王曉蕊，鄒婷婷，郭志富，張春紅，陶冬冰 ，王寅剛，烏日娜,2*

1(沈陽農業(yè)大學 食品學院，遼寧 沈陽，110866) 2(江南大學 食品學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 3(沈陽農業(yè)大學 生物技術學院，遼寧 沈陽，110866)

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豆醬中產細菌素屎腸球菌的篩選及特性分析

王曉蕊1，鄒婷婷1，郭志富3，張春紅1，陶冬冰1，王寅剛3，烏日娜1,2*

1(沈陽農業(yè)大學 食品學院，遼寧 沈陽，110866) 2(江南大學 食品學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 3(沈陽農業(yè)大學 生物技術學院，遼寧 沈陽，110866)

摘要從農家傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中分離出164株疑似乳酸菌，其中有84株球菌。試驗篩選到1株產細菌素的屎腸球菌R1并對其理化性質進行研究。該細菌素對金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特菌、大腸桿菌等具有較好的抑制作用，對酸和熱穩(wěn)定。經鑒定該細菌素種類為腸球菌素P。菌株R1在pH3.0模擬胃液中3 h存活率達86.35%，在模擬腸液中6 h存活率達87.72%，對人工消化液耐受性良好。藥敏試驗結果表明，菌株R1對青霉素、氨芐西林、環(huán)丙沙星、氯霉素和慶大霉素敏感，對諾氟沙星和紅霉素不敏感，未檢測出毒力因子，具有潛在安全性。

關鍵詞屎腸球菌；細菌素；豆醬；特性

乳酸菌細菌素，是由乳酸菌通過核糖體合成機制產生的一類具有抗菌活性的蛋白質類物質[1]，可作為天然防腐劑，對病原菌和腐敗菌的生長繁殖具有抑制作用[2]。乳酸菌本身對其產生的細菌素具有免疫性[3]。細菌素具有安全、無毒，可被人體降解等諸多優(yōu)點，因此在開發(fā)天然防腐劑領域引起廣泛關注[4]。

屎腸球菌(Enterococcusfaecium)是乳酸菌的一種，能夠產生細菌素的屎腸球菌廣泛存在于大豆發(fā)酵制品中[5]。該菌對于高溫、高鹽、酸堿和氧氣具有較好抗逆性，也具有較好的免疫性和腸道黏附能力[6-7]，在高溫和低pH值條件下的穩(wěn)定性對提高細菌素的產量有著積極的作用[8]。屎腸球菌產生的類細菌素具有分子質量小、熱穩(wěn)定性強等特點，具有良好的應用前景[9]。

傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中微生物種類繁多，并含有異黃酮類、多酚類、大豆皂苷、類黑精等多種對人體有益的生理活性物質，具有很好的保健功能[10]。本研究以金黃色葡萄球菌為指示菌，從農家傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中篩選出產細菌素的屎腸球菌，并對細菌素相關性質進行分析，希望用天然細菌素代替?zhèn)鹘y(tǒng)抗生素，為天然食品防腐劑和飼料添加劑的開發(fā)應用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1分離材料

遼寧省(沈陽、康平、錦州、營口、撫順和丹東)傳統(tǒng)農家發(fā)酵豆醬。

1.1.2主要試劑及培養(yǎng)基

胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K，上海福芮生物科技有限公司；牛膽鹽，上海研生實業(yè)有限公司；藥敏紙片，杭州長城機電市場；LB培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基。

1.1.3指示菌

金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusAS1.2465)、大腸桿菌O157:H7(EscherichiacoliO157:H7 882364)、單核細胞增生李斯特菌(ListeriamonocytogenesC53-3)、弗氏志賀氏菌(ShigellaflexneriCMCC51592)和鼠傷寒沙門氏菌(SalmonellatyphimuriumS50333)由內蒙古農業(yè)大學保存；植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)由本實驗室分離得到。

1.2儀器與設備

LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠；生物潔凈工作臺,蘇州市華宇凈化設備有限公司；DNP-9080型生化培養(yǎng)箱,上海精宏試驗儀器有限公司；牛津杯,上海江星儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1乳酸菌的分離與純化

采用常規(guī)平板稀釋法[11]和平板劃線分離法[12]對豆醬中乳酸菌進行分離純化，之后進行革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗。

1.3.2產細菌素乳酸菌的初篩

采用牛津杯法[13]，將乳酸菌發(fā)酵液于10 000 r/min離心10 min取上清液備用。調指示菌濃度為107CFU/mL，取100 μL均勻涂布在LB固體培養(yǎng)基上，4 ℃靜置1 h后，等距放置3個牛津杯，分別加入100 μL無菌發(fā)酵上清液，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，用游標卡尺測量抑菌圈直徑。

1.3.3產細菌素乳酸菌的復篩

1.3.3.1有機酸的排除[2]

乳酸菌發(fā)酵上清液用1 mol/L的NaOH或HCl溶液調節(jié)pH至5.0，同時測定pH5.0的乙酸和乳酸的抑菌活性，重復3次取均值。

1.3.3.2過氧化氫的排除[14]

將乳酸菌發(fā)酵上清液于80 ℃水浴加熱10 min，測抑菌活性，重復3次取均值。

1.3.3.3蛋白酶類抑菌物質的確定[1]

將胰蛋白酶溶解到50 mmol/L的磷酸緩沖液(pH7.6)中，再加入到乳酸菌發(fā)酵上清液，使其終濃度為1 mg/mL，調節(jié)pH至7.6，37 ℃水浴1 h后，調回初始pH，檢測抑菌活性，重復3次取均值。

1.3.4產細菌素乳酸菌菌株的鑒定

1.3.4.1生理生化鑒定

根據(jù)相關文獻[15、16]對菌株進行生理生化鑒定。

1.3.4.216S rRNA基因序列同源性分析鑒定

優(yōu)化的CTAB法提取菌株DNA[17]。采用通用引物[18]進行PCR擴增，將片段長度約為1 500 bp的陽性產物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行測序。在NCBI上使用BLAST進行同源性比對，并用MEGA軟件包以neighbour-joining (NJ)法構建系統(tǒng)發(fā)育樹[19]。

1.3.5抑菌譜的測定

選取單核細胞增生李斯特菌、沙門氏菌、地衣芽孢桿菌等多種菌株作為指示菌，采用牛津杯法測定產細菌素乳酸菌的抑菌譜。

1.3.6細菌素穩(wěn)定性研究[20]

1.3.6.1細菌素的酸堿穩(wěn)定性

用1 mol/L的NaOH或HCl溶液調節(jié)乳酸菌發(fā)酵上清液pH至2～10，37 ℃保溫2 h后，測抑菌活性，重復3次取均值。

1.3.6.2細菌素的熱穩(wěn)定性

用1 mol/L的NaOH溶液將乳酸菌發(fā)酵上清液pH調至5.0，分別在60、80、100 ℃處理30 min，121 ℃處理15 min，以相同pH值的未經加熱處理的發(fā)酵上清液作為空白對照，檢測抑菌活性，重復3次取均值。

1.3.6.3細菌素對蛋白酶的敏感性

方法同“1.3.3.3”所述，采用胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶k。

1.3.7細菌素種類的確定

1.3.7.1腸球菌素基因PCR檢測

參考文獻按[20-21]設計引物，引物由天根生化科技有限公司合成(表1)。以基因組DNA為模板擴增細菌素基因序列，所得PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測[22]。[27]合成腸球菌毒力基因相關引物，見表2。以基因組DNA為模板，對目的毒力因子基因進行PCR擴增，所得PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1　菌株R1細菌素相關基因PCR擴增引物

1.3.7.2細菌素基因片段的克隆

采用膠回收試劑盒(Sangon Biotech SK8132)對PCR產物進行純化回收，按載體說明，將純化后的PCR產物與pEASY-T1載體相連接，連接產物于-20 ℃保存。向50 μL大腸桿菌感受態(tài)細胞中加入5 μL連接產物，混勻，冰浴靜置30 min。于42 ℃水浴60～90 s，迅速放于冰上5 min。加入500 μL LB液體培養(yǎng)基，混勻，于37 ℃，150 r/m搖床培養(yǎng)1 h。取150 μL菌體均勻涂布于含有氨芐的LB固體平板，37 ℃培養(yǎng)12～16 h。挑取平板上的白斑接種于10 μL RNase-Free Water中，混勻，以該混合物為模板進行PCR檢測，將有條帶的樣品轉移到10 mL含有氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，150 r/m搖床培養(yǎng)12～16 h。將培養(yǎng)好的新鮮菌液送至上海桑尼生物科技有限公司進行測序。

1.3.8產細菌素菌株的益生性

1.3.8.1模擬胃液耐受性

參照國家藥典[23]配制模擬胃液，取活化好的菌液于6 000 r/min離心2 min，向菌體中加入與培養(yǎng)基等量的模擬胃液，37 ℃培養(yǎng)3 h，采用傾注培養(yǎng)法對0、3 h的培養(yǎng)液進行活菌計數(shù)[24]，計算存活率。

1.3.8.2模擬腸液耐受性

參照國家藥典[23]配制模擬腸液，取活化好的菌液于6 000 r/min離心2 min，向菌體中加入與培養(yǎng)基等量的模擬腸液，37 ℃培養(yǎng)6 h，采用傾注培養(yǎng)法對0、2、4、6 h的培養(yǎng)液進行活菌計數(shù)，計算存活率。

1.3.8.3膽鹽耐受性

將菌株發(fā)酵液以3%接種量接種到含有0.3%膽鹽濃度的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)6 h后，采用傾注培養(yǎng)法對0、2、4、6 h的培養(yǎng)液進行活菌計數(shù)，計算存活率。

1.3.9產細菌素菌株的安全性

1.3.9.1菌株的耐藥性

采用藥敏紙片法[6,25]測定菌株耐藥性，參照紙片法抗菌藥物敏感試驗標準進行判定[26]，重復3次取均值。

1.3.9.2毒力基因檢測

2結果與分析

2.1乳酸菌的分離

從遼寧省6個地區(qū)的13份豆醬樣品中，共分離出164株革蘭氏染色為陽性，過氧化氫酶試驗為陰性的疑似乳酸菌菌株，包括84株球菌。

表2　毒力因子基因PCR擴增引物

2.2產細菌素乳酸菌的篩選

從84株球狀疑似乳酸菌中，初篩得到24株具有較好抑菌特性的菌株，再進行復篩。

酸排除試驗后，菌株FSI-4、FSI-3和R1的抑菌性分別下降27.45%、19.83%和12.26%；H2O2排除試驗后，抑菌性分別下降16.26%、3.79%和2.59%，鑒于菌株R1受酸和H2O2的影響最小，且其抑菌活性相對于其他菌種最好，所以后續(xù)試驗均采用R1為目的菌株。具體結果見表3和圖1。

表3　產細菌素乳酸菌復篩結果

注：“-”沒有抑菌效果，包含牛津杯直徑為8 mm。

R1的發(fā)酵上清液用胰蛋白酶處理后不產生抑菌圈，抑菌活性下降100%。可以推測該抑菌物質對蛋白酶敏感，屬于蛋白質類物質，可初步確定為細菌素。

2.3產細菌素菌株的鑒定

2.3.1生理生化試驗

如表4，根據(jù)菌株形態(tài)特征并參照《伯杰細菌鑒定手冊(第八版)》[15]和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[16]，菌株R1屬于腸球菌屬(Enterococcussp.)。

A-發(fā)酵上清原液抑菌情況；B-pH5.0的發(fā)酵上清液抑菌情況；C-排除H2O2后抑菌情況；D-胰蛋白酶處理后抑菌情況圖1　菌株R1的復篩結果Fig.1　Further screening of bacteriocin producing R1

試驗項目葡萄糖阿拉伯糖乳糖蔗糖半乳糖麥芽糖甘露糖山梨醇果糖淀粉水解明膠液化纖維二糖檸檬酸鹽丙酮酸鹽0.02%疊化鈉0.04%碲酸鹽過氧化氫酶40%膽鹽精氨酸雙水解酶10℃和45℃6.5%NaClpH9.6結果+++++++﹣+﹣﹣+﹣﹣+﹣﹣+++++

注：“+”陽性；“-”陰性。

2.3.216S rDNA 序列同源性分析鑒定

電泳圖顯示，在約1 500 bp處出現(xiàn)熒光條帶，擴增成功。將測序結果在NCBI上進行BLAST比對，確定該菌株為屎腸球菌(Enterococcusfaeciums)。系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2。

圖2　R1的16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2　Phylogenetic tree of strain R1 based on 16S rDNA gene sequence

2.4抑菌譜的測定

如表5所示，R1所產細菌素對多數(shù)指示菌有一定程度的抑制作用，尤其是對單核細胞增生李斯特菌顯示出較強的抑制能力，抑菌范圍較廣。

表5　細菌素的抑菌譜

注：“-”無抑菌性；“+”抑菌圈直徑<10 mm；“++”抑菌圈直徑10～15 mm；“+++”抑菌圈直徑>15 mm。

2.5細菌素穩(wěn)定性的研究

鑒于R1對李斯特菌的抑制能力最強，以下試驗均選取李斯特菌為指示菌。

2.5.1細菌素酸堿穩(wěn)定性

R1所產細菌素在pH 2～6時均具有抑菌活性，隨pH升高抑菌活性逐漸下降，pH 7～10已無抑菌活性，可見該細菌素在酸性環(huán)境下具有較好的抑菌效果，說明酸有助于其發(fā)揮抑菌作用。見表6。

表6　細菌素的酸堿穩(wěn)定性

注：“-”沒有抑菌效果。

2.5.2細菌素熱穩(wěn)定性

細菌素殘余活性隨溫度升高而下降，在121 ℃條件下處理15 min后，抑菌活性仍然保留78%，說明其具有一定的熱穩(wěn)定性。見表7。

表7　細菌素的熱穩(wěn)定性

2.5.3細菌素對蛋白酶的敏感性

R1所產細菌素易被胰蛋白酶和蛋白酶k降解，抑菌活性下降100%，胃蛋白酶處理后抑菌活性亦顯著下降，可以確定該物質對蛋白酶敏感，確為蛋白質類物質。見表8。

表8　細菌素對蛋白酶敏感性

注：“-”沒有抑菌效果。

2.6細菌素種類的確定

只有以EntP-F/R為引物的PCR產物大小與預期片段長度相同，該產物經純化克隆后，由上海桑尼生物科技有限公司測序，將所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對，證實菌株R1所產細菌素的種類為EntP。

2.7產細菌素菌株的益生性

由于飲食結構不同胃液pH通常在1.5～4.5之間波動，一般為3.0[24]。經3 h培養(yǎng)，菌株R1在pH2.5和pH3.0的模擬胃液中存活率分別達44.10%和86.35%，可見，該菌株對模擬胃液具有很好的耐受性。見表9。

表9　屎腸球菌R1對模擬胃液的耐受性

正常人體小腸中膽汁鹽質量濃度在0.3～3.0 g/L之間[28]。R1在模擬腸液中培養(yǎng)6 h后，存活率為87.72%，在含0.3%膽鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h后，存活率為32.21%(見表10)，可見，該菌株對模擬腸液和膽鹽也有一定程度的耐受性，該菌株具有潛在的益生特性。

表10　屎腸球菌R1對模擬腸液和膽鹽的耐受性

2.8產細菌素菌株的安全性

參照紙片法抗菌藥物敏感試驗標準，根據(jù)抗菌藥物對試驗菌株產生的抑菌圈大小或最小抑菌濃度(MIC)的不同，將評價標準分為敏感(Susceptible)、中介(Intermediate)和耐藥(Resistant)。R1對所選抗生素均無抗性(見表11、圖3)。毒力基因PCR擴增后的電泳圖譜并沒有和預期片段大小相同的條帶出現(xiàn)，可初步確定R1不含這6種毒力基因，具有潛在安全性。

表11　屎腸球菌R1藥敏試驗結果

圖3　屎腸球菌R1藥敏試驗結果Fig.3　Profile of antibiotics susceptibility of E.faeciums R1

3結論

本試驗從傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中分離得到1株產細菌素的屎腸球菌R1，所產細菌素種類為腸球菌素P。菌株R1對人工消化液具有很好的耐受性，其產生的細菌素具有熱穩(wěn)定性好、pH范圍寬等特性，這與AHMADOVA[29]等從奶酪中分離出的屎腸球菌AQ71所產細菌素的性質相似，與之相比，R1所產細菌素對于化學試劑的穩(wěn)定性值得進一步探究。

該細菌素對多種指示菌都具有較好的抑菌效果，尤其是對李斯特菌效果顯著。MTIBAA[30]等對屎腸球菌所產細菌素的基因序列進行分析，證實了羥脯氨酸殘基是其抑制單增李斯特菌細菌的作用方式。而從蛋白角度，GOMEZ[31]等將腸球菌素AS48作用于李斯特菌后，發(fā)現(xiàn)李斯特菌的多種應激蛋白和細胞代謝蛋白發(fā)生變化，這為腸球菌素AS48抑菌機理的研究提供了方向。目前，國內對于腸球菌素P研究甚少，其對李斯特菌抑制機理值得進一步探索。

此外，菌株R1對青霉素、環(huán)丙沙星等多種抗生素敏感，并且未檢出毒力基因，具有潛在的安全性。

乳酸菌素作為天然的食品防腐劑和飼料添加劑具有廣闊的開發(fā)應用前景。本試驗篩選出的產細菌素的屎腸球菌R1，具有較好的穩(wěn)定性、益生性和潛在的安全性，可作為今后開發(fā)利用的優(yōu)質菌種資源。

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Characterization of bacteriocin produced byEnterococcusfaeciumisolated from soypaste

WANG Xiao-rui1, ZOU Ting-ting1, GUO Zhi-fu3, ZHANG Chun-hong1,TAO Dong-bing1, WANG Yin-gang3, WU Ri-na1,2﹡

1(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China) 2(State Key Laboratory of Food Science and Technology, College of Food Science, Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 3(College of Biotechnology,Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

ABSTRACTTo provide strain for the development and application of natural food preservatives and feed additives, 164 suspected lactic acid bacteria strains including 84 coccus-shaped strains were isolated from naturally fermented soypaste. A strain of Enterococcus faecium R1 producing bacteriocin was selected. Its physical and chemical properties were studied. The bacteriocin had a strong inhibitory effect to Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli and other bacteria, and was not affected by high temperature and low pH. The bacteriocin was found to possess enterocin P. Results showed that the survival rate of strain R1 was 86.35% in pH3.0 simulated gastric fluid for 3 h and 87.72% in simulated intestinal fluid for 6 h. Strain R1 had good tolerance to artificially digested liquid. Strain R1 was sensitive to penicillin, ampicillin, ciprofloxacin, chloramphenicol and gentamicin, but was insensitive to norfloxacin and erythromycin. It was negative for the tested virulence factors. This revealed that strain R1 might be safe for further application.

Key wordsEnterococcus faecium; bacteriocin; soypaste; characterization

收稿日期：2015-11-25，改回日期：2016-01-05

基金項目：國家自然科學基金項目(31471713)；中國博士后科學基金項目(2014M560395)；遼寧省農業(yè)領域青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)計劃(2014048)；遼寧省高等學校優(yōu)秀人才支持計劃(LR2015059)；江蘇省博士后科研資助計劃(1402071C)；沈陽農業(yè)大學"天柱山英才支持計劃"項目

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201604017

第一作者：碩士研究生(烏日娜副教授為通訊作者,E-mail:wrn6956@163.com)。