李闊闊,王鈺,2*,萬田,莊曉曉

1(安徽大學(xué) 資源與環(huán)境工程學(xué)院，安徽 合肥,230601) 2(安徽省中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心，安徽 合肥,230601)

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高產(chǎn)洛伐他汀紅曲霉氮離子束誘變育種

李闊闊1,王鈺1,2*,萬田1,莊曉曉1

1(安徽大學(xué) 資源與環(huán)境工程學(xué)院，安徽 合肥,230601) 2(安徽省中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心，安徽 合肥,230601)

摘要為了提高洛伐他汀產(chǎn)量，以紅曲霉M14為出發(fā)菌株進(jìn)行N+束誘變。誘變劑量分別為：78×1013、130×1013、182×1013、234×1013N+/cm2,通過高效液相色譜檢測誘變菌株發(fā)酵產(chǎn)物中洛伐他汀的含量，篩選正突變菌株。結(jié)果顯示,誘變劑量為130×1013N+/cm2時(shí)表現(xiàn)出相對(duì)較高的正突變率。最優(yōu)誘變菌株M50-2洛伐他汀產(chǎn)量4.42 mg/g,相對(duì)于出發(fā)菌株提高70%。對(duì)其進(jìn)行12次傳代培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)洛伐他汀的能力下降了2.3%，表現(xiàn)為良好的遺傳穩(wěn)定性，該菌株具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞紅曲霉；洛伐他?。坏x子束；誘變

紅曲菌(Monascus)是一種絲狀腐生真菌,屬于子囊菌綱(Aseomyeetes),紅曲菌科(Monascaceae)[1]，能夠產(chǎn)生紅曲色素[2-3]、洛伐他汀[4-5]等次生代謝產(chǎn)物。其中洛伐他汀是1979年ENDO從紅曲霉(Monascusruber)發(fā)酵培養(yǎng)液中分離出的一種物質(zhì)，它在體內(nèi)競爭性抑制膽固醇合成限速酶 (HMG-CoA)還原活性，阻斷內(nèi)源性膽固醇合成[6-10]，從而有效治療因血液中高膽固醇而引起的動(dòng)脈硬化和冠心病等疾病。隨著人類生活水平的提高，各種心腦血管疾病的患者越來越多，因此提高紅曲霉洛伐他汀產(chǎn)量至關(guān)重要。前人分別從優(yōu)化發(fā)酵條件[6，8，10]和對(duì)菌種進(jìn)行物理化學(xué)誘變改良內(nèi)在的遺傳物質(zhì)來提高產(chǎn)量。李滔滔[11]對(duì)紅曲菌進(jìn)行誘變，獲得突變菌株液態(tài)發(fā)酵洛伐他汀產(chǎn)量達(dá)38.86 mg/L；游玟娟[12]利用紫外線和硫酸二乙酯復(fù)合誘變處理，紅曲霉菌株的洛伐他汀產(chǎn)量提高了82.9%。

離子束微生物誘變育種是利用離子束注入微生物細(xì)胞內(nèi)，引起微生物體內(nèi)某些物質(zhì)如(DNA或染色體等)發(fā)生變化，再通過人工定向選育得到新品種。利用離子束改良微生物菌種已在生產(chǎn)實(shí)踐中得到應(yīng)用并取得了明顯效益[13]，LI14]利用重離子束對(duì)土曲霉進(jìn)行誘變獲得高產(chǎn)洛伐他汀的菌株A.terreusZ15-7。N+束誘變作為一種誘變育種的方式應(yīng)用于紅曲霉研究相對(duì)較少，其中秦紅霞[15]等利用N+束誘變紅曲霉，篩選高產(chǎn)紅曲色素相比原菌株產(chǎn)量提高了121%。

本研究以N+束的方式對(duì)紅曲霉進(jìn)行處理，探尋離子束對(duì)紅曲霉產(chǎn)洛伐他汀的誘變效應(yīng)并篩選最佳誘變菌株，為功能性紅曲的誘變研究提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種

紅曲霉M14，于4 ℃冰箱中保存。

1.1.2主要試劑和儀器

洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品，中國藥品生物制品檢定所；鏈霉素，北京博奧拓達(dá)科技有限公司；脫氧膽酸鈉鹽，生工生物；其他化學(xué)試劑均為分析純。高效液相色譜儀，Waters；恒溫恒濕箱，寧波江南儀器廠；水浴鍋，上海醫(yī)療器械五廠；SCQ-2201超聲波清洗機(jī)，中國聲彥超生設(shè)備公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司。

1.1.3培養(yǎng)基

察氏培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖30,NaNO33,酵母提取物5,K2HPO41, KCl 0.5 ,FeSO4· H2O 0.5,瓊脂15，pH 5。麥芽提取物培養(yǎng)基(g/L):麥芽提取物20，蛋白胨10，葡萄糖20，瓊脂15。種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖100,蛋白胨10, KNO32, NH4H2PO42, MgSO4·7H2O 0.5, CaCl20.1, pH 6。固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基: 甘油0.2%(ρ),蛋氨酸0.14%(ω),NaNO30.01% (ω),大米作為基質(zhì)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1洛伐他汀測定

液相色譜條件：色譜柱Agilent 5 TC-C18(2)(250 mm×4.6 mm,5 μm);檢測波長238 nm,流速1.0 mL/min;梯度洗脫流動(dòng)相比例：乙腈∶0.1%磷酸緩沖液(0～6 min,60∶40;6～24 min,60～95∶40～5;26～30 min,95～60∶5～40)進(jìn)樣量10 μL,柱溫保持在35 ℃。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：稱取25 mg標(biāo)準(zhǔn)品溶解于25 mL乙腈溶液中，配制成1 mg/mL溶液。分別吸取2、4、6、8 mL溶液于10 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。標(biāo)準(zhǔn)曲線y=3×107x+191 972 (R2=0.999 7)。 其中，x代表質(zhì)量濃度，mg/g；y代表峰面積。

提取方法：紅曲米于60 ℃烘干至恒重，磨碎過100目篩。稱取0.5 g于10 mL管中，加入10 mL乙酸乙酯70 ℃水浴2 h，8 000 r/min離心5 min。取上清液并烘干，加入5 mL乙腈溶解后用0.22 μm有機(jī)微孔濾膜過濾。

1.2.2紅曲霉N+束誘變

將紅曲菌接種于察氏培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)7 d。用無菌水沖洗并收集孢子液于150 mL錐形瓶中，加入無菌玻璃珠于搖床160 r/min培養(yǎng)24 h,孢子濃度稀釋到108個(gè)/mL，0.7 mL懸液涂布于培養(yǎng)皿中。N+束能量為15 keV，誘變劑量為78 × 1013、130×1013、182×1013、234×1013N+/cm2。誘變孢子用1 mL無菌水洗脫，吸取0.2 mL孢子懸液涂抹均勻于含有鏈霉素和脫氧膽酸鈉鹽的察氏培養(yǎng)基平板中，30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3高產(chǎn)洛伐他汀菌株篩選

根據(jù)5%(ρ)量接種于固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃條件下發(fā)酵16 d。檢測發(fā)酵產(chǎn)物中洛伐他汀含量。對(duì)高產(chǎn)菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng)并檢測1，3，6，9，12代洛伐他汀產(chǎn)量，分析遺傳穩(wěn)定性。

1.2.4紅曲色價(jià)測定方法

準(zhǔn)確稱取0.1 g樣品于試管中，加入10 mL 70%的乙醇,60 ℃水浴1 h，6 000 r/min離心5 min。取出0.2 mL上清液，加入3.8 mL 70%乙醇稀釋搖勻。將稀釋液加入比色皿中，以70%乙醇做對(duì)照，在505 nm波長下測定吸光度A。色價(jià)按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：X1為試樣的色價(jià)，U/g；A為浸泡稀釋液的吸光度；m1為樣品質(zhì)量，g；V吸取上清液的體積，mL。

1.2.5數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2013和SPSS 19軟件進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2.1誘變效應(yīng)

正突變率按公式(2)計(jì)算：

(2)

如表1所示，正突變率隨著誘變劑量的增加而上升，在130×1013N+/cm2達(dá)到最高值18.2%，隨后有所下降，在234×1013N+/cm2劑量時(shí)為11.8%。對(duì)于15 keV能量的N+束如圖1所示，隨著劑量增加菌落數(shù)呈現(xiàn)出下降的趨勢，但是在130×1013N+/cm2時(shí)菌落存活數(shù)有稍微的回升，隨后一直表現(xiàn)為下降的趨勢。這可能是因?yàn)樵谡T變劑量小，細(xì)胞沒有形成強(qiáng)有力的自我保護(hù)機(jī)制，當(dāng)一次性注入大量離子束時(shí)，會(huì)激活細(xì)胞內(nèi)的自我保護(hù)和自我修復(fù)的基質(zhì)，防止細(xì)胞受到損害。如果進(jìn)一步加大誘變劑量，這種機(jī)制就難以應(yīng)付這種強(qiáng)度的損害，所以菌落存活數(shù)會(huì)一直下降，與前人所研究結(jié)果相同[16-17]，從正突變率和菌落存活數(shù)兩個(gè)方面考慮130×1013N+/cm2為最適誘變劑量。

表1　誘變劑量對(duì)正突變率影響

圖1　不同誘變劑量下孢子存活曲線Fig.1　Livability curve of spores under different dose

2.2誘變菌株篩選

圖2中a為洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，b為紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)物檢測結(jié)果。經(jīng)過N+束誘變獲得137株紅曲霉，如圖3所示，誘變菌株相對(duì)于出發(fā)菌株只有13.8%表現(xiàn)正突變。其中有8種誘變菌株相對(duì)于出發(fā)菌株和其他誘變菌株表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，因此對(duì)這些菌株結(jié)合生長速度進(jìn)一步分析，結(jié)果如表2所示。從洛伐他汀產(chǎn)量這一個(gè)指標(biāo)看，M50-2、M50-16、M90-15相對(duì)于其他菌株具有顯著性差異，具有明顯的優(yōu)勢，但菌株之間并沒有表現(xiàn)出顯著性差異。生長速率顯示M50-2表現(xiàn)出顯著差異，為較優(yōu)誘變菌株。

表2　紅曲霉洛伐他汀產(chǎn)量和生長速度

圖2　高效液相色譜 Fig.2　High performance liquid chromatography

圖3　誘變菌株洛伐他汀產(chǎn)量Fig.3　Lovastatin yield of mutatin strains

2.3誘變菌株色價(jià)與洛伐他汀相關(guān)性分析

對(duì)誘變菌株進(jìn)行洛伐他汀產(chǎn)量檢測，HPLC方法是相對(duì)準(zhǔn)確的，但對(duì)于誘變菌株數(shù)量多的情況下用這種方法相對(duì)繁瑣耗時(shí)。李滔滔[11]提到，紅曲色素和洛伐他汀的合成路徑具有相同的部分，紅曲色價(jià)可能和洛伐他汀產(chǎn)量之間有一定相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)選取8株誘變菌株進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)物中色價(jià)測定并與對(duì)應(yīng)洛伐他汀做對(duì)比，結(jié)果如圖4所示。從中可以看出，不同菌株之間兩個(gè)指數(shù)具有相同的變化趨勢。為了精確分析兩者的關(guān)系，對(duì)菌株進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，在0.05水平上表現(xiàn)出相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.803。說明可以用測定色價(jià)間接檢測洛伐他汀含量，排除差別相對(duì)大的菌株，再利用高效液相色譜進(jìn)行精確檢測來進(jìn)一步篩選。

圖4　誘變菌株色價(jià)和洛伐他汀Fig.4　Color scale yield and lovastatin of mutatin strains

2.4M50-2的遺傳穩(wěn)定性

檢測誘變菌株M50-2洛伐他汀產(chǎn)量的遺傳穩(wěn)定性，將菌株進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)至第12代，檢測1、3、6、9、12代發(fā)酵產(chǎn)物中洛伐他汀產(chǎn)物含量。結(jié)果如表3所示。子代相對(duì)于第1代產(chǎn)量略有下降，但每組之間以及和一代對(duì)比沒有表現(xiàn)出顯著性差異，基本保持產(chǎn)量的穩(wěn)定性。說明該誘變菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性，可以進(jìn)行后續(xù)的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

表3　高產(chǎn)洛伐他汀遺傳穩(wěn)定性

2.5M50-2與M14洛伐他汀代謝研究

為了研究誘變菌株和出發(fā)菌株發(fā)酵過程中洛伐他汀代謝的情況，對(duì)兩種菌株發(fā)酵16 d，檢測結(jié)果如圖5所示。開始M50-2和M14洛伐他汀產(chǎn)量變化較小，在第6天出現(xiàn)顯著增加并在14天達(dá)到最高，隨后趨于穩(wěn)定。說明誘變菌株和出發(fā)菌株在生物活性方面沒有表現(xiàn)出不同。但是就洛伐他汀產(chǎn)量而言，在第4天開始M50-2產(chǎn)量高于M14，隨后差異性逐漸分開，在14天差異性達(dá)到最大值。

圖5　不同發(fā)酵時(shí)間洛伐他汀產(chǎn)量Fig.5　Lovastatin production at different fermentation time

3討論

紅曲既是食品又是中藥，在中國具有悠久生產(chǎn)和應(yīng)用歷史，其功能不僅在于抗菌，消化養(yǎng)胃，更重要的是可以產(chǎn)生降脂降壓活性的物質(zhì)。本研究以紅曲霉為出發(fā)點(diǎn)，利用離子束誘變提高洛伐他汀產(chǎn)量。

隨著N+束誘變劑量的增加，表現(xiàn)為成活數(shù)先下降再升高最后降低的曲線，形狀似“馬鞍形”，這和YU[16]和WANG[17]研究的一致，但是LI利用離子束對(duì)土曲霉進(jìn)行誘變時(shí)，微生物成活率表現(xiàn)為一直下降趨勢與本研究不一致，其中原因有待于進(jìn)一步進(jìn)行探討。

在對(duì)誘變菌株進(jìn)行篩選時(shí)，楊超根據(jù)高產(chǎn)紅曲霉對(duì)洛伐他汀耐受性，制作洛伐他汀抗性平板篩選。李滔滔研究發(fā)現(xiàn)色價(jià)和洛伐他汀產(chǎn)量之間具有一定相關(guān)性，以此為出發(fā)點(diǎn)研究兩者之間產(chǎn)量關(guān)系。從中發(fā)現(xiàn)可以利用兩者之間具有顯著相關(guān)性，可以間接檢測紅曲洛伐他汀產(chǎn)量，再利用高效液相色譜檢測產(chǎn)別相對(duì)小的菌株，大大減少誘變菌株篩選的時(shí)間。

通過N+束誘變，誘變菌株M50-2洛伐他汀產(chǎn)量為4.42 mg/g相對(duì)于原始菌株提高了70%，比胡歡歡[18]利用紫外線和氯化鋰復(fù)合誘變后菌株M-H4-3產(chǎn)量提高10%。相對(duì)于LEE[19]利用條件優(yōu)化將產(chǎn)量提升35.5%，利用離子束誘變的方法提高產(chǎn)量是一種更優(yōu)的選擇。在進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性檢測時(shí)，研究者對(duì)于傳代次數(shù)考慮卻不盡相同。LI[20]對(duì)誘變菌株傳遞9代，蔡作新[21]對(duì)鏈霉菌N3-643誘變菌株傳遞4代。本實(shí)驗(yàn)對(duì)M50-2傳代，洛伐他汀含量沒有顯著性差異，表現(xiàn)為良好遺傳穩(wěn)定性。紅曲霉次生代謝產(chǎn)物還包含桔霉素有害物質(zhì)，在可食用的紅曲米中嚴(yán)重影響人類身體健康。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)從洛伐他汀和桔霉素產(chǎn)量的比例以及國家對(duì)桔霉素含量標(biāo)準(zhǔn)兩個(gè)方面綜合考慮篩選優(yōu)良菌株。

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Screening of high-yield lovstatin monascus by nitrogen ion beam mutation breeding

LI Kuo-kuo1,WANG Yu1,2*,WAN Tian1,ZHUANG Xiao-xiao1

1(Shool of Resources and Environmental Engineering, Anhui University,Hefei 230601,China) 2(Industry Technology Research and Development Center for Chinese Medicinal Materials,Hefei 230601,China)

ABSTRACTIn order to improve the yield of lovastatin, strain M14 was injected by ion beam to induce mutant strain. The dose were 78×1013, 130×1013, 182×1013, and 234×1013N+/cm2. The positive mutant strains were screened through detection of lovastatin content in the solid-state fermentation products by HPLC. The optimal dose was 130×1013N+/cm2, which resulted in relatively high positive mutation rate. The best strain M50-2 yield 4.42 mg/g lovastatin, which was 70% higher than original strains. To examine the genetic stability of M50-2, the strain was continuously sub-cultured to the 12 generation. The ability to produce lovastatin fell by 2.3%. It remained steady after subculture. This strain has potential application.

Key wordsMonascus; lovastatin; N+beam; mutation

收稿日期：2015-09-10，改回日期：2016-01-06

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金(31471554)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201604018

第一作者：碩士研究生(王鈺教授為通訊作者,E-mail:wangyu@ahu.edu.cn)。