張海濤，袁麗萍，彭啟迪，桂　明，胡　波

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，安徽 合肥　230022)

?

酸敏感離子通道在紫癜性腎炎腎組織中的表達(dá)及其對腎損傷的影響

張海濤，袁麗萍，彭啟迪，桂明，胡波

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，安徽 合肥230022)

摘要：目的觀察酸敏感離子通道(acid-sensing ion channels,ASICs) 在紫癜性腎炎(henoch-Sch?nlein purpura nephritis, HSPN) 患兒腎組織中的表達(dá)并探討其在HSPN患兒腎損傷中的作用。方法 采用免疫組化法觀察HSPN患兒及單純腎病綜合征患兒腎組織中ASIC1a、ASIC2a、ASIC3 的表達(dá)部位及水平；對HSPN患兒24 h尿蛋白定量與腎組織中ASICs的表達(dá)做相關(guān)性分析，另外根據(jù)尿系列蛋白檢查中的αl-MG 和β2-MG是否異常將HSPN患兒分為兩組，觀察ASICs在其兩組HSPN患兒腎小管中的表達(dá)情況。 結(jié)果免疫組化顯示ASIC1a、ASIC2a 、ASIC3 在HSPN患兒腎小管上的表達(dá)較對照組顯著增多(P<0.01)。ASIC3 在HSPN患兒腎小管上的表達(dá)定量與24 h尿蛋白定量呈正相關(guān)(r=0.644，P=0.017)，根據(jù)尿系列蛋白檢查αl-MG 和β2-MG是否異常將HSPN患兒分為兩組，ASIC3 在αl-MG異常組和β2-MG異常組中的表達(dá)較對照組(正常組)顯著增多(P<0.01)，ASIC2a在αl-MG異常組中的表達(dá)較對照組(正常組)增多( P<0.05)。結(jié)論ASICs 可能參與了紫癜性腎炎腎小管的損傷過程。ASICs 與HSPN患兒蛋白尿，尤其是微量蛋白尿的產(chǎn)生可能存在一定關(guān)系。

關(guān)鍵詞：過敏性紫癜性腎炎;酸敏感離子通道；微量蛋白尿；腎小管

酸敏感離子通道(acid-sensing ion channels, ASICs)屬于退化蛋白/鈉通道超家族中的一員[1]，由4個功能基因ASIC1、ASIC2、ASIC3、ASIC4編碼，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分為ASIC1a、ASIC2a、ASIC1b ASIC1b2、ASIC2b、ASIC3 和ASIC4等至少7個亞單位,它們的同聚體或異聚體表現(xiàn)出不同的離子選擇性及通道特性，可以被質(zhì)子激活或調(diào)節(jié)其他亞單位[2-4]。過敏性紫癜 (henoch-Sch?nlein purpura，HSP)是與自身免疫損傷有關(guān)的急性小血管炎，以非血小板減少性紫癜性皮疹、出血性胃腸炎、關(guān)節(jié)炎及腎小球腎炎為主要臨床表現(xiàn)，其中30%～60%的HSP兒童患者可能累及腎臟，出現(xiàn)蛋白尿、血尿和管型尿，伴有浮腫及血壓增高等臨床表現(xiàn)，稱紫癜性腎炎(henoch-Sch?nlein purpura nephritis，HSPN)[5]。在HSP急性期，炎癥刺激可以導(dǎo)致組織酸化，由于ASICs是一類能被細(xì)胞外酸化基團(tuán)所激活的配體門控通道，大量相關(guān)的ASICs通道可能被激活，在病理狀態(tài)下導(dǎo)致Ca2+等陽離子通透性增加[6]，從而損傷細(xì)胞。而目前國內(nèi)外的文獻(xiàn)中尚未明確闡明HSPN中腎損傷的發(fā)病機(jī)制是否和ASICs參與的炎癥反應(yīng)相關(guān)。本研究旨在觀察ASICs 在HSPN 患兒及單純腎病綜合征患兒腎組織中的表達(dá)部位及水平；同時觀察ASICs在不同尿蛋白和微量蛋白尿HSPN患兒的表達(dá)情況。初步探討ASICs 是否參與了紫癜性腎炎腎小管的損傷過程以及ASICs 與HSPN患兒蛋白尿的產(chǎn)生是否存在一定關(guān)系。

1資料和方法

1.1研究對象選取2013年1月—2015年1月在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科因病情需要做腎穿的HSPN患兒13例，其中男性6例，女性7例，發(fā)病年齡為5歲2個月～13歲4個月，在腎穿后收集其腎活檢組織。對照組7例，為單純腎病綜合征患兒，其中男性3例，女性4例，發(fā)病年齡為4歲3個月～14歲1個月，收集其腎活檢組織。

1.2試劑與儀器免疫組化試劑盒為北京中杉金橋公司產(chǎn)品，兔抗ASIC1、ASIC2、ASIC3多克隆抗體為abcam公司產(chǎn)品，DAB顯色劑為北京中杉金橋公司產(chǎn)品。

1.3方法按照免疫組化試劑盒操作要求檢測ASICs 在HSPN 患兒腎組織中的表達(dá)情況，將單純腎病綜合征患兒腎組織作為對照組。每張切片觀察4 個400 倍物鏡視野，以腎小管胞漿呈棕黃色為陽性，免疫組化分?jǐn)?shù)= 染色后的腎小管胞漿平均光密度值× 陽性染色血管面積/總血管面積，該例的免疫組化分?jǐn)?shù)為免疫組化分?jǐn)?shù)相加除以4。同時將HSPN患兒24 h尿蛋白定量與腎組織上ASICs的表達(dá)定量做相關(guān)性分析，另外將HSPN患兒根據(jù)尿系列蛋白檢查αl-MG是否異常分為正常組和異常組，根據(jù)β2-MG是否異常也分為正常組和異常組，觀察ASICs在其兩組HSPN患兒腎小管中的表達(dá)情況。

2結(jié)果

2.1ASICs在HSPN患兒腎組織上的表達(dá)部位及水平HSPN 患兒腎組織中可以看到ASIC1a、ASIC2a、ASIC3在腎小管胞漿表現(xiàn)為染成棕褐色的顆粒，染色強(qiáng)度明顯加深，陽性血管數(shù)明顯增多，對照組ASIC1a、ASIC2a、ASIC3表達(dá)較HSPN 組明顯減少，見圖1。免疫組化結(jié)果顯示HSPN 組ASIC1a、ASIC2a、ASIC3表達(dá)明顯高于對照組(P<0. 01) ，差異有統(tǒng)計學(xué)意義,見表1。

圖1　免疫組化法檢測HSPN患兒

注：A、C、E: HSPN 組ASIC1a、ASIC2a、ASIC3 的表達(dá);B、D、F: 對照組ASIC1a、ASIC2a、ASIC3 的表達(dá)。

表1　HSPN 患兒及單純腎病綜合征

注：與對照組比較:*P<0. 01。

2.2ASICs在不同微量蛋白尿HSPN患兒腎小管中的表達(dá)情況免疫組化結(jié)果顯示ASIC3 在αl-MG異常組和β2-MG異常組中的表達(dá)較正常組顯著增多(P<0.01)，ASIC2a在αl-MG異常組中的表達(dá)較正常組增多(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義,見表2和表3。ASIC3 在HSPN患兒腎小管上的表達(dá)定量與24 h尿蛋白定量呈正相關(guān)(r=0.644，P=0.017),見圖2。

表2　ASICs 在αl-MG異常和正常組

注：與正常組比較:*P<0. 05，**P<0.01。

表3　ASICs 在β2-MG異常和正常組

注：與正常組比較:*P<0.01。

圖2　HSPN患兒24 h尿蛋白定量與腎小管中

3討論

HSP是一種由IgA免疫復(fù)合物沉積引起的小血管炎，可以累及皮膚、關(guān)節(jié)、胃腸道，腎臟損害尤為常見，而且其嚴(yán)重程度直接影響本病的預(yù)后。在HSP急性期，機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)增加，最終可以導(dǎo)致機(jī)體局部炎癥反應(yīng)。酸堿平衡是最重要的生理功能之一，幾乎各種疾病如炎癥、缺血等的過程都會引起不同程度的pH值變化，而離子通道可能影響組織的病理生理的改變[7]。胞外pH值的下降能激活一種在體內(nèi)廣泛分布的特殊的配體門控通道，即酸敏感離子通道(ASICs)[8]。當(dāng)胞外pH 降低至6.5 左右，ASICs 通道被大量激活，離子的通透性增加，如Ca2+等陽離子，從而對組織細(xì)胞造成損傷[9]。本研究發(fā)現(xiàn)HSPN 組腎小管組ASIC1a、ASIC2a、ASIC3 表達(dá)明顯高于單純腎病綜合征患兒組，提示ASICs可能參與HSPN 發(fā)病中的腎小管損傷的炎癥反應(yīng)過程。

HSP的發(fā)病率為每年10/10萬， 90%的病例發(fā)生于兒童，平均發(fā)病年齡為6歲，其中30%～60%的患者可能會累及腎臟，導(dǎo)致紫癜性腎炎[10-11]。HSPN是兒科常見的繼發(fā)性腎小球疾病之一，其臨床表現(xiàn)不一，輕者僅表現(xiàn)為鏡下血尿、微量蛋白尿，重者可逐漸進(jìn)展為腎功能不全，最終可能需長期腎臟替代治療，預(yù)后欠佳，嚴(yán)重影響患兒生存質(zhì)量[12]。目前有研究發(fā)現(xiàn)在過敏性紫癜患者中，皮膚小血管高表達(dá) ASIC1a 和 ASIC3，用患兒血清刺激可使 HUVECs、ASIC1a 及 ASIC3 表達(dá)增高， ASICs 可能參與了過敏性紫癜皮膚血管的損傷過程，甲潑尼龍可通過抑制體內(nèi)ASICs的高表達(dá)而緩解皮膚血管損傷[9]。另一方面，在HSP 急性期，患兒血清中的性細(xì)胞因子如 IL-8、TNF-α、NO等和某些免疫球蛋白的水平均升高[13]，這些炎性反應(yīng)因子在激活免疫補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)的同時，直接或間接刺激和上調(diào)體內(nèi)ASICs的表達(dá)，加劇體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，對血管的內(nèi)皮細(xì)胞造成損傷[14-16]，從而加重紫癜性腎炎的腎損害，因此，在HSP患者的炎癥反應(yīng)中，ASICs 可能是一條重要通路。因此，我們認(rèn)為積極探討ASICs 參與的炎癥反應(yīng)在HSPN患兒腎小管損傷發(fā)生、發(fā)展中的作用，從而進(jìn)一步尋找作用于ASICs靶點(diǎn)的藥物來治療HSPN，有較高的臨床應(yīng)用價值。

腎小管遠(yuǎn)曲小管的功能是繼續(xù)吸收水和鈉離子，并向管腔內(nèi)分泌H+、K+，這對維持血液的酸堿平衡有重要作用。在炎癥導(dǎo)致腎小管損傷后，無氧酵解增加，引起腎小管細(xì)胞內(nèi)的 pH下降，形成明顯的酸中毒，它激活局部缺血部位ASIC1a 電流，并增強(qiáng)ASIC1a 通道的毒性作用，加重腎小管損傷。本研究發(fā)現(xiàn)ASICs在紫癜性腎炎腎小管上高表達(dá)，提示酸敏感離子通道可能參與HSPN 發(fā)病中的腎小管損傷過程。α1-MG的分子量約為27～33 kd，約 99% 被 近 端 腎 小 管 攝 取，在尿中含量極微(<12 mg·L-1) 。當(dāng)腎小管功能受損時，α1-MG 就部分或全部不能被腎小管攝取，尿液中的α1-MG含量升高[17]。β2-MG屬于小分子蛋白質(zhì)，可以自由的通過腎小球但在近端小管幾乎全部被重吸收，但當(dāng)腎小管功能受到損害時對β2-MG重吸收減少，導(dǎo)致尿中蛋白含量增高，是反映腎小管重吸收功能的指標(biāo)[18]。國內(nèi)報道[19]發(fā)現(xiàn)當(dāng)近端腎小管處于高蛋白質(zhì)的環(huán)境中，可合成和釋放一種劑量依賴性內(nèi)皮素，降低腎小管毛細(xì)血管血流量，導(dǎo)致腎小管損害，故蛋白尿排出越多可能導(dǎo)致腎小管損害越重，所以尿α1-MG和β2-MG都是反映腎小管功能特異而敏感的指標(biāo)，具有早期發(fā)現(xiàn)腎小管損害的價值。本研究發(fā)現(xiàn)ASIC3 在HSPN患兒腎小管上的表達(dá)定量與24 h尿蛋白定量呈正相關(guān)，ASIC3 在α1-MG異常組和β2-MG異常組中的表達(dá)較正常組顯著增多，ASIC2a在α1-MG異常組中的表達(dá)較正常組增多，說明ASICs 在HSPN患兒蛋白尿，尤其是微量蛋白尿的產(chǎn)生可能存在一定關(guān)系，進(jìn)一步說明ASICs可能參與HSPN 發(fā)病中的腎小管損傷過程。

目前雖然人們對于ASICs通道特性的研究認(rèn)識尚淺，但其表達(dá)與作用已在越來越多的領(lǐng)域取得一定成績。ASICs的高表達(dá)可能與HSPN患兒腎組織在炎癥、缺血環(huán)境中酸代謝有關(guān)，推測ASICs 可能參與了紫癜性腎炎腎小管的損傷過程，ASICs 與HSPN患兒蛋白尿，尤其是微量蛋白尿的產(chǎn)生可能存在一定關(guān)系。國外研究發(fā)現(xiàn)積極地控制蛋白尿是阻止HSPN腎臟病理進(jìn)展的重要措施之一[20]，因此阻斷ASICs可能抑制HSPN腎組織損害。

參考文獻(xiàn)：

[1]Stockand JD,Staruschenko A,Pochynyuk O,et al.Insight toward epithelial Na+channel mechanism revealed by the acid-sensing ion channel 1 structure[J].IUBMB Life,2008,60(9):620-628.

[2]Sherwood TW,Frey EN,Askwith CC.Structure and activity of the acid-sensing ion channels[J].Am J Physiol Cell Physiol,2012,303(7):C699-C710.

[3]Sluka KA,Winter OC,Wemmie JA.Acid-sensing ion channels:A new target for pain and CNS diseases[J].Curr Opin Drug Discov Devel,2009,12(5):693-704.

[4]Xiong ZG,Pignataro G,Li M,et al.Acid-sensing ion channels (ASICs) as pharmacological targets for neurodegenerative diseases[J].Curr Opin Pharmacol,2008,8(1):25-32.

[5]Davin JC,Coppo R.Henoch-Schonlein purpura nephritis in children[J].Nat Rev Nephrol,2014,10(10):563-573.

[6]Osmakov DI,Andreev YA,Kozlov SA.Acid-sensing ion channels and their modulators[J].Biochemistry (Mosc),2014,79(13):1528-1545.

[7]Yuan LP,Bo Y,Ming G,et al.Expression of acid-sensing ion channels of gastric mucosa from patients with Henoch-Schonlein purpura[J].J Pediatr Gastroenterol Nutr,2012,54(4):561-563.

[8]Yu Y,Chen Z,Li WG,et al.A nonproton ligand sensor in the acid-sensing ion channel[J].Neuron,2010,68(1):61-72.

[9]費(fèi)文君,袁麗萍,吳琳,等.酸敏感離子通道在過敏性紫癜血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2012,47(2):189-193.

[10] Chen JY,Mao JH.Henoch-Schonlein purpura nephritis in children:incidence,pathogenesis and management[J].World J Pediatr,2015,11(1):29-34.

[11] Huang YJ,Yang XQ,Zhai WS,et al.Clinicopathological features and prognosis of membranoproliferative-like Henoch-Schonlein purpura nephritis in children[J].World J Pediatr,2015,11(4):338-345.

[12] Davin JC,Coppo R.Henoch-Schonlein purpura nephritis in children[J].Nat Rev Nephrol,2014,10(10):563-573.

[13] 白慶峰,潘凱麗,黃瑩,等.過敏性紫癜患兒血清白介素6、白介素8及腫瘤壞死因子α水平和免疫球蛋白的變化[J].中國小兒血液與腫瘤雜志,2008,13(2):2476-2478.

[14] Cadiou H,Studer M,Jones NG,et al.Modulation of acid-sensing ion channel activity by nitric oxide[J].J Neurosci,2007,27(48):13251-13260.

[15] Allen NJ,Attwell D.Modulation of ASIC channels in rat cerebellar Purkinje neurons by ischaemia-related signals[J].J Physiol,2002,543(Pt 2):521-529.

[16] Cheranov SY,Jaggar JH.TNF-alpha dilates cerebral arteries via NAD(P)H oxidase-dependent Ca2+spark activation[J].Am J Physiol Cell Physiol,2006,290(4):C964-C971.

[17] 任振喚,周穎.尿液腎功能指標(biāo)檢測在兒童紫癜性腎炎中的臨床意義[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2011,21(10):2476-2478.

[18] Shin JR,Kim SM,Yoo JS,et al.Urinary excretion of beta2-microglobulin as a prognostic marker in immunoglobulin A nephropathy[J].Korean J Intern Med,2014,29(3):334-340.

[19] 張建江,易著文,何小解,等.紫癜性腎炎患兒腎間質(zhì)血管損害與臨床的關(guān)系[J].實(shí)用兒科臨床雜志,2006,21(8):487-489.

[20] Kawasaki Y.The pathogenesis and treatment of pediatric Henoch-Schonlein purpura nephritis[J].Clin Exp Nephrol,2011,15(5):648-657.

The expression and role of acid-sensing ion channels in renal tissues from patients with Henoch-Sch?nlein purpura nephritis

ZHANG Hai-tao, YUAN Li-ping, PENG Qi-di, et al

(DepartmentofPediatrics，TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity，Hefei,Anhui230022,China)

Abstract:Objective To observe the expression of acid-sensing ion channels (ASICs) in renal tissues from patients with Henoch-Sch?nlein purpura nephritis (HSPN) and to explore the action and mechanism of ASICs in the inflammatory injury of renal tissues.Methods Immunohistochemical methods were used to investigate the expression and localization of ASICs in renal tissue from patients with HSPN and patients with dropsical nephritis. The expressions of ASICs were semiquantitatively assessed by the percentage of positive area of ASIC1a, ASIC2a, and ASIC3. The correlation between expression of ASICs and quantity of 24-hour urinary protein was analyzed. According to different expressions of α1-MG and β2-MG in the test of urine trace protein, patients with HSPN were divided into two groups. The expressions of ASICs in renal tubules of those two groups were assessed respectively.Results Immunohistochemical analysis revealed that higher expression of ASIC1a, ASIC2a and ASIC3 was noted in renal tubules from patients with HSPN. The expression of ASIC3 in patients with HSPN was positively correlated with quantity of 24-hour urinary protein. Compared with the group with normal expressions of α1-MG and β2-MG, the expression of ASIC3 was significantly increased in the group with abnormal expressions of α1-MG and β2-MG (P<0.01) and higher expression of ASIC2a was noted in the group with abnormal expressions of α1-MG (P<0.01).Conclusions This study suggested an excitive role of ASICs in the pathogenesis of the injury of renal tubules in patients with HSPN. The expression of ASICs may be related to the production of proteinuria, especially microalbuminuria.

Key words:henoch-Sch?nlein purpura nephritis;acid-sensing ion channel; microalbuminuria;renal tubules

(收稿日期：2015-11-04，修回日期：2016-02-10)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.04.026

通信作者：胡波，男,主任醫(yī)師,碩士生導(dǎo)師，研究方向：小兒腎臟和風(fēng)濕性疾病,E-mail：hubo3218@sohu.com

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No 81471617)