜瓜（周志成等，2014）種子純度檢測方面的研究結(jié)果一致。這是由于在田間鑒定時(shí)苗期植株性狀未能充分顯示，其親本尤其是母本與雜交種植株極其相似，不易辨認(rèn)，容易遺漏部分親本植株。田間鑒定過程中對操作人員的專業(yè)素質(zhì)要求也比較高，專業(yè)人員對雜種及其親本農(nóng)藝性狀的了解程度會直接影響調(diào)查結(jié)果（孫海燕等，2014）。針對混雜的油菜類、芥菜類和白菜類蔬菜苗期田間鑒定較易辨認(rèn)，不易混淆，SSR檢測時(shí)該類雜株電泳譜帶也明顯不同于涪雜2號電泳譜帶。雜交種生產(chǎn)過程中由于隔離不嚴(yán)、蜜蜂串粉，或少量父本混種到母本中，對雜交種純度均會產(chǎn)生一定影響；為保證雜交種純度，建議遠(yuǎn)離其他十字花科類蔬菜進(jìn)行雜交種制種。莖瘤芥整個(gè)生長周期較長（180～200 d），期間種子還需休眠，從制種到使用種子的過程間隔時(shí)間短，農(nóng)藝性狀在苗期還未充分顯示時(shí)就必須進(jìn)行鑒定，否則影響種子的包裝、銷售和大面積種植及早市青菜頭的種植，因此快速準(zhǔn)確鑒定莖瘤芥雜交種純度顯得非常必要。采用SSR分子標(biāo)記檢測雜交種，種子發(fā)芽4～7 d后便可快速鑒定出雜交種純度，與田間純度鑒定相比，SSR分子標(biāo)記鑒定方法快速、高效，不受檢測季節(jié)和環(huán)境條件限制，且可根據(jù)需要隨時(shí)檢測，能確保新品種的及時(shí)推廣，也為種子營銷贏得時(shí)間（楊瑞環(huán)等，2012）。

4 結(jié)論

本研究應(yīng)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對莖瘤芥雜交種涪雜2號進(jìn)行純度檢測及分析，結(jié)果表明，選用的80對SSR引物中有6對特異性引物，其中共顯性引物Na14-G06可將父、母親本及機(jī)械混雜的植株清晰分離出，其余5對可將機(jī)械混雜植株分離出，兩對引物聯(lián)用可用于涪雜2號雜交一代種子純度的快速檢測和準(zhǔn)確鑒定，SSR分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于莖瘤芥雜交種子純度檢測具有可行性。

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（責(zé)任編輯 王 暉）