何熹，耿偉濤，韓寧，王艷萍*

1(天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津，300457) 2(齊魯工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，山東 濟(jì)南，250353)

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馬奶酒樣乳桿菌乳糖酶LacZ基因的克隆，原核表達(dá)及活性分析

何熹1,2，耿偉濤1，韓寧2，王艷萍1*

1(天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津，300457) 2(齊魯工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，山東 濟(jì)南，250353)

摘要從開菲爾粒(Kefir)中分離出1株馬奶酒樣乳桿菌(Lactobacillus kefiranofaciens ZW3)，具有較高的乳糖酶活性，以此菌株為材料, 從其基因組中克隆得到LacZ型乳糖酶基因，該基因全長(zhǎng)2007 bp, 編碼669 個(gè)氨基酸。隨后將該基因插入原核表達(dá)載體pET-32a中轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行過量表達(dá)，獲得了其重組蛋白，純化后分析了該重組蛋白的乳糖水解活性特點(diǎn)。結(jié)果顯示，此蛋白在50 ℃，pH 7.0時(shí)乳糖水解活力最高，并在30～55 ℃，pH 5.0～9.0的范圍仍能保持50%以上的酶活力，具有良好的工業(yè)應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞β-半乳糖苷酶；基因克??；原核表達(dá)

乳糖酶(lactase) 又稱β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)或β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(β-D-galactoside galcato-hydrolade，EC,3.2.1.23)，可催化乳糖分解為1分子葡萄糖和1分子半乳糖，同時(shí)還具有半乳糖苷的轉(zhuǎn)移作用[1]。該酶在乳品加工工業(yè)中可利用乳糖酶分解牛乳等乳制品中的乳糖，生產(chǎn)低乳糖乳制品供乳糖不耐受人群食用。而且該酶還能降解冰淇淋中的乳糖，減少乳糖在低溫條件下因溶解度下降而析出。此外，利用乳糖酶的半乳糖苷轉(zhuǎn)移作用生產(chǎn)的低聚半乳糖也已經(jīng)開始投放市場(chǎng)，因低聚半乳糖(Galactooligosaccharides，GOS)能被腸道內(nèi)雙歧桿菌利用，可做為很好的益生元使用[2]。

根據(jù)氨基酸序列相似度，國際生物化學(xué)與分子生物學(xué)聯(lián)盟(IUBMA)將已發(fā)現(xiàn)的各種糖基水解酶分成了133個(gè)家族，分別命名為GH1—GH133家族。其中GH1，GH2，GH35以及GH42家族中均有乳糖酶存在。按照組成的蛋白亞基種類，乳糖酶可分為2種類型，一種由相同亞基構(gòu)成的，即LacZ型，一般以同源四聚體形式存在，例如大腸桿菌的LacZ型乳糖酶[3]。另一種為異源二聚體，即LacLM型，由大小2個(gè)不同亞基組成[4]。目前在工業(yè)上使用的乳糖酶制劑雖然活性較高，但其作用溫度往往局限在常溫條件，限制了它的應(yīng)用。

開菲爾粒(Kefir)是一種來自西藏和高加索地區(qū)的由多種微生物(大部分是乳酸菌)所構(gòu)成的用于生產(chǎn)發(fā)酵乳的發(fā)酵劑[5]。本實(shí)驗(yàn)室從中分離獲得1株乳糖酶活性較高的馬奶酒樣乳桿菌ZW3(LactobacilluskefiranofaciensZW3)，并進(jìn)行了基因組測(cè)序，在GenBank 中的注冊(cè)號(hào)為 CP002764.1。本研究以該菌株為材料，克隆了其乳糖酶LacZ基因，并在大腸桿菌中進(jìn)行了過量表達(dá)，純化后經(jīng)X-Gal初步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)具有乳糖酶水解活性，隨后進(jìn)一步對(duì)其最適酶活條件進(jìn)行了分析，為將來進(jìn)一步工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1菌種、質(zhì)粒

1.1.1菌種

馬奶酒樣乳桿菌ZW3 (LactobacilluskefiranofaciensZW3)， 大腸桿菌E.coliDH5α及E.coliBL21(DE3)均由天津科技大學(xué)發(fā)酵食品與益生菌資源開發(fā)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2質(zhì)粒

pEasy -blunt載體購于北京全是金生物技術(shù)有限公司，pET30α由天津科技大學(xué)發(fā)酵食品與益生菌資源開發(fā)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2試劑材料

細(xì)菌基因組提取試劑盒、DNA 膠回收試劑盒、小量質(zhì)粒提取試劑盒、DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)DM5000、Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶、DNA 聚合酶、T4連接酶、異丙基硫化-β-D-半乳糖苷 (IPTG)購自大連寶生物技術(shù)有限公司。

1.3方法

1.3.1 馬奶酒樣乳桿菌ZW3基因組 DNA 的提取

參照試劑盒說明書。

1.3.2乳糖酶LacZ基因全長(zhǎng)克隆與測(cè)序

根據(jù)ZW3基因組數(shù)據(jù)庫中LacZ(Gi:35947332)核酸序列，設(shè)計(jì)該基因的上下游引物，(下劃線部分分別為BamH I 和XhoI酶切位點(diǎn) )。分別是：

F：5’-GGATCCATGACACAAACTTTAACACGC-3’

R： 5’-CTCGAGCTATTTAACCAAAACTTGCAC-3’

以基因組DNA為模板使用高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性 30 s， 56 ℃退火 30 s， 72 ℃延伸2 min,35 個(gè)循環(huán)； 72 ℃終延伸10 min。然后用 1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物與pEASY-blunt載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆并送金唯智公司測(cè)序，測(cè)序正確的陽性克隆命名為pEASY-blunt-LacZ。

1.3.3原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

在BamH I和XhoI位點(diǎn)將LacZ基因全長(zhǎng)連入原核表達(dá)載體pET30a，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21，挑選陽性克隆并測(cè)序。

1.3.4融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將含有LacZ基因全長(zhǎng)的陽性克隆接種于50 μg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，然后按1∶50接種量進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，至OD600值約為0.5，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，27 ℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4 h以誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)。蛋白純化方法參照(Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒)說明書。用SDS-PAGE電泳檢測(cè)純化產(chǎn)物，分離膠濃度為12%。

1.3.5乳糖酶活性檢測(cè)

采用趙華梅[6]的方法測(cè)定乳糖酶活力，并測(cè)定其在不同溫度、pH條件下的相對(duì)活力，相對(duì)活力為在不同條件下乳糖酶活力與其最佳活力值的比值。

2結(jié)果與分析

2.1LacZ基因的克隆

根據(jù)馬奶酒樣乳桿菌ZW3基因組數(shù)據(jù)庫(GenBank：CP002764)的Wang 0296核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，以ZW3基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1條長(zhǎng)2007bp的基因片段(圖1)，符合預(yù)期大小。推測(cè)該基因編碼的產(chǎn)物具有 669個(gè)氨基酸，蛋白分子質(zhì)量為75 kDa。將產(chǎn)物回收純化，連接到pEasy-blunt載體上并對(duì)重組分子進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明擴(kuò)增出的基因序列與基因組中的原序列完全一致因。經(jīng)雙酶切重組質(zhì)粒pEasy-blunt-LacZ后連入原核表達(dá)載體pET30a，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DE3，挑選陽性克隆，經(jīng)測(cè)序鑒定，構(gòu)建重組分子pET30a-LacZ的閱讀框正確。將其序列通過NCBI進(jìn)行分析，確定該基因編碼的蛋白屬于糖基水解酶第42家族，即GH42中的LacZ型β-半乳糖苷酶。

M-分子量標(biāo)準(zhǔn)DM5000； 1-擴(kuò)增的LacZ基因圖1　LacZ基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1　PCR product of LacZ gene

2.2重組蛋白的表達(dá)與純化

原核表達(dá)陽性菌經(jīng)IPTG(終濃度0.5 mmol/L)誘導(dǎo)4 h后，對(duì)細(xì)胞粗提物進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)(圖2)。結(jié)果顯示：與對(duì)照菌株(pET-30a)相比，原核表達(dá)菌(pET-30a-LacZ)在相對(duì)分子質(zhì)量76 kDa附近出現(xiàn)1條新帶，進(jìn)一步對(duì)誘導(dǎo)后的菌體進(jìn)行超聲波破碎，經(jīng)純化后得到高純度蛋白，通過SDS-PAGE電泳檢測(cè)其相對(duì)分子量與預(yù)期的融合蛋白分子量一致。

M-蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)； 1-pET30a空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)后的總蛋白； 2-pET-30a-LacZ轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)后的總蛋白； 3-純化后蛋白圖2　LacZ蛋白的表達(dá)與純化Fig.2　SDS-PAGE analysis of LacZ gene expression in E.coli

2.3重組蛋白的乳糖水解酶活力檢測(cè)

將pET-30a-LacZ接種到含有X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷)的培養(yǎng)基中，菌落呈現(xiàn)藍(lán)色(圖3)，初步驗(yàn)證其具有乳糖水解酶活性。而對(duì)照菌落(pET-30a)則仍然為白色。將菌體收集后經(jīng)超聲波破碎，測(cè)定重組蛋白在不同溫度，pH條件下的乳糖相對(duì)水解活力(圖4和圖5)。結(jié)果顯示，重組蛋白在50 ℃時(shí)酶活力最高，在30～55 ℃時(shí)能保持50%以上的活力。其最適pH是7.0，但在5.0～9.0這個(gè)pH范圍內(nèi)，依然具有較高活性。

圖3　重組菌在X-Gal培養(yǎng)基中的顯色反應(yīng)Fig.3　The color reaction of recombinant bacteria in X-Gal medium

圖4　重組蛋白β-半乳糖苷酶最適溫度范圍Fig.4　Optimal temperature of the recombinant β-galactosidase holoenzyme

圖5　重組蛋白β-半乳糖苷酶最適pH范圍Fig.5　Optimal pH of the recombinant β-galactosidase holoenzyme

3討論

乳糖酶的工業(yè)生產(chǎn)方法主要是微生物發(fā)酵法，在已投放市場(chǎng)的乳糖酶產(chǎn)品主要來源于真核生物克魯維酵母，由于其產(chǎn)生的乳糖酶可通過胞外分泌，因此在生產(chǎn)中易于提取?？墒窃撊樘敲高m應(yīng)的條件比較狹窄，乳糖酶最佳作用溫度是在室溫條件下，最適pH值6.0～7.0，這就限制了在生產(chǎn)中的應(yīng)用。本研究通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建的乳糖酶菌株，產(chǎn)生的乳糖酶屬于胞內(nèi)酶，在最適條件下,當(dāng)發(fā)酵液OD600值接近1.0時(shí)，經(jīng)測(cè)量此時(shí)發(fā)酵原液中β-半乳糖苷酶活力為2.90 U/mL，要低于畢赤酵母等真核表達(dá)系統(tǒng)中發(fā)酵液中乳糖酶活力[7]，造成活力偏低的主要原因可能是因?yàn)橐韵聨追N原因：首先是由于細(xì)胞破碎效果不好，造成大量酶蛋白還位于細(xì)胞內(nèi)，酶蛋白不能完全釋放，從而影響了發(fā)酵液中的游離酶的含量；其次是細(xì)菌培養(yǎng)液濃度的差異，當(dāng)發(fā)酵液濃度OD600值在0.5～0.6時(shí)測(cè)得的乳糖酶活力為0.96 U/mL，此時(shí)的酶蛋白量表達(dá)量為10.1 μg/mL，當(dāng)OD600達(dá)到濃度最高的1.2時(shí)的發(fā)酵液中的酶蛋白含量則達(dá)到30.6 μg/mL，乳糖酶活力也增加了3倍；此外乳糖酶的來源不同，其氨基酸組成差異也會(huì)造成了酶水解活力的不同，這是第3個(gè)原因。不過與酵母等真核生物中的乳糖酶相比，本研究中的乳糖酶基因來自于從開菲爾粒(Kefir)分離的1株馬奶酒樣乳桿菌(LactobacilluskefiranofaciensZW3)，Kefir粒是一種來自西藏和高加索地區(qū)的由多種微生物(大部分是乳酸菌)所構(gòu)成的用于生產(chǎn)發(fā)酵乳的發(fā)酵劑，其主要碳源來自于乳品中的乳糖，在發(fā)酵乳的生產(chǎn)過程中，Kefir中的多種微生物處于一個(gè)溫度、pH值不斷變化的環(huán)境中，形成了一套能適應(yīng)不同條件的乳糖酶系統(tǒng)，因此Kefir為我們提供了豐富的乳糖酶資源。同時(shí)鑒于Kefir具有無毒安全的特性，如果能以其為研究對(duì)象，從中分離并克隆出了相關(guān)的乳糖酶基因， 構(gòu)建了高效的乳糖酶表達(dá)體系，就能制備出可在不同溫度和pH條件下能夠保持較高的活力的乳糖酶系列產(chǎn)品。相信在解決了細(xì)胞破碎，酶提取等工藝問題后，通過該方法生產(chǎn)的乳糖酶能在乳制品、醫(yī)藥生產(chǎn)、食品加工等產(chǎn)業(yè)中能夠得到更加廣泛的運(yùn)用。

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Cloning, expression and characterization ofLacZgene fromLactobacilluskefiranofaciens

HE Xi1,2,GENG Wei-tao1,HAN Ning2,WANG Yan-ping1*

1(College of Food Engineering and Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China) 2(College of Bioengineering, Qilu University of Technology, Jinan 250353, China)

ABSTRACTA Lactobacillus kefiranofaciens ZW3 with high lactase activity was isolated from Kefir in our laboratory. Using Lactobacillus kefiranofaciens ZW3 as material, a LacZ type of lactase gene was cloned from ZW3 genome, and the full-length of this gene encoding 669 amino acids was 2007 bp. The gene was then inserted into the pET-32a vector and transformed into E. coli BL21 (DE3). The lactose hydrolysis activity of this recombinant protein was analyzed after purification. The results showed that the optimum temperature and pH for hydrolyzation of the recombinant protein was 50 ℃, pH 7.0. In the range of 30～55 ℃ and pH 5.0～9.0, the recombinant protein still maintained more than 50% of the enzyme activity, which exhibited a good potential for industrial applications.

Key wordsβ-galactosidase; gene cloning; prokaryotic expression

收稿日期：2015-10-28，改回日期：2016-01-04

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201604006

第一作者：博士研究生(王艷萍為通訊作者，E-mail：ypwang40@163.com)。