李傳鳳，楊安琦，王明成

(黃淮學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，河南 駐馬店 463000)

豆醬的主要原料為大豆，通過多種曲霉發(fā)酵制成[1-2]，黃豆醬的顏色為紅棕色或者紅褐色，表面具有光澤，有醬香味和脂香味[3]。豆醬中富含營養(yǎng)物質(zhì)，一類是由大豆原料組成，含有大豆中的消化酶、異黃酮、蛋白質(zhì)、維生素、膽堿和胰蛋白酶等；另一類則是在發(fā)酵和加工過程中產(chǎn)生的肽類和類黑精等[4-5]，這些營養(yǎng)物質(zhì)能改善和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能[6-7]，極易被吸收，深受消費(fèi)者的喜愛[8]。

隨著社會(huì)的發(fā)展，食品的分析檢測方法不斷地提高，標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)醬類產(chǎn)品已經(jīng)成為必然趨勢。隨著近年來對(duì)醬類產(chǎn)品研究的深入，豆醬中的生物活性功能物質(zhì)不斷被發(fā)現(xiàn)，其價(jià)值也不斷被提高[9-11]。

長時(shí)間以來，采用傳統(tǒng)加工工藝的豆醬在市場上有著主導(dǎo)地位，主要是由于該種方式生產(chǎn)豆醬需要的技術(shù)水平很低，需要的設(shè)備簡單，容易操作。但是該種加工工藝也存在一定的缺陷，豆醬發(fā)酵周期長，劣質(zhì)產(chǎn)品層出不窮[12]，很大程度上影響了豆醬的名譽(yù)，為豆醬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展帶來一定的阻力[13-14]。

豆醬發(fā)酵過程中微生物種類復(fù)雜，并且微生物的發(fā)酵伴隨著較多的化學(xué)變化，很難清晰呈現(xiàn)[15]。傳統(tǒng)的豆醬加工主要依靠環(huán)境中的微生物進(jìn)行發(fā)酵，通過此方式生產(chǎn)豆醬需要6～10個(gè)月，使得豆醬的生產(chǎn)成本較高，很大程度上阻止了豆醬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[16-17]。

本研究基于此，對(duì)傳統(tǒng)豆醬發(fā)酵過程中微生物的多樣性和理化性質(zhì)進(jìn)行研究，旨在為今后豆醬的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)?；a(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 原材料與試劑

面粉：河南面粉廠；牛肉膏：上海生化制藥廠；大豆：購于當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場；甘露糖、木糖、阿拉伯糖：Sigma公司；酵母粉：上海生化制藥有限公司；胰蛋白胨：上海生物試劑有限公司；硝酸鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、蔗糖、瓊脂和麥芽汁。

1.2 試驗(yàn)儀器

恒溫培養(yǎng)箱、手提式壓力消毒器、恒溫振蕩器、MP512-01型精密pH計(jì) 上海三信儀表廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 豆醬自然發(fā)酵工藝

1.3.1.1 大豆浸泡

取大豆100 kg，去雜質(zhì)和泥沙，之后放入池子中浸泡，加水浸泡超過豆面5 cm，大豆浸泡10 h，直至豆醬本身的重量升高至原來的2～3倍，待豆粒膨脹無皺紋，將水放掉，濾干備用。

1.3.1.2 蒸豆

將大豆放入鍋中蒸2 h，直到大豆熟透而不爛，豆子無硬心為宜。

1.3.1.3 自然發(fā)酵

把蒸熟的大豆出鍋，放至80 ℃時(shí)，將75 kg面粉與大豆混合均勻，放于室內(nèi)，依靠自然界中的微生物進(jìn)行自然發(fā)酵。當(dāng)看到豆醬表面有白色菌絲，并且有少量的淡綠色孢子，同時(shí)具有曲香味時(shí)即可。之后加入5%的鹽水，混合均勻后自然晾曬，每星期翻醬2～4次，時(shí)間為90～120 d，即可制成。

1.3.2 豆醬發(fā)酵過程中微生物的分離和培養(yǎng)

在豆醬發(fā)酵的過程中，每個(gè)階段進(jìn)行樣品采集，采用稀釋涂布法，把豆醬中的微生物進(jìn)行分離和培養(yǎng)。

1.3.3 微生物的分類及檢索鑒定

根據(jù)菌落形態(tài)特征進(jìn)行歸類，選取單一的菌落，采用劃線方式進(jìn)行純化。初步鑒定細(xì)菌的種類，根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌系統(tǒng)分類學(xué)手冊》、《酵母菌的特征與鑒定手冊》和《真菌鑒定手冊》等相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行分類鑒定。

1.3.4 氨基態(tài)氮的測定

氨基態(tài)氮是由氨基和羧基構(gòu)成，它們相互中和，成為中性鹽，當(dāng)甲醛溶液加入時(shí)，氨基和甲醛的親和性更高，從而中和，使得溶液的羧基單獨(dú)游離出來，導(dǎo)致溶液成為堿性，采用酸堿滴定法，測定氨基態(tài)氮含量來間接測定豆醬中氨基酸含量[18]。

1.3.5 pH值和總酸度的測定

pH值的測定：采用精密pH計(jì)其進(jìn)行檢測。

總酸度的測定：使用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行中和滴定，并以酚酞指示其滴定終點(diǎn)。

1.3.6 蛋白酶活力的測定

蛋白酶活力的測定：采用福林-酚試劑法[19]。

2 結(jié)果與討論

2.1 豆醬發(fā)酵過程中酸度和pH的變化

在自然條件下，豆醬發(fā)酵過程中總酸度和pH值隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而變化，見圖1。

圖1 豆醬發(fā)酵過程中pH值和酸度的變化

由圖1可知，發(fā)酵開始時(shí)，豆醬中的酸性物質(zhì)較少，此時(shí)的豆醬pH為7，豆醬中的酸度為0。隨著發(fā)酵時(shí)間的增長，豆醬中的微生物不斷地繁殖和產(chǎn)酸，使得豆醬中的酸度快速增長。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間小于20 d時(shí)，豆醬中的酸度快速增加，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，酸度增加的速度逐漸減緩。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到120 d時(shí)，豆醬中的酸度和pH值不再發(fā)生改變。

2.2 豆醬發(fā)酵過程中蛋白酶活力和氨基態(tài)氮的變化

由圖2可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增長，豆醬中的蛋白酶活為呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間小于20 d時(shí)，豆醬中的蛋白酶活隨著發(fā)酵時(shí)間的增長而快速增長。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為20～60 d時(shí)，雖然豆醬中的蛋白酶活也在增長，但是增長的速度明顯減緩。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間大于60 d時(shí)，豆醬中的蛋白酶活隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而逐漸降低。

圖2 豆醬中蛋白酶活力和氨基態(tài)氮隨時(shí)間的變化情況

豆醬中的氨基態(tài)氮隨著發(fā)酵時(shí)間的增長而逐漸增長，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間小于20 d時(shí)，豆醬中的氨基態(tài)氮快速增長。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間大于20 d時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，豆醬中氨基態(tài)氮增長的速度雖然明顯減緩，但還具有一定的增長幅度。

2.3 豆醬發(fā)酵過程中微生物多樣性分析

在豆醬發(fā)酵的不同時(shí)間，分別對(duì)不同發(fā)酵時(shí)期的樣品進(jìn)行采樣，對(duì)微生物的菌株進(jìn)行純化。根據(jù)分離的菌株菌落形態(tài)進(jìn)行歸類。不同的發(fā)酵時(shí)間，豆醬中微生物的多樣性差異較大。不同時(shí)期豆醬中微生物多樣性見表1。

表1 豆醬發(fā)酵的不同階段體系中微生物的組成

由表1可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增長，豆醬中的霉菌、酵母菌和細(xì)菌所占的比例均發(fā)生改變。但是無論是哪一種菌，都呈現(xiàn)出先增長后降低的趨勢。這是由于發(fā)酵開始時(shí)豆醬中的環(huán)境比較適合微生物的生長，隨著發(fā)酵時(shí)間的增長，豆醬中的酸度逐漸增加，整個(gè)環(huán)境不適合微生物的生長和繁殖，所以微生物的比例逐漸降低。

將豆醬發(fā)酵分為3個(gè)發(fā)酵階段：第一階段為第1天～第15天，第二階段為第15天～第60天，第三階段為第60天～第180天。

圖3 豆醬發(fā)酵過程中3個(gè)階段微生物多樣性分析

在第一階段發(fā)酵過程中，由于發(fā)酵剛剛開始，豆醬中微生物種類受環(huán)境影響明顯，此時(shí)，環(huán)境中微生物種類是決定豆醬品質(zhì)的關(guān)鍵。該階段豆醬中的霉菌占主要優(yōu)勢。霉菌種類有米曲霉、醬油曲霉、高大毛霉和黑曲霉。微生物在豆醬上生長，此過程中，微生物會(huì)分泌各種蛋白酶和淀粉酶，使豆醬中的蛋白質(zhì)水解成多肽和氨基酸，為后期微生物的生長發(fā)酵提供了基礎(chǔ)。

第二階段的發(fā)酵需要添加鹽水。高鹽環(huán)境和缺氧條件導(dǎo)致豆醬中的霉菌停止了生長，但霉菌分泌的蛋白酶和淀粉酶能夠繼續(xù)水解蛋白質(zhì)和淀粉。同時(shí)豆醬中的乳酸菌和酵母菌快速繁殖，產(chǎn)生乙醇、乳酸和醋酸等產(chǎn)物，由于有機(jī)酸的積累，豆醬中的pH值不斷下降，中性蛋白酶和堿性蛋白酶的活性逐漸被削弱。

第三階段的發(fā)酵為豆醬的成熟階段，豆醬中的酸性成分和酒精不斷積累，導(dǎo)致豆醬中的微生物停止生長，但一些基本的代謝功能還保留著，隨著豆醬發(fā)酵時(shí)間的不斷延長，豆醬中的酸性逐漸降低，不適合微生物的生長和繁殖，微生物數(shù)量開始逐漸減少，直到趨于穩(wěn)定，微生物的種類基本保持一致，此階段是豆醬風(fēng)味形成的關(guān)鍵階段。

2.4 不同霉菌菌株的蛋白酶活力

蛋白酶活力是菌株質(zhì)量品質(zhì)的重要指標(biāo)，其能力的強(qiáng)弱對(duì)豆醬的發(fā)酵具有重大意義，將4種菌株接種于大豆培養(yǎng)基上，放于室溫下培養(yǎng)2 d，進(jìn)行蛋白酶活力測定，結(jié)果見圖4。

圖4 不同霉菌蛋白酶活力

由圖4可知，不同的霉菌的蛋白酶活力存在一定的差異。其中米曲霉和黑曲霉的蛋白酶活力更強(qiáng)，醬油曲霉和高大毛霉的蛋白酶活力相對(duì)較弱。如果使用蛋白酶活力較高的菌株，則可以獲得風(fēng)味更佳的豆醬。

3 小結(jié)

品質(zhì)較高的豆醬發(fā)酵劑主要來源于風(fēng)味較佳的豆醬。發(fā)酵劑的品質(zhì)決定著豆醬的口感、風(fēng)味和香氣等感官特征[20]。所以，選擇優(yōu)良的發(fā)酵劑對(duì)豆醬發(fā)酵十分重要。因此，為獲得品質(zhì)優(yōu)良的豆醬，研發(fā)豆醬發(fā)酵過程中微生物的變化至關(guān)重要。本研究通過研究豆醬發(fā)酵過程中微生物的多樣性，為研究適合的人工菌種發(fā)酵豆醬奠定了基礎(chǔ)。