讓一峰，趙偉，楊瑞金

1(江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)2(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

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低胰蛋白酶抑制劑活力的白蕓豆α-淀粉酶抑制劑的工業(yè)化制備方法探究

讓一峰1，趙偉2*，楊瑞金2

1(江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)2(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

摘要研究了酸堿處理、熱處理、超高壓、酸沉和超濾對(duì)白蕓豆中α-淀粉酶抑制劑(α-amylase inhibitor，α-AI)和胰蛋白酶抑制劑(trypsin inhibitor,TI)活力的影響，旨在為工業(yè)化制備低TI活力的白蕓豆α-AI提供指導(dǎo)。α-AI和TI在25 ℃時(shí)具有良好的酸堿穩(wěn)定性(pH 3.00～10.00)。60 ℃時(shí)的酸處理對(duì)TI活力無(wú)顯著影響(P>0.05)，而α-AI活力則會(huì)顯著降低(P<0.05)，堿處理對(duì)α-AI活力造成的損失大于對(duì)TI活力造成的損失。超高壓(200～500 MPa)處理不影響α-AI活力，200 MPa的壓力對(duì)TI無(wú)顯著影響(P>0.05)，高于200 MPa的壓力顯著增強(qiáng)TI活力(P<0.05)。在酸沉(pH 5.2、4.4和3.6)中，α-AI基本不沉降, TI的沉降率不超過23.77%。截留分子質(zhì)量為30 000 u的Millipore超濾系統(tǒng)和膜分離中試裝置對(duì)白蕓豆水提液中α-AI的截留率分別為98.32%和84.63%，對(duì)TI 的截留率分別為27.20%和20.77%。因此，超濾有助于實(shí)現(xiàn)白蕓豆α-AI和TI的工業(yè)化分離。

關(guān)鍵詞α-淀粉酶抑制劑；胰蛋白酶抑制劑；超高壓；超濾

α-淀粉酶抑制劑(α-amylase inhibitor, α-AI)是一類能與α-淀粉酶結(jié)合并改變其構(gòu)象，從而降低α-淀粉酶活力的含氮碳水化合物或大分子蛋白質(zhì)，普遍存在于各種豆類和谷物之中[1]。其中白蕓豆(White kidney bean)α-淀粉酶抑制劑是一種蛋白類抑制劑，能夠?qū)Ｒ恍砸种迫祟愅僖杭澳c道α-淀粉酶，延緩淀粉分解，降低餐后血糖，加之其較強(qiáng)的生理活性和較高的生物安全性，因而被廣泛應(yīng)用于商業(yè)抗肥胖和抗糖尿病等產(chǎn)品中，這些產(chǎn)品在國(guó)外被稱為“淀粉阻斷者(starch blocker)”[2]。隨著人們生活水平的提高，肥胖癥和糖尿病的形勢(shì)日趨嚴(yán)峻[3]，白蕓豆α-淀粉酶抑制劑的應(yīng)用前景將更為廣闊。

盡管白蕓豆α-淀粉酶抑制劑在控制血糖、降低食欲和減輕體重等方面的作用已被大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體實(shí)驗(yàn)所證實(shí)，但許多“淀粉阻斷者”并不能發(fā)揮其應(yīng)有的生理作用,其主要原因是這些產(chǎn)品中存在著較多的胰蛋白酶抑制劑(trypsin inhibitor, TI)。胰蛋白酶抑制劑是白蕓豆中存在的一種蛋白類抗?fàn)I養(yǎng)因子，能夠刺激胰臟產(chǎn)生過多的淀粉酶而導(dǎo)致α-淀粉酶抑制劑在體內(nèi)的生理作用降低或消失[2]。離子交換色譜法和凝膠柱色譜法可以從白蕓豆中制備得到不含有胰蛋白酶抑制劑的活力的高純度α-淀粉酶抑制劑，但色譜法生產(chǎn)周期長(zhǎng)，生產(chǎn)成本高，環(huán)境污染大，因而難以用于工業(yè)化生產(chǎn)，無(wú)法滿足市場(chǎng)需求[4]。

本文研究了酸堿處理、熱處理、超高壓、酸沉以及超濾等工業(yè)化處理方法對(duì)白蕓豆中α-淀粉酶抑制劑和胰蛋白酶抑制劑活力的影響，旨在闡明白蕓豆中α-淀粉酶抑制劑和胰蛋白酶抑制劑在理化性質(zhì)方面的一些差異，為實(shí)現(xiàn)工業(yè)化制備少含或不含胰蛋白酶抑制劑活力的白蕓豆α-淀粉酶抑制劑提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與設(shè)備

白蕓豆，購(gòu)于云南麗江，真空包裝，顆粒飽滿，大小均一；豬胰α-淀粉酶(PPA)、胰蛋白酶、BApNA，美國(guó)Sigma-Aldrich；其他試劑均為分析純。

高靜水壓處理系統(tǒng)，內(nèi)蒙古包頭科發(fā)高科技食品有限公司；Millipore超濾系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司；膜分離中試裝置，無(wú)錫海思瑞科技有限公司；UV-1100型紫外可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；PK-820電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；MP-501A超級(jí)恒溫循環(huán)槽，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman公司；精密pH計(jì), METTLER TOLEDO。高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Thermo Scientific公司；WK-1000A型高速藥物粉碎機(jī)，青州市精誠(chéng)機(jī)械有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1白蕓豆水提液的制備

參照WANG[4]的方法。用高速中藥粉碎機(jī)將白蕓豆粉碎，收集過60目篩的豆粉。將豆粉與去離子水按1∶10(g∶mL)的比例于室溫下攪拌提取2 h后，在8 000 r/min，4 ℃下離心30 min，將上清液過120目篩以去除漂浮顆粒后收集清液，即為白蕓豆水提液。白蕓豆水提液的pH為6.39±0.04，α-AI活力和TI活力分別為8.32±0.02 U/mL、822.98±10.03 U/mL。

1.2.2白蕓豆水提液的酸堿處理及熱處理

將白蕓豆水提液用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH 分別調(diào)pH至3.00、4.00、5.00、6.39、8.00、9.00和10.00，在25和60 ℃下恒溫?cái)嚢杼幚?0 min后，于冰浴中迅速冷卻至室溫(25 ℃)。用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH將pH調(diào)回至6.39，于5 000 r/min，4 ℃下離心15 min后收集上清液，測(cè)定其相對(duì)α-AI活力和相對(duì)TI活力。

1.2.3白蕓豆水提液的超高壓處理

將白蕓豆水提液裝入聚丙烯真空袋中，趕出氣泡，真空熱封包裝后分別在室溫下于200、300、400和500 MPa下保壓10 min，以未經(jīng)超高壓處理的白蕓豆水提液作為空白對(duì)照。將超高壓處理后的水提液于5 000 r/min，4 ℃下離心15 min后收集上清液，測(cè)定其相對(duì)α-AI活力和相對(duì)TI活力。

1.2.4白蕓豆水提液的酸沉

將白蕓豆水提液用1 mol/L HCl分別調(diào)至pH 5.20、4.40和3.60后于室溫下靜置1 h，在8 000 r/min，4 ℃下離心15 min后，收集上清液，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至6.39后測(cè)定α-AI活力和TI活力在上清液中分配比例。

1.2.5白蕓豆水提液的超濾

采用Millipore超濾系統(tǒng)將1 L白蕓豆水提液按以下工藝條件超濾：板式纖維膜；截留分子質(zhì)量為30 000 u；膜面積為88 cm2；入口壓力為0.12～0.14 MPa；出口壓力為0 MPa；操作溫度為25～35 ℃。測(cè)定Millipore超濾系統(tǒng)對(duì)α-AI活力和TI活力的截留率。

采用膜分離中試裝置將15 L白蕓豆水提液按以下工藝條件超濾：卷式纖維膜；截留分子質(zhì)量為30 000 u；膜面積為1.80 m2；入口壓力為0.30 MPa；出口壓力為0.25 MPa；操作溫度為25～35 ℃。測(cè)定膜分離中試裝置對(duì)α-AI活力和TI活力的截留率。

1.3測(cè)定方法

1.3.1α-AI活力測(cè)定

參照YANG[5]的方法測(cè)定α-AI活力。將0.25 mL α-淀粉酶液與0.25 mL白蕓豆提取液加入到0.5 mL磷酸鹽緩沖液(pH 6.90)中，于37 ℃下預(yù)熱10 min后加入0.5 mL 10 g/L淀粉溶液，精確反應(yīng)5 min后加入1 mL 3,5-二硝基水楊酸，沸水浴10 min后置冰水浴中迅速冷卻，加入5 mL去離子水，在540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值?？瞻滓粤姿猁}緩沖液代替α-淀粉酶液，對(duì)照以磷酸鹽緩沖液代替白蕓豆提取液。1個(gè)α-AI活力(1 U)定義為：1 min內(nèi)抑制1μmol葡萄糖生成所需α-AI的量。相對(duì)α-AI活力(%)定義為白蕓豆提取液處理后與處理前α-AI活力的百分比。

1.3.2TI活力測(cè)定

采用10 mL體系的BApNA法測(cè)定TI活力[6]。將0.4 mL胰蛋白酶液與0.4 mL白蕓豆提取液于37 ℃水浴15 min后，加入2.8 mL BApNA 溶液(用pH 8.2的Tris-HCl緩沖液配制)，精確反應(yīng)15 min后加入1 mL 30%(v/v)冰醋酸終止反應(yīng)，定容至10 mL，在410 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值?？瞻紫燃颖姿?，后加BApNA，對(duì)照以Tris-HCl緩沖液代替白蕓豆提取液。1個(gè)TI活力(1 U)定義為該10 mL測(cè)定體系中抑制0.01個(gè)吸光度的增加所需TI的量。相對(duì)TI活力(%)定義為白蕓豆提取液處理后與處理前α-AI活力的百分比。

1.4數(shù)據(jù)分析方法

采用SPSS16.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA單因素方差分析及Ducan’s多重檢驗(yàn)(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)n=3，在同一組單因素分析中出現(xiàn)大小寫字母時(shí)，不同的字母小寫表示α-AI活力有顯著性差異(P<0.05)，大寫表示TI活力有顯著性差異(P<0.05)。

2結(jié)果與討論

2.1酸堿處理和熱處理對(duì)α-AI和TI活力的影響

圖1為25 ℃時(shí)不同pH處理30 min對(duì)白蕓豆水提液中α-AI和TI活力的影響。在25 ℃時(shí)，pH 3.00～10.00處理對(duì)白蕓豆水提液中TI活力無(wú)顯著影響(P>0.05)，表明TI在常溫下具有良好的酸堿穩(wěn)定性。pH 4.00～9.00處理對(duì)α-AI活力無(wú)顯著影響(P>0.05)，盡管α-AI在pH 3.00、9.00和10.00處理后活力會(huì)顯著降低(P<0.05)，但其活力損失率不超過10%，表明α-AI在常溫下也具有良好的酸堿穩(wěn)定性，但差于TI。

圖1　25 ℃時(shí)pH對(duì)α-AI和TIA的影響Fig.1　Effects of pH on the activities of α-AI and TI at 25 ℃

圖2為60 ℃時(shí)不同pH處理30 min對(duì)白蕓豆水提液中α-AI和TI活力的影響。在60 ℃時(shí)，酸處理對(duì)TI活力無(wú)顯著影響(P>0.05)，而堿處理會(huì)顯著降低TI活力(P<0.05)，隨著堿性的增強(qiáng)，TI活力損失增大。在60 ℃處理時(shí)，pH 6.39的白蕓豆水提液中α-AI活力基本無(wú)損失(1.94%)，酸堿處理中其α-AI活力顯著下降(P<0.05)，隨著酸性或堿性的增強(qiáng)，α-AI活力損失增大。相比于酸處理，堿處理對(duì)α-AI活力造成的損失更大。在60 ℃時(shí)，TI的酸堿穩(wěn)定性高于α-AI。在相同pH下，TI的熱穩(wěn)定性高于α-AI。結(jié)合圖1和圖2可以看出，升高溫度可以降低α-AI和TI的酸堿穩(wěn)定性，但是在同樣的處理?xiàng)l件下，α-AI活力損失不小于TI活力損失。

圖2　60 ℃時(shí)pH對(duì)α-AI和TIA的影響Fig.2　Effects of pH on the activities of α-AI and TI at 60℃

2.2超高壓對(duì)α-AI和TI活力的影響

圖3為不同壓力(200～500 MPa)對(duì)白蕓豆水提液中α-AI和TI活力的影響。除了400 MPa壓力處理后α-AI活力顯著上升(P<0.05)外，其他壓力處理對(duì)α-AI活力無(wú)顯著影響(P>0.05)，而且400 MPa壓力處理僅使α-AI活力增加了4.35%，因此可以認(rèn)為低于500 MPa的壓力不會(huì)影響白蕓豆α-AI活力。白蕓豆α-AI主要依靠疏水作用和氫鍵維持其高級(jí)結(jié)構(gòu)[2]，而不高于600 MPa的壓力會(huì)降低疏水作用而穩(wěn)定氫鍵[7-8]，白蕓豆α-AI在此壓力下的穩(wěn)定性可能是其分子內(nèi)部疏水作用減弱和氫鍵增多相互平衡的結(jié)果。200 MPa壓力不會(huì)對(duì)TI活力產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)，當(dāng)壓力高于200 MPa時(shí)TI活力顯著上升(P<0.05)，300 MPa壓力處理對(duì)TI活力的增強(qiáng)效果最大，TI活力增加12.64%。超高壓可以促使巰基形成二硫鍵[9]，而白蕓豆TI的二硫鍵是其與胰蛋白酶相互作用的重要部位[10]，這可能是超高壓處理增強(qiáng)白蕓豆TI活力的原因之一。

圖3　不同壓力對(duì)α-AI和TI活力的影響Fig.3　Effects of various pressures on the activities of α-AI and TI

2.3酸沉后α-AI和TIA活力在上清液中的分配

圖4為白蕓豆水提液在不同pH(5.20、4.40和3.60)下酸沉后α-AI和TI活力在上清液中的分配情況。

圖4　酸沉pH對(duì)α-AI和TI活力在上清液中分配比例的影響Fig.4　Effects of pH on the rates of α-AI and TI activities distributed in supernatants during isoelectric precipitation

盡管白蕓豆α-AI的等電點(diǎn)在4.0～5.2之間[1]，但白蕓豆水提液酸沉后，不低于90%的α-AI活力分配在上清液中，并且酸沉pH對(duì)α-AI活力的分配無(wú)顯著影響(P>0.05)，表明白蕓豆α-AI在等電點(diǎn)附近幾乎不會(huì)沉降。白蕓豆α-AI的這一性質(zhì)可能是因?yàn)槠漭^高的碳水化合物含量(11.8%)使其具備了良好的親水性[5]。隨著酸沉pH的降低，TI活力在上清液中的分配比例顯著減少(P<0.05)，表明酸沉能夠使TI沉淀，但是在酸沉pH為3.6時(shí)，TI活力在上清液中的分配比例依然很大(71.62%)，因而酸沉不能有效地分離白蕓豆α-AI和TI。

2.4超濾對(duì)α-AI和TIA活力的截留效果

由于白蕓豆α-AI的分子質(zhì)量為56 000 u，TI的分子質(zhì)量為8 000 u[2,10]，因此嘗試截留分子質(zhì)量為30 000 u的超濾膜對(duì)白蕓豆水提液進(jìn)行超濾。Millipore超濾系統(tǒng)對(duì)α-AI和TI活力的截留率分別為98.32%和27.20%，說明截留分子質(zhì)量為30 000 u的超濾膜對(duì)α-AI和TI的分離效果良好。Millipore超濾系統(tǒng)是一種小型的超濾裝置，為了驗(yàn)證超濾在規(guī)模化分離白蕓豆水提液中α-AI和TI的可行性，采用膜分離中試裝置對(duì)白蕓豆水提液進(jìn)行超濾，其超濾膜的截留分子質(zhì)量為30 000 u。該中試裝置對(duì)α-AI和TI活力的截留率分別為84.63%和20.77%，表明膜分離中試裝置對(duì)α-AI和TI的分離效果與Millipore接近。膜分離中試裝置對(duì)α-AI和TI活力的截留率均顯著低于Millipore超濾系統(tǒng)(P<0.05)，可能是因?yàn)槟し蛛x中試裝置的死體積較大。因此，截留分子量為30 000 u的超濾膜的超濾系統(tǒng)有助于實(shí)現(xiàn)白蕓豆α-AI和TI的工業(yè)化分離。

圖5　兩種超濾系統(tǒng)對(duì)α-AI和TI活力的截留率Fig.5　Retention rates of α-AI and TI activities in two ultra-filtration systems

3結(jié)論

以白蕓豆為原料制備得到含有α-AI和TI活力的水提液，研究了酸堿處理、熱處理、超高壓、酸沉和超濾對(duì)α-AI和TI活力的影響，得出以下結(jié)論：

(1)α-AI和TI在25 ℃時(shí)具有良好的酸堿穩(wěn)定性(pH 3.00～10.00)。60 ℃時(shí)TI的酸堿穩(wěn)定性高于α-AI。

(2)超高壓(200～500 MPa)不影響α-AI活力。200 MPa的壓力對(duì)TI活力無(wú)顯著影響(P>0.05)，當(dāng)壓力高于200 MPa時(shí)，TI活力顯著增強(qiáng)(P<0.05)。

(3)在酸沉(pH 5.20，4.40 和3.60)中，α-AI基本不沉降，TI的沉降率不超過23.77%。

(4)截留分子量為30 000 u的Millipore超濾系統(tǒng)和膜分離中試裝置對(duì)白蕓豆水提液中α-AI的截留率分別為98.32%和84.63%，對(duì)TI 的截留率分別為27.20%和20.77%。兩種超濾系統(tǒng)對(duì)α-AI和TI的分離效果良好，表明超濾有助于實(shí)現(xiàn)白蕓豆α-AI和TI的工業(yè)化分離。

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Industrial preparation of white kidney bean α-amylase inhibitor with low trypsin inhibitor activity

RANG Yi-feng1, ZHAO Wei2*, YANG Rui-jin2

1(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Wuxi 214122, China) 2(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

ABSTRACTEffects of acid and alkali treatment, heat treatment, ultra high pressure, isoelectric precipitation and ultra-filtration on the activities of α-amylase inhibitor (α-AI) and trypsin inhibitor (TI) from white kidney bean (Phaseolus vulgaris L.) were investigated to provide directions for the industrial preparation of white kidney bean α-AI with low TI activities. At 25 ℃, both α-AI and TI owned a good pH stability (pH 3.00～10.00). At 60 ℃, acid treatment didn’t significantly affect TI activity(P>0.05)while significantly reduced α-AI activity (P<0.05). The activity losses of α-AI caused by alkali treatment were much larger than those of TI. α-AI activity wasn’t affected by ultra high pressure (200～500 MPa). Pressure at 200 MPa had no significant impact on TI activity (P>0.05)while the activity of TI was significantly enhanced at pressure above 200 MPa (P<0.05). During isoelectric precipitation (pH 5.2, 4.4 and 3.6), little α-AI and less than 23.77% of TI precipitated. When white kidney bean extract was treated by Millipore ultra-filtration system and a pilot-plant membrane separation device with retentive molecular 30 000 u, the retentive rates of α-AI activities were 98.32% and 84.63%, respectively, and the ones of TI activities were 27.20% and 20.77%, respectively. Consequently, ultra-filtration was helpful to realize the industrial separation of α-AI and TI from white kidney bean.

Key wordsα-amylase inhibitor; trypsin inhibitor; ultra high pressure; ultra-filtration

收稿日期：2015-11-20，改回日期：2015-12-04

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(31271977)；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(JUSRP 51501)資助

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201604001

第一作者：碩士研究生(趙偉教授為通訊作者，E-mail：zhaow@jiangnan.edu.cn)。