覃振師 鄧立寶 王文林 陳海生 譚德錦 黃錫云 湯秀華

摘要：【目的】分析廣西崇左市山黃皮種質(zhì)資源的遺傳多樣性，為山黃皮資源的分類、鑒定、保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。【方法】調(diào)查和收集廣西崇左市龍州縣、寧明縣、憑祥市、江州區(qū)、天等縣、扶綏縣和大新縣7個(gè)縣（市、區(qū)）的山黃皮種質(zhì)資源，并進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增、聚類分析和主成分分析?！窘Y(jié)果】15條多態(tài)性ISSR引物可從50份山黃皮種質(zhì)資源中擴(kuò)增出136條帶，多態(tài)性條帶比例為55.15%；各山黃皮種質(zhì)間的相似系數(shù)在0.769～0.942，平均0.875。聚類分析結(jié)果顯示，ISSR分子標(biāo)記能將供試材料完全區(qū)分，在遺傳相似系數(shù)0.864處，可將50份山黃皮種質(zhì)資源聚為A、B兩大組，其中A組包括來(lái)自龍州縣、寧明縣、憑祥市、江州區(qū)和扶綏縣的40份種質(zhì)，B組包括來(lái)自天等縣和大新縣的10份種質(zhì)。主成分分析結(jié)果表明，前三主成分貢獻(xiàn)率依次為12.11%、8.73%和7.68%，累積貢獻(xiàn)率為28.52%；主成分分析可將50份山黃皮種質(zhì)資源分為兩大類，與聚類分析結(jié)果基本一致?！窘Y(jié)論】廣西崇左市山黃皮種質(zhì)資源較豐富，大部分山黃皮種質(zhì)親緣關(guān)系較接近，且與地理起源有一定的相關(guān)性，NM9、TD1、DX2和JZ5等遺傳差異較大的種質(zhì)可作為山黃皮優(yōu)良品種和單株選育及良種繁育等研究的重要材料。

關(guān)鍵詞： 山黃皮；種質(zhì)資源；ISSR；廣西崇左市

中圖分類號(hào)： S663.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）07-1071-06

0 引言

【研究意義】山黃皮[Clausena indica （Dalz.） Oliv]俗稱雞皮果，為蕓香科柑桔亞科黃皮屬（Clausena）多年生常綠大灌木或小喬木，其果實(shí)和樹(shù)葉均具有特殊香味，果皮、核、根可入藥，是優(yōu)良調(diào)味佳品，且具有生津止渴的功效，其用途廣泛，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高（黃峰等，2005；梁立娟等，2011）。山黃皮主要分布于南亞熱帶地區(qū)的中國(guó)、越南、菲律賓等國(guó)家，在我國(guó)主要分布于廣西西南部、云南南部、廣東新會(huì)等地（藍(lán)慶江等，2008；覃振師等，2012）。廣西崇左市是我國(guó)最重要的山黃皮產(chǎn)區(qū)之一，資源豐富，分布范圍廣，但其山黃皮研究基礎(chǔ)薄弱，缺乏系統(tǒng)調(diào)查資料和遺傳多樣性信息，山黃皮品種分類較混淆，主觀性大，仍存在同物異名和同名異物的現(xiàn)象，影響了山黃皮種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)、利用和保護(hù)。因此，調(diào)查廣西崇左市山黃皮種質(zhì)資源并研究其遺傳多樣性，對(duì)制定山黃皮產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃、開(kāi)展科學(xué)研究和指導(dǎo)生產(chǎn)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來(lái)，分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于黃皮屬種質(zhì)資源研究。劉小梅等（2007）對(duì)影響RAPD-PCR擴(kuò)增的Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物濃度及退火溫度等因素進(jìn)行優(yōu)化，建立了黃皮RAPD-PCR反應(yīng)體系。蔣素梅等（2008）采用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)廣東、廣西廣泛栽培的14個(gè)黃皮品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，將供試黃皮品種（系）劃分為3個(gè)類群，與形態(tài)分類有一定的相似性，基本反映了黃皮品種間的遺傳多樣性。李開(kāi)拓等（2009a，2009b）對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)中的主要影響因子進(jìn)行單因素和正交試驗(yàn)，建立了適宜黃皮ISSR分析的擴(kuò)增體系；并采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)40個(gè)黃皮品種的遺傳多樣性進(jìn)行分析，將供試黃皮材料分為5組，與形態(tài)學(xué)具有一定的相關(guān)性，但比形態(tài)分類更嚴(yán)格，在風(fēng)味、種子等方面分類重復(fù)少。Zhao等（2010）從100個(gè)RAPD引物中篩選出1個(gè)與無(wú)核基因相連鎖的引物，可用于有效鑒定雜交種群體中的無(wú)核黃皮?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前人對(duì)黃皮屬種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究主要集中在黃皮栽培品種和育種材料，目前有關(guān)山黃皮種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究鮮見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)查閱相關(guān)資料、走訪專家、實(shí)地調(diào)查和生物學(xué)鑒定，對(duì)廣西崇左市山黃皮種質(zhì)資源進(jìn)行調(diào)查研究，并以簡(jiǎn)單重復(fù)序列分子標(biāo)記（ISSR）對(duì)其進(jìn)行遺傳多樣性分析，為山黃皮種質(zhì)資源的分類鑒定、優(yōu)良品種培育和資源保護(hù)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試材料為從崇左市龍州縣、寧明縣、憑祥市、江州區(qū)、天等縣、扶綏縣和大新縣7個(gè)縣（市、區(qū)）收集的50份山黃皮種質(zhì)資源（表1）。聚乙烯吡咯烷酮（CTAB）、DNA Marker、dNTPs、Tris-HCl等試劑購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，Taq DNA聚合酶購(gòu)自上海英駿生物技術(shù)有限公司。采用的引物參照加拿大哥倫比亞大學(xué)（UBC）公布的引物序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 DNA提取 采用改良的SDS法（陳國(guó)平等，2011）提取山黃皮葉片DNA，用紫外分光光度計(jì)和1.0%

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的濃度和質(zhì)量，將各樣品的總DNA稀釋至30 ng/μL。

1. 2. 2 引物篩選 用3個(gè)遺傳差異較大的山黃皮DNA樣品對(duì)合成的ISSR引物進(jìn)行篩選，選取多態(tài)性好、擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰的15條引物用于所有DNA樣品擴(kuò)增。

1. 2. 3 PCR擴(kuò)增 在Biometra Tprofessional PCR儀上進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系20.0 μL：模板DNA 1.0 μL，10×Buffer（含Mg2+）2.0 μL，4.0 mmol/L dNTPs 0.5 μL，30 μmol/L引物1.0 μL，0.40 U DNA聚合酶0.5 μL，加ddH2O補(bǔ)足至20.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 45 s，復(fù)性退火（溫度隨引物而定）1 min，72 ℃ 2 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1. 3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)分子標(biāo)記的遷移率及其有無(wú)，統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品的擴(kuò)增電泳譜帶，構(gòu)建“0、1”二元數(shù)據(jù)矩陣，采用NTsys 2.10計(jì)算遺傳相似性系數(shù)。在遺傳相似系數(shù)矩陣的基礎(chǔ)上進(jìn)行主成分分析和聚類分析，繪制樹(shù)狀聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 ISSR標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果

篩選到15條多態(tài)性ISSR引物，并對(duì)50份山黃皮種質(zhì)資源進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出136條帶，其中多態(tài)性條帶75條，多態(tài)性比例為55.15%，說(shuō)明供試樣品的遺傳多樣性較低。每條引物可擴(kuò)增出6～15條帶，平均9.01條；產(chǎn)物條帶介于250～2200 bp，以400～1500 bp居多（圖1和表2）。

2. 2 相似系數(shù)分析結(jié)果

用NTsys 2.10計(jì)算出15條ISSR引物擴(kuò)增結(jié)果在不同種質(zhì)間的相似系數(shù)，平均遺傳相似性系數(shù)為0.875。DX2與JZ5的相似系數(shù)最小，為0.769，與兩者果形及其他表型性狀上存在較大差異相吻合；TD1與TD4的相似系數(shù)最大，為0.942，兩者在形態(tài)上較相似。

2. 3 聚類分析結(jié)果

用UPGMA構(gòu)建50份山黃皮種質(zhì)的分子系統(tǒng)樹(shù)（圖2），從聚類分析圖可以看出，不同山黃皮種質(zhì)間的親緣關(guān)系較復(fù)雜。在相似系數(shù)0.864處，可將50份山黃皮種質(zhì)分成A、B兩大組。A組包含40份種質(zhì)，可分2個(gè)亞組：第I亞組包含28份種質(zhì)，其中16份種質(zhì)來(lái)自龍州縣，7份種質(zhì)來(lái)自寧明縣，5份種質(zhì)來(lái)自憑祥市；第II亞組包含12份種質(zhì)，其中6份種質(zhì)來(lái)自江州區(qū)，4份種質(zhì)來(lái)自扶綏縣，2份種質(zhì)來(lái)自寧明縣。B組包含10份種質(zhì)，可分2個(gè)亞組：第I亞組包含8份種質(zhì)，其中4份種質(zhì)來(lái)自天等縣，4份種質(zhì)來(lái)自大新縣；第II亞組包含2份種質(zhì)，均來(lái)自大新縣。

2. 4 主成分分析結(jié)果

應(yīng)用NTsys 2.10在遺傳相似系數(shù)矩陣基礎(chǔ)上對(duì)50份山黃皮種質(zhì)資源進(jìn)行主成分分析，前三主成分貢獻(xiàn)率依次為12.11%、8.73%和7.68%，累積貢獻(xiàn)率為28.52%，可以代表原始數(shù)據(jù)的主要信息。從二維聚類圖（圖3）可看出，50份山黃皮種質(zhì)可分為A、B兩個(gè)群體，與聚類分析結(jié)果基本一致；供試山黃皮種質(zhì)占的空間較小，分布較均勻，表明其遺傳背景較狹窄，遺傳基礎(chǔ)較一致。

3 討論

崇左市位于廣西西南部，地跨東經(jīng)106°33′～108°6′、北緯21°36′～23°22′，地形以山地為主，海拔在79.4～1358.0 m，其山黃皮種質(zhì)資源豐富，很多地方仍保存著野生居群。黃皮屬有30多個(gè)種，黃皮和山黃皮是其中的兩個(gè)栽培種（李開(kāi)拓，2008；劉冰浩等，2014）。目前對(duì)黃皮屬的遺傳多樣性研究多為黃皮栽培種，而關(guān)于山黃皮遺傳多樣性的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。姜燕等（2005）對(duì)黃皮和山黃皮的染色體進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)種均為二倍體，染色體數(shù)目為18，核型類型相同，親緣關(guān)系較接近。王惠君等（2015）對(duì)24份廣西黃皮種質(zhì)資源進(jìn)行分析，在遺傳相似系數(shù)0.718處將黃皮種質(zhì)分為三大組，第Ⅰ和第Ⅱ組為黃皮種的不同品種，第Ⅲ組為山黃皮種，山黃皮種和黃皮種間的最小遺傳相似系數(shù)為0.660。也有研究結(jié)果表明，黃皮種的不同品種間親緣關(guān)系較近，如劉小梅等（2007）對(duì)36個(gè)黃皮基因組DNA進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，結(jié)果表明，大多數(shù)黃皮種質(zhì)相似系數(shù)在0.90～0.97，親緣關(guān)系較近；蔣素梅等（2008）對(duì)14個(gè)黃皮品種（系）進(jìn)行RAPD分析，結(jié)果表明，大多數(shù)黃皮品種（系）間遺傳差異較小，遺傳距離為0.025～0.300，遺傳基礎(chǔ)較狹窄；李開(kāi)拓等（2009b）采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)40份黃皮種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，供試的黃皮品種間平均遺傳相似系數(shù)高達(dá)0.841，遺傳多樣性很低。本研究采用ISSR分子標(biāo)記可將供試的50份山黃皮種質(zhì)資源區(qū)分開(kāi)，從ISSR分析獲得的遺傳相似系數(shù)來(lái)看，大部分山黃皮種質(zhì)相似系數(shù)在0.860以上，遺傳相似性較大，親緣關(guān)系也較近，說(shuō)明供試的山黃皮種質(zhì)遺傳多樣性較低，可能與取材范圍較狹窄有關(guān)。

本研究中，來(lái)自崇左市北部的大新縣和天等縣的山黃皮種質(zhì)被歸到一組，來(lái)自龍州縣、寧明縣、江州區(qū)、憑祥市、扶綏縣的種質(zhì)被歸到另一組；來(lái)自崇左市西南部的龍州縣、寧明縣和憑祥市的種質(zhì)被歸到同一亞組，來(lái)自崇左市中部的江州區(qū)和東部的扶綏縣的種質(zhì)被歸到同一亞組，說(shuō)明山黃皮種質(zhì)資源的親緣關(guān)系與地理起源有一定的相關(guān)性。桂研20號(hào)與來(lái)自龍州縣、寧明縣和憑祥市的種質(zhì)親緣關(guān)系比較接近，可能與品種選育的親本來(lái)源較近和山黃皮資源的基因交流有關(guān)。有少量的山黃皮種質(zhì)間存在較大的遺傳差異，如DX2和JZ5的遺傳距離為0.769，NM9和TD1的遺傳距離為0.788，其在果形、葉形等表型性狀上也存在較明顯差異。因此，這些在形態(tài)和遺傳上差異較大的種質(zhì)可作為山黃皮單株選育、良種繁育等研究的重要材料。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，廣西崇左市山黃皮種質(zhì)資源較豐富，大部分山黃皮種質(zhì)親緣關(guān)系較接近，且與地理起源有一定的相關(guān)性，NM9、TD1、DX2和JZ5等遺傳差異較大的種質(zhì)可作為山黃皮優(yōu)良品種和單株選育及良種繁育等研究的重要材料。

參考文獻(xiàn)：

陳國(guó)平，劉冰浩，冷付春，牛英，王小欣，李子健，陳傳武，陳海生，梁其波. 2011. 山黃皮上柑橘木虱發(fā)生調(diào)查初報(bào)[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，42（12）：1497-1499.

Chen G P，Liu B H，Leng F C，Niu Y，Wang X X，Li Z J，Chen C W，Chen H S，Liang Q B. 2011. Preliminary reports on host-vector relationship between Clausena anisum-olens and Citrus psylla[J]. Journal of Southern Agriculture， 42（12）：1497-1499.

黃峰，何銑揚(yáng)，雷艷梅. 2005. 極具發(fā)展前景的山黃皮果[J]. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)，（4）：30-31.

Huang F，He X Y，Lei Y M. 2005. Clausena anisum-olena with potential prospect[J]. China Tropical Agriculture，（4）：30-31.

蔣素梅，馮莉，林德球. 2008. 14個(gè)黃皮品種（系）的RAPD分析[J]. 亞熱帶植物科學(xué)，37（2）：26-29.

Jiang S M，F(xiàn)eng L，Lin D Q. 2008. RAPD analysis of 14 wampee cultivars[J]. Subtropical Plant Science，37（2）：26-29.

姜燕，郭啟高，李春艷，李曉林，梁國(guó)魯，謝江輝. 2005. 黃皮屬2個(gè)種的染色體分析[J]. 西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 27（4）：543-546.

Jiang Y，Guo Q G，Li C Y，Li X L，Liang G L，Xie J H. 2005. Chromosome karyotype analysis of two species in Clausena[J]. Journal of Southwest Agricultural University（Natural Science），27（4）：543-546.

藍(lán)慶江，覃振師，趙大宣，何銑揚(yáng)，韋持章. 2008. 山黃皮桂研15號(hào)的主要性狀及其栽培技術(shù)[J]. 中國(guó)南方果樹(shù)，37（5）：38-39.

Lan Q J，Qin Z S，Zhao D X，He X Y，Wei C Z. 2008. Main cha-

racteristics and cultivation technology of Clausena anisum-olena cultivar Guiyan 15[J]. South China Fruits，37（5）：38-39.

李開(kāi)拓. 2008. 黃皮（Clausena lansium Lour.）種質(zhì)資源的ISSR分析[D]. 福州：福建農(nóng)林大學(xué).

Li K T. 2008. ISSR analysis of germplasm resources of Clausena lansium Lour.[D]. Fuzhou：Forest University of Fujian.

李開(kāi)拓，趙依杰，鐘鳳林，王江波，施維屬，潘東明. 2009a. 黃皮ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，25（19）：37-41.

Li K T，Zhao Y J，Zhong F L，Wang J B，Shi W S，Pan D M. 2009a. Optimization of ISSR-PCR reaction system in wampee[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin，25（19）：37-41.

李開(kāi)拓，鐘鳳林，郭志雄，潘騰飛，王江波，潘東明. 2009b. 40個(gè)黃皮品種的ISSR分析[J]. 亞熱帶植物科學(xué)，38（4）：22-26.

Li K T，Zhong F L，Guo Z X，Pan T F，Wang J B，Pan D M. 2009b. ISSR analysis of 40 wampee cultivars[J]. Subtropical Plant Science，38（4）：22-26.

梁立娟，農(nóng)耀京，韋璐陽(yáng)，趙大宣. 2011. 山黃皮果揮發(fā)油成分研究[J]. 農(nóng)業(yè)研究與應(yīng)用，（4）：16-19.

Liang L J，Nong Y J，Wei L Y，Zhao D X. 2011. Analysis of chemical constituents of the essential oil from the fruits of Clausena anisum-olena（Blauco） Merr.[J]. Agriculture Research and Application，（4）：16-19.

劉冰浩，陳貴峰，丁萍，陳國(guó)平，牛英，李子健，陳海生，梁其波. 2014. 廣西桂南山黃皮中柑橘黃龍病菌常規(guī)PCR檢測(cè)初報(bào)[J]. 南方園藝，25（6）：22-23.

Liu B H，Chen G F，Ding P，Chen G P， Niu Y， Li Z J， Chen H S， Liang Q B. 2014. Preliminary reports on regular PCR detection of candidatus Liberibacter asiaticus in Clausena anisum-olena in south of Guangxi[J]. Southern Horticulture，25（6）：22-23.

劉小梅，潘建平，曾楊，林志雄，匡石滋，田世堯，姜玲. 2007. 黃皮種質(zhì)資源的RAPD分析[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，34（2）：13-15.

Liu X M，Pan J P，Zeng Y，Lin Z X，Kuang S Z，Tian S Y，Jiang L. 2007. RAPD analysis of germplasm resources of Clausena lansium[J]. Guangdong Agricultural Sciences，34（2）：13-15.

覃振師，韋持章，何銑揚(yáng)，羅蓮鳳，王文林，鄭樹(shù)芳，邱文武，覃杰鳳. 2012. 廣西崇左市野生山黃皮種質(zhì)資源調(diào)查與開(kāi)發(fā)利用[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，39（5）：138-139.

Qin Z S，Wei C Z，He X Y，Luo L F，Wang W L，Zheng S F，Qiu W W，Qin J F. 2012. Investigation and utilization of Clausena anisum-olena germplasm resources in Chongzuo city， Guangxi[J]. Guangdong Agricultural Sciences，39（5）：138-139.

王惠君，盧誠(chéng)，黎明，陳友. 2015. 廣西優(yōu)質(zhì)黃皮種質(zhì)資源ISSR分子遺傳多樣性分析[J]. 河北林業(yè)科技，（3）：1-4.

Wang H J，Lu C，Li M，Chen Y. 2015. Analysis on the genetic diversity of Clausena lansium germplasm resources in Guangxi using ISSR molecular markers[J]. The Journal of Hebei Forestry Science and Technology，（3）：1-4.

Zhao Z C，Hu G B，Ou Y G，Liu Y C，Yi Y，Chen Y Y. 2010. The earlier identification of the seedless characteristic of the wampee[Clausena lansium（Lour.） Skeels] hybrid by a random amplified polymorphic DNA（RAPD） marker[J]. A-

frican Journal of Biotechnology，9（50）：8578-8583.

（責(zé)任編輯 羅 麗）