張士楊，王澤建，王興吉，郭美錦，儲炬*，莊英萍，張嗣良

1(華東理工大學 生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，上海，200237) 2(山東隆大生物工程有限公司，山東 臨沂，276410)

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以氧消耗速率指導(dǎo)的補料培養(yǎng)基優(yōu)化提升糖化酶發(fā)酵水平

張士楊1，王澤建1，王興吉2，郭美錦1，儲炬1*，莊英萍1，張嗣良1

1(華東理工大學 生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，上海，200237) 2(山東隆大生物工程有限公司，山東 臨沂，276410)

摘要黑曲霉產(chǎn)糖化酶發(fā)酵過程數(shù)據(jù)顯示，發(fā)酵中后期產(chǎn)酶速率的下降與采集的生理代謝參數(shù)氧消耗速率(oxygen uptake rate,OUR)的降低有著重要相關(guān)性，OUR的降低與某些營養(yǎng)元素控制的菌體生長和代謝有關(guān)。該文利用Design Expert 軟件，通過單因素篩選實驗、Plackett-Burman設(shè)計和中心組合設(shè)計對黑曲霉產(chǎn)糖化酶發(fā)酵過程中的補料培養(yǎng)基進行優(yōu)化，確定了流加培養(yǎng)基：棉籽蛋白4.19 g/L，糖蜜9.01 g/L，硫酸銅0.015 g/L，由此明顯改變了后期OUR快速下降和產(chǎn)物合成速率降低的問題。50 L反應(yīng)器中的發(fā)酵驗證實驗表明，添加了優(yōu)化的補料培養(yǎng)基的糖化酶酶活比未添加的罐批提升了11.35 %以上，可明顯提升糖化酶生產(chǎn)效率。

關(guān)鍵詞氧消耗速率(OUR)；黑曲霉；糖化酶；補料培養(yǎng)基；優(yōu)化；Plackett-Burman設(shè)計；中心組合設(shè)計

糖化酶(葡萄糖淀粉酶)，又稱為γ-淀粉酶或淀粉葡萄糖苷酶，是食品工業(yè)中一種需求量很高的商業(yè)生物催化劑，近年來已經(jīng)變成工業(yè)酶的第二大市場[1]。隨著我國淀粉糖業(yè)的快速發(fā)展，糖化酶的需求量日益增加，同時隨著能源和生產(chǎn)原材料價格的增加，市場競爭力和利潤空間越來越小，提高糖化酶的生產(chǎn)能力，降低生產(chǎn)成本，是提升該產(chǎn)業(yè)市場競爭力的關(guān)鍵。

眾多研究報道顯示，初始培養(yǎng)基的優(yōu)化[2-5]、不同發(fā)酵容器的優(yōu)化、分批培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)的應(yīng)用[6-8]，以及培養(yǎng)條件如含水率、溫度、pH、溶氧、攪拌的優(yōu)化[9-10]等均可以較好地提高糖化酶的生產(chǎn)水平。但在工業(yè)生產(chǎn)過程中仍然面臨發(fā)酵中后期酶增加緩慢，轉(zhuǎn)化率低的普遍現(xiàn)象，在線生理代謝參數(shù)及相關(guān)性分析的缺乏已成為進一步優(yōu)化生產(chǎn)控制工藝，提升發(fā)酵水平的關(guān)鍵。本文結(jié)合糖化酶發(fā)酵過程生理代謝參數(shù)的采集系統(tǒng)，利用多參數(shù)相關(guān)分析找到了氧消耗速率(oxygen uptake rate，OUR)控制與產(chǎn)物合成的相關(guān)性，并通過單因素篩選實驗、Plackett-Burman設(shè)計和中心組合設(shè)計考察了補料培養(yǎng)基與生理代謝參數(shù)的變化，證明了結(jié)合統(tǒng)計學方法和生理代謝參數(shù)OUR進行補料培養(yǎng)基的優(yōu)化，進而提高糖化酶在反應(yīng)器水平上的產(chǎn)量的可行性，為進行下一步相關(guān)優(yōu)化實驗提供了理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株

產(chǎn)葡萄糖淀粉酶的黑曲霉菌株AspergillusnigerLDM3，由山東隆大生物工程有限公司提供。

1.1.2培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：玉米淀粉80，玉米漿12，豆餅粉8。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：玉米淀粉200，玉米粉50，豆餅粉12，玉米漿18，KH2PO410，(HN4)2SO42，CaCl20.3。

補料培養(yǎng)基(g/L)：1水葡萄糖500，CaCl20.375。

1.2實驗方法

1.2.1種子培養(yǎng)

將茄子瓶于34 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后刮下菌苔接種于裝液量為400 mL的2 L搖瓶中，然后放置于34 ℃的搖床間260 r/min培養(yǎng)72 h。之后接種于15 L種子罐中，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和通氣使溶氧不低于30%，待殘?zhí)琴|(zhì)量濃度降至50 mg/mL時移種于50 L罐。

1.2.250 L罐培養(yǎng)

本研究采用50 L攪拌式生物反應(yīng)器(上海國強生化裝備有限公司)，初始裝液量為25 L，接種量為5 L，33 ℃，發(fā)酵過程中通過流加氨水控制pH為4.5～4.6。前期通過調(diào)節(jié)通氣和攪拌控制溶氧不低于40%，直至達到最大轉(zhuǎn)速(550 r/min)和最大通氣量(5 500 L/min)都無法改變的氧限制階段。分別通過溶氧電極和pH電極(梅特勒-托利多，瑞士)在線監(jiān)測溶氧(DO)和pH。當發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛冉抵?0 mg/mL時開始補料，并且在之后的發(fā)酵過程中控制DE值在35～45 mg/L。當菌體分化結(jié)束后(即溶氧回升階段之后)將一部分發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至搖瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3搖瓶培養(yǎng)

本研究采用500 mL搖瓶，裝液量為40 mL，在接受50 L罐轉(zhuǎn)移的發(fā)酵液之后放置于34 ℃的搖床間190 r/min進行培養(yǎng)。

1.3分析方法

菌體濃度(以PMV表示)的測定：取發(fā)酵液10 mL于離心管中，4 000 r/min離心10 min后,沉淀物占10 mL發(fā)酵液的體積百分比即為菌體濃度。

殘?zhí)菨舛鹊臏y定：按照薩氏法進行測定[11]。

NH2-N濃度測定：按照甲醛氧化法進行測定[12]。

糖化酶酶活的測定：酶活使用淀粉葡萄糖苷酶(AGI)表示。1個AGI單位定義為：在pH 4.3和溫度60 ℃條件下每分鐘從可溶性淀粉水解生成1 μmol葡萄糖所需的酶量。50 mg糖化酶標品對應(yīng)大約2 500 AGI。糖化酶酶活量測量：230 μLp-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(AGIsub)試劑(37 ℃預(yù)熱5 min)與20 μL發(fā)酵上清液混合，37 ℃反應(yīng)20 min后加100 μL AGIsub試劑，在405 nm下測量混合液體吸光度來定量糖化酶。

尾氣測定：發(fā)酵過程中的攝氧率(OUR)由過程尾氣質(zhì)譜儀(MAX300-LG，Extrel，USA)測得的氧氣含量經(jīng)軟件Biostar計算得到[13]。

1.4實驗設(shè)計

黑曲霉產(chǎn)糖化酶發(fā)酵過程OUR、溶氧及酶活變化曲線如圖1。由圖1可明顯看出，71 h左右溶氧開始回升，OUR亦快速增加，此時菌體開始分化。當OUR達到峰值，溶氧重新回到氧限制階段后菌體分化結(jié)束。結(jié)合酶活變化曲線可知，在菌體分化階段，產(chǎn)酶速率稍有減慢(75～91 h)，分化結(jié)束后OUR開始下降，產(chǎn)酶速率隨之降低，110～130 h期間OUR下降幅度較91～110 h有所減小，產(chǎn)酶速率較前一階段亦有所增加，130 h后OUR再次急劇下降，產(chǎn)酶速率再次變慢，由此得知中后期產(chǎn)酶速率的下降與OUR有著密切聯(lián)系。而OUR的降低與某些營養(yǎng)元素控制的菌體生長和代謝有關(guān)，后期補料又僅有糖和氯化鈣兩種，所以本文希望通過優(yōu)化補料培養(yǎng)基來改變中后期OUR下降的不利狀況，進而提高產(chǎn)酶速率。

圖1　OUR、溶氧和酶活變化曲線圖Fig.1　Variation curves of OUR, DO and glucoamylase activity

1.4.1單因素篩選實驗

根據(jù)文獻及先前實驗經(jīng)驗總結(jié)，共挑選出19個不同因素(棉籽蛋白、甜菜堿、糖蜜、硝酸鈉、硫酸銨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、氯化鋅、硫酸銅、氯化鈷、硫酸亞鐵、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、乙酸鈉和甘油)進行單因素補料培養(yǎng)基優(yōu)化實驗，其中棉籽蛋白來源于中棉紫光生物科技有限公司，糖蜜來源于沈陽糖蜜科技有限公司。

1.4.2篩選實驗設(shè)計——Plackett-Burman設(shè)計

經(jīng)單因素篩選實驗后，選出8個主要因素應(yīng)用Design Expert軟件(Stat-Ease Inc, Minmeapolis, USA)進行Plackeet-Burman 設(shè)計(表1)。對補料培養(yǎng)基優(yōu)化的8個主要因素進行篩選還需要外加3個虛擬變量，每個變量分別確定(+1)和(-1)兩個水平，共進行12次實驗。每次實驗都重復(fù)3次并且將酶活的平均值作為最終結(jié)果。Plackeet-Burman實驗設(shè)計中，因素篩選應(yīng)用了線性函數(shù)，忽略交互作用，一階線性模型方程式如公式(1)：

Y=β0+∑βiXi

(1)

式中：Y為響應(yīng)值，即酶活差值(酶活差值=搖瓶培養(yǎng)測得酶活-初始離罐測得酶活)；β0是模型截距；Xi是考察因素；βi是線性回歸系數(shù)，反應(yīng)Xi的影響程度。

表1　Plackett-Burman設(shè)計實驗中各因素水平

1.4.3優(yōu)化實驗設(shè)計——中心復(fù)合設(shè)計(CCD)

為了確定由Plackeet-Burman篩選出的最主要因素的最優(yōu)濃度，本文又進行了中心復(fù)合設(shè)計Central Composite Design(CCD)實驗。CCD是一種常用的響應(yīng)面設(shè)計方法，能在進行最少的實驗次數(shù)來擬合響應(yīng)面模型。該模型的每個因素通常有5個水平(-1.68, -1, 0, +1,+1.68)，如表3。根據(jù)Design Expert軟件的實驗設(shè)計，共進行20次實驗，并得到一個二階線性回歸方程，如式(2)。

(2)

式中：Y代表響應(yīng)值(酶活差值)；X1、X2和X3代表獨立變量；β0代表在中心點的回歸系數(shù)；β1，β2和β3代表線性系數(shù)；β12，β13和β23代表二階交互作用系數(shù)；β11，β22和β33代表二次項系數(shù)。

表2　中心組合設(shè)計各因素水平

1.4.450 L罐優(yōu)化實驗

將15 L種子罐的種子液各接5 L于2個50 L罐中，保持發(fā)酵過程中操作參數(shù)的一致性。在補料階段，一個反應(yīng)器補入原配方補料，另一反應(yīng)器除補入原配方補料外，在菌體分化后(96 h)再補入最優(yōu)補料培養(yǎng)基，分多次補入，觀察OUR和酶活的差異變化。

2結(jié)果與討論

2.1單因素篩選實驗結(jié)果與分析

單因素實驗結(jié)果如表3。由表3可知，經(jīng)14 h的搖瓶培養(yǎng)后一部分影響因素對應(yīng)的酶活得到提升，其中酵母膏和硫酸亞鐵兩因素提升幅度最大，達到了15%以上。而另一部分影響因素(主要為氮源)對應(yīng)酶活均有明顯下降，但培養(yǎng)35 h后，這部分因素中某些因子對應(yīng)的酶活提高了近10%，這可能是因為在初始培養(yǎng)階段，營養(yǎng)元素先用來合成菌體，之后才開始大量合成糖化酶。而培養(yǎng)35 h后各因素對應(yīng)酶活相對培養(yǎng)14 h后的酶活增長速率，即在14 h后各因素對應(yīng)酶活在每小時的增量，則表明各因素在14 h后對酶活的貢獻大小，對考查各因素在較長時間培養(yǎng)過程中對產(chǎn)酶的影響有較大幫助。綜合3組數(shù)據(jù)，篩選出棉籽蛋白、甜菜堿、糖蜜、硝酸鈉、硫酸銨、磷酸二氫鈉、硫酸銅和硫酸亞鐵8個因素進行下一步的優(yōu)化實驗。

表3　單因素實驗設(shè)計及結(jié)果

注：14 h酶活百分增量和35 h酶活百分增量均以同時段空白為對照。

2.2Plackett-Burman實驗設(shè)計結(jié)果與分析

運用Design Expert軟件進行Plackett-Burman設(shè)計并進行實驗，得到的結(jié)果如表4。

表4　Plackett-Burman 實驗設(shè)計結(jié)果

續(xù)表4

實驗號X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11酶活差值/(AGI·mL-1)5444441.70.30.01-1-1-13027.9706488841.70.30.03-1112315.4707448483.40.30.0311-1345.4658848843.40.60.03-1-1-1354.2159884443.40.30.031-11447.96510484881.70.60.031-1-12401.72011888441.70.60.01511-12502.97012884883.40.30.015-11-12552.970

注：X1～X11質(zhì)量濃度單位均為g/L。

利用Design Expert軟件對表4中的酶活差值進行計算分析后得到每個影響因素的回歸系數(shù)及其顯著性，如表5。

表5　Plackett-Burman實驗各因素的效應(yīng)表

由表5可知，標準誤差為0.29，影響水平的值有正有負，正值表示正效應(yīng)，負值表示負效應(yīng)。以X1為例，其影響水平為-1 005.29，為負效應(yīng)，即隨著棉籽蛋白濃度的增加，酶活差值呈下降趨勢，故在后續(xù)的因素優(yōu)化實驗中應(yīng)減少其濃度。另由表5可明顯看出，因素X1、X2及X8的影響率分別為20.98 %、30.56 %和23.94 %，較之其他因素明顯增高，所以顯著性分析結(jié)果為重要，即X1(棉籽蛋白)、X2(糖蜜)及X8(硫酸銅)為主要影響因子。通過影響率的篩選，得到了以酶活差值為響應(yīng)值的線性回歸方程，如式(3)。

Y=2 883.851 67-251.321 46X1+303.300 63X2-71 592.055 56X8

(3)

對線性回歸方程進行方差分析的結(jié)果如表6，方差分析模型中的Prob>F值為0.008，遠小于界定值0.05，這表示所獲得的回歸方程極其顯著，即該模型在此回歸區(qū)域的擬合性很好，故篩選出的3個因素(棉籽蛋白、糖蜜和硫酸銅)可以進行下一步的響應(yīng)面優(yōu)化。

表6　酶活差值回歸模型方程的方差分析

2.3CCD優(yōu)化設(shè)計結(jié)果與響應(yīng)面分析

利用Design Expert軟件對3個最主要影響因素進行響應(yīng)面實驗后得到的相應(yīng)結(jié)果如表7，對其進行回歸分析得到一個二次方程模型，如式(4)。

表7　CCD實驗設(shè)計及結(jié)果

(4)

式中：Y表示響應(yīng)值(酶活差值)；X1、X2和X3分別表示棉籽蛋白、糖蜜和硫酸銅的質(zhì)量濃度，g/L。

對實驗結(jié)果進行響應(yīng)面分析，擬合得到的二次模型方差分析如表8。由表8可知，模型的F值為4.04，多元相關(guān)系數(shù)R2=0.944 1，說明該模型的擬合情況較好。另外，精密度是有效信號與噪聲的比值，大于4.0視為合理，本實驗的精密度達到5.373，處于合理區(qū)。Prob>F值為0.020 1(Prob>F<0.05視為模型顯著)，表明該模型高度顯著，可用來進行響應(yīng)值預(yù)測。

通過Design Expert軟件根據(jù)二次回歸方程來繪制響應(yīng)面分析圖及其等高線(圖2)，利用該組圖可以對影響糖化酶酶活差值的補料培養(yǎng)基中任何兩種因素的交互效應(yīng)進行分析和評價以確定最佳的影響因子濃度范圍。

最終由Design expert 軟件得到41組(未列出)優(yōu)化條件，確定最優(yōu)化(即酶活差值最大)補料培養(yǎng)基配方為：棉籽蛋白4.19 g/L，糖蜜9.01 g/L，硫酸銅0.015 g/L，理論計算酶活差值達到2 730.62 AGI/mL。

表8　二次多項模型及其各項的方差分析

圖2　棉籽蛋白、糖蜜和硫酸銅對酶活差值的交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.2　Surface and contour plots of the mutual on glucoamylase activity differenceof cottonseed protein,molasses and CuSO4

2.4驗證實驗

按照優(yōu)化后的補料培養(yǎng)基配方：棉籽蛋白4.19 g/L，糖蜜9.01 g/L，硫酸銅0.015 g/L，在菌體分化后，取出一定量發(fā)酵液進行最優(yōu)化補料培養(yǎng)基驗證實驗，實測酶活差值為2 765.75 AGI/mL，與理論預(yù)測值相近，證明了利用PB和CCD方法聯(lián)用來優(yōu)化發(fā)酵過程的補料培養(yǎng)基的可行性和準確性，同時對于進一步在大罐上的優(yōu)化提供了一定的研究基礎(chǔ)。

2.550 L罐優(yōu)化實驗結(jié)果與分析討論

發(fā)酵160 h后得到的殘?zhí)?、OUR、酶活、PMV、氨水補加量和NH2-N濃度變化曲線如圖3所示。

從實驗對比結(jié)果可以看出，兩罐的菌濃(PMV)均在55 %左右，殘?zhí)前凑展に囈罂刂圃谙嗤乃?，在發(fā)酵過程OUR開始快速下降時進行補料培養(yǎng)基的流加，能夠很好地促進菌體的氧消耗速率的維持，與對照罐相比，OUR的快速下降趨勢得到了明顯遏制。氧消耗速率的增加促進了碳源底物的消耗，用于調(diào)節(jié)pH的氨水流加量也呈現(xiàn)出高于對照罐的水平，這可能是導(dǎo)致補料后NH2-N濃度略高于對照組的原因。新的補料添加工藝可以明顯促進糖化酶合成速率的維持，最終，優(yōu)化補料罐的酶活達到18 327.5 AGI/mL，比對照罐(16 460 AGI/mL)增加了11.35 %。由此可見，利用Plackett-Burman以及CCD響應(yīng)面設(shè)計進行補料培養(yǎng)基的優(yōu)化進而提高糖化酶在反應(yīng)器水平上的產(chǎn)量是可行的。

圖3　殘?zhí)?、OUR、酶活、PMV、氨水補加量和NH2-N濃度變化曲線圖 Fig.3　Variation curves of residual sugar, OUR, glucoamylase activity, PMV, ammoniaadditive amount and NH2-N concentration

3結(jié)論

將OUR與統(tǒng)計學分析方法相結(jié)合成功地應(yīng)用于黑曲霉產(chǎn)糖化酶的發(fā)酵優(yōu)化過程，研究表明：Plackett-Burman設(shè)計方法可以從單因素篩選出的眾多因素中有效地再次挑選出關(guān)鍵因素；利用CCD設(shè)計的響應(yīng)面分析可以很好地優(yōu)化關(guān)鍵因素，在得到有效的補料培養(yǎng)基組成后進行發(fā)酵罐驗證試驗，驗證結(jié)果表明：在發(fā)酵95～100 h OUR下降時開始補加優(yōu)化的補料培養(yǎng)基，能夠明顯提升菌體的氧消耗速率，促進糖化酶的快速合成，最終糖化酶的產(chǎn)量達到18 327.5 AGI/mL，比對照罐(16 460 AGI/mL)增加了11.35%。

改變補料培養(yǎng)基的配方只是優(yōu)化的開始，補料流加方式、補料流加時間以及補料流加量等諸多方面的優(yōu)化還有待進一步考察。本文結(jié)合OUR與統(tǒng)計學分析進行優(yōu)化取得了良好效果，對結(jié)合更多的操作參數(shù)和生理代謝參數(shù)進行多尺度相關(guān)分析進一步提升糖化酶的產(chǎn)量具有借鑒意義，并對生產(chǎn)放大有極大的指導(dǎo)作用。

參考文獻

[1]KELLY R M,DIJKHUIZEN L,LEEMHUIS H.Starch and α-glucan acting enzymes,modulating their properties by directed evolution[J].Journal of Biotechnology,2009,140(3):184-193.

[2]RAMADAS M,HOLST O,MATTIASSON B.Production of amyloglucosidase byAspergillusnigerunder different cultivation regimens[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,1996,12(3):267-271.

[3]KUMAR S,SATYANARAYANA T.Statistical optimization of a thermostable and neutral glucoamylase production by a thermophilic moldThermomucorindicae-seudaticaein solid-state fermentation[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2004,20(9):895-902.

[4]KUMAR S,KUMAR P,SATYANARAYANA T.Production of raw starch-saccharifying thermostable and neutral glucoamylase by the thermophilic moldThermomucorindicaeseudaticaein submerged fermentation[J].Applied Biochemistry and Biotechnology,2007,142(3):221-230.

[5]SHOJI H,SUGIMOTO T,HOSOI K,et al.Simultaneous production of glucoamylase and acid-stable α-amylase using novel submerged culture ofAspergilluskawachiiNBRC4308[J].Journal of Bioscience and Bioengineering,2007,103(2):203-205.

[6]PEDERSEN H,BEYER M,NIELSEN J.Glucoamylase production in batch,chemostat and fed-batch cultivations by an industrial strain ofAspergillusniger[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2000,53(3):272-277.

[7]MERICO A,CAPITANIO D,VIGENTINI I,et al.How physiological and cultural conditions influence heterologous protein production inKluyveromyceslactis[J].Journal of Biotechnology,2004,109(1):139-146.

[8]GANZLIN M,RINAS U.In-depth analysis of theAspergillusnigerglucoamylase (glaA) promoter performance using high-throughput screening and controlled bioreactor cultivation techniques[J].Journal of Biotechnology,2008,135(3):266-271.

[9]ELLAIAH P,ADINARAYANA K,BHAVANI Y,et al.Optimization of process parameters for glucoamylase production under solid state fermentation by a newly isolatedAspergillusspecies[J].Process Biochemistry,2002,38(4):615-620.

[10]BHATTI H N,RASHID M H,NAWAZ R, et al.Optimization of media for enhanced glucoamylase production in solid-state fermentation byFusariumsolani[J].Food Technology and Biotechnology,2007,45(1):51-56.

[11]大連輕工業(yè)學院，等.食品分析[M].北京：中國輕工業(yè)出版社,1994.

[12]KOTEVA K P,CANTIN A M,NEUGEBAUER W A,et al.Synthesis and evaluation of novel B-lactam inhibitors of human leukocyte elastase[J].Can J Chem,2001,79(4):377-387.

[13]諶頡，儲炬，莊英萍，等.質(zhì)譜儀在 avermectin 發(fā)酵過程中的應(yīng)用[J].中國抗生素雜志,2004,29(1):4-7.

Optimization of fed-batch culture for enhanced production of glucoamylase with the application of oxygen uptake rate (OUR)

ZHANG Shi-yang1， WANG Ze-jian1， WANG Xing-ji2，GUO Mei-jin1， CHU Ju1*， ZHUANG Ying-ping1， ZHANG Si-liang1

1(State Key Laboratory of Bioreactor Engineering,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237, China) 2(Shandong Longda Biological Engineering Co.Ltd,Shandong Province,Linyi 276410, China)

ABSTRACTAccording to the process data of glucoamylase fermentation by Aspergillus niger, the decrease of enzyme production rate in the middle and later periods was related to the decline of OUR influenced by cell growth and metabolism. Therefore, in this paper, the fed-batch culture was optimized through single factor screening experiments, Plackett-Burman design and central composite design with Design Expert software. The optimum feeding medium contained cottonseed protein 4.19 g/L, molasses 9.01 g/L, and CuSO4 0.015 g/L. Then the problem on enzyme production rate decreasing was significantly rescued by using the optimized culture. After the confirmatory experiments in 50 L fermentor, we found that the glucoamylase activity was enhanced by 11.35% with the addition of optimized medium.

Key wordsoxygen uptake rate; Aspergillus niger; glucomylase; fed-batch culture; optimization; Plackett-Burman design; central composite design

收稿日期：2015-10-03，改回日期：2015-11-26

基金項目：中荷國際合作項目(No. 2013DFG32630)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201604004

第一作者：碩士研究生(儲炬教授為通訊作者，E-mail: juchu@ecust.edu.cn)。