周志勇，黃鶴飛，張　燁

(1.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系;2.三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院藥劑科，湖北 宜昌　443003)

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◇藥物分析◇

纈沙坦氨氯地平片有關(guān)物質(zhì)研究

周志勇1，黃鶴飛2，張燁2

(1.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系;2.三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院藥劑科，湖北 宜昌443003)

摘要：目的建立纈沙坦氨氯地平片有關(guān)物質(zhì)含量的測定方法。方法采用高效液相色譜法，Agilent1220高效液相，(Eclipse plus，250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以磷酸鹽緩沖液(取三乙胺10 mL加水至1 000 mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.8)為流動相A，以甲醇—乙腈(70∶30)為流動相B，進行線性梯度洗脫，流速為1.0 mL·min(-1)，檢測波長為237 nm。結(jié)果氨氯地平與雜質(zhì)D分離度為14.44，纈沙坦與雜質(zhì)B的分離度為9.46，且各物質(zhì)之間有較好的分離；空白輔料對有關(guān)物質(zhì)測定無干擾，專屬性良好；強制降解試驗中，雜質(zhì)可與主峰完全分離。結(jié)論該方法結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可靠性強，可用于測定纈沙坦氨氯地平片中的有關(guān)物質(zhì)。

關(guān)鍵詞：纈沙坦氨氯地平；有關(guān)物質(zhì)；高效液相色譜

纈沙坦氨氯地平片是由諾華公司研發(fā)，并于2006年12月獲得美國FDA批準(zhǔn)用于治療原發(fā)性高血壓，用于單藥治療不能充分控制血壓的患者。由于該藥療效確切，國內(nèi)開展了大量的該復(fù)方制劑仿制藥的研發(fā)工作[1-3]，而有關(guān)物質(zhì)的完整研究資料是申報該復(fù)方制劑的重要組成部分，建立有關(guān)物質(zhì)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以控制有關(guān)物質(zhì)含量。參照纈沙坦氨氯地平片進口標(biāo)準(zhǔn)“有關(guān)物質(zhì)”項下檢測的雜質(zhì)及購得的雜質(zhì)對照品，將纈沙坦雜質(zhì)B(結(jié)構(gòu)式見圖1)和氨氯地平雜質(zhì)D(結(jié)構(gòu)式見圖2)列入標(biāo)準(zhǔn)考察。本試驗采用高效液相色譜法梯度洗脫方式，建立了快速、準(zhǔn)確、分離度高的含量測定方法，從而為完善纈沙坦氨氯地平片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了依據(jù)。

圖1　纈沙坦雜質(zhì)B結(jié)構(gòu)示意圖

圖2　氨氯地平雜質(zhì)D結(jié)構(gòu)示意圖

1儀器與試藥

Agilent1220液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；FA2004N電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；KQ-500DE超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)；苯磺酸氨氯地平(中國藥品生物制品檢定所，批號：100374-200903)；纈沙坦(中國藥品生物制品檢定所，批號：100651-200902)；氨氯地平雜質(zhì)D(Kony Pharma，批號：20090901)；纈沙坦異構(gòu)體(Kony Pharma，批號：20080801)；乙腈為色譜純; 水為二次去離子水；其余試劑為分析純。

2方法與結(jié)果[4-10]

2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗采用Agilent,Eclipse plus色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以磷酸鹽緩沖液(取三乙胺10 mL加水至1 000 mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.8)為流動相A，以甲醇—乙腈(70∶30)為流動相B；檢測波長為237 nm；柱溫為30℃；進樣量10 μL；流速為1.0 mL·min-1，按表1進行線性梯度洗脫。

表1　線性梯度洗脫

精密量取氨氯地平雜質(zhì)D對照品溶液和纈沙坦雜質(zhì)B對照品溶液各1 mL置10 mL量瓶中，加纈沙坦氨氯地平對照品溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液。精密量取系統(tǒng)適應(yīng)性溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，氨氯地平及雜質(zhì)D和纈沙坦及雜質(zhì)B的理論塔板數(shù)均大于10 000，氨氯地平與雜質(zhì)D的分離度及纈沙坦與雜質(zhì)B的分離度均>1.5。

2.2溶液的制備

2.2.1供試品溶液取本品10片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量(約相當(dāng)于纈沙坦80 mg，氨氯地平5 mg)，置50 mL量瓶中，加流動相A—流動相B(1∶1)適量，超聲使溶解，放冷，加流動相A—流動相B(1∶1)稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

表2　有關(guān)物質(zhì)系統(tǒng)適用性試驗結(jié)果

注：分離度1為氨氯地平與雜質(zhì)D的分離度，分離度2為纈沙坦與雜質(zhì)B的分離度。

2.2.2對照溶液精密量取供試品溶液1 mL置100 mL量瓶中，加流動相A-流動相B(1∶1)稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。

2.2.3氨氯地平雜質(zhì)D對照品溶液取氨氯地平雜質(zhì)D對照品適量，精密稱定，加流動相A-流動相B(1∶1)溶解并稀釋制成每1 mL中含有氨氯地平雜質(zhì)D 0.8 mg的對照品溶液。

2.2.4纈沙坦雜質(zhì)B對照品溶液取纈沙坦雜質(zhì)B對照品適量，精密稱定，加流動相A-流動相B(1∶1)溶解并稀釋制成每1 mL中含有纈沙坦雜質(zhì)B 0.8 mg的對照品溶液。

2.3雜質(zhì)歸屬

2.3.1氨氯地平雜質(zhì)D對照品溶液取氨氯地平雜質(zhì)D對照品適量，精密稱定，加流動相A—流動相B(1∶1)溶解并稀釋制成每1 mL中含有氨氯地平雜質(zhì)D 0.8 mg的對照品溶液。

2.3.2纈沙坦雜質(zhì)B對照品溶液取纈沙坦雜質(zhì)B對照品適量，精密稱定，加流動相A—流動相B(1∶1)溶解并稀釋制成每1 mL中含有纈沙坦雜質(zhì)B 0.8 mg的對照品溶液。

2.3.3苯磺酸溶液精密量取液體苯磺酸1 mL，加流動相A—流動相B(1∶1)溶解并稀釋至100 mL。

2.3.4氨氯地平原料溶液精密稱取苯磺酸氨氯地平原料14 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇5 mL使溶解，加流動相A—流動相B(1∶1)稀釋至刻度，搖勻，作為氨氯地平原料溶液。

2.3.5纈沙坦原料溶液精密稱取纈沙坦原料16 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇5 mL使溶解，加流動相A—流動相B(1∶1)稀釋至刻度，搖勻，作為纈沙坦原料溶液。分別精密量取上述溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見表3。苯磺酸的保留時間為2.092 min，氨氯地平雜質(zhì)D保留時間為7.231 min，纈沙坦雜質(zhì)B保留時間為13.937 min，未知雜質(zhì)分別為8.876、9.097、14.817 min。

表3　雜質(zhì)歸屬結(jié)果

注：“—”為未檢出。

2.4系統(tǒng)適用性試驗

2.4.1纈沙坦氨氯地平對照品溶液精密稱取苯磺酸氨氯地平對照品14 mg和纈沙坦對照品16 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇5 mL使溶解，加流動相A—流動相B(1∶1)稀釋至刻度，搖勻，作為纈沙坦氨氯地平對照品溶液。

2.4.2系統(tǒng)適用性溶液精密量取氨氯地平雜質(zhì)D對照品溶液和纈沙坦雜質(zhì)B對照品溶液各1 mL置10 mL量瓶中，加纈沙坦氨氯地平對照品溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液。精密量取系統(tǒng)適應(yīng)性溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見表4。

2.5雜質(zhì)相對保留時間及校正因子因有關(guān)物質(zhì)測定為梯度洗脫，流動相相對固定，未考察不同流動相比例下各雜質(zhì)的對保留時間，重點考察兩個廠家的色譜柱測定雜質(zhì)的保留時間，并計算校正因子。

色譜柱1：Lichrospher C18(150 mm×64.6 mm,5 μm)；色譜柱2：Agilent C18(150 mm×64.6 mm, 5 μm)。

精密量取系統(tǒng)適用性溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見表5。

表4　有關(guān)物質(zhì)系統(tǒng)適用性試驗結(jié)果

注：分離度1為氨氯地平與雜質(zhì)D的分離度，分離度2為纈沙坦與雜質(zhì)B的分離度。

表5　雜質(zhì)保留時間考察試驗結(jié)果

注：RRT(雜質(zhì)相對保留時間)均為相對于氨氯地平峰的保留時間。

由上述試驗結(jié)果可知，雜質(zhì)D相對于氨氯地平的保留時間為0.570～0.647 min，平均值為0.61 min，雜質(zhì)B相對于氨氯地平的保留時間為1.233～1.325 min，平均值為1.28 min，因此擬定雜質(zhì)D相對于氨氯地平的保留時間為0.61 min，雜質(zhì)B相對于氨氯地平的保留時間為1.28 min。

試驗測得雜質(zhì)D的校正因子為2.03，雜質(zhì)B的校正因子為1.01～1.02，參考纈沙坦氨氯地平片進口標(biāo)準(zhǔn)，確定雜質(zhì)D的校正因子為2.0，雜質(zhì)B及其他雜質(zhì)的校正因子為1.0。

2.6空白輔料干擾試驗取空白輔料樣品0.083 0 g，置50 mL量瓶中，加流動相A—流動相B(1∶1)溶解并稀釋至刻度，作為空白輔料溶液，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果可知，空白輔料溶液不出峰，不干擾本品有關(guān)物質(zhì)的測定。

2.7耐用性試驗為了考察色譜條件微小的變動能否通過設(shè)計的系統(tǒng)適用性試驗，確保方法的有效性，故采用改變下列條件考察本方法的耐用性。結(jié)果見表6，7。

原色譜條件：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，Licrospher C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：以磷酸鹽緩沖液(取三乙胺10 mL加水至1 000 mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.8)為流動相A，以甲醇—乙腈(70∶30)為流動相B，進行梯度洗脫；檢測波長：237 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。

表6　氨氯地平耐用性試驗結(jié)果

表7　纈沙坦耐用性試驗結(jié)果

結(jié)論：流動相pH、流速及柱溫的變化對氨氯地平和纈沙坦的有關(guān)物質(zhì)檢查無影響，雜質(zhì)峰的數(shù)量沒有增加。表明本方法系統(tǒng)耐用性良好，故確定色譜條件為：流動相A∶磷酸鹽緩沖液(取三乙胺10 mL加水至1 000 mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.8)，流動相B：甲醇—乙腈(70∶30)，梯度洗脫，流速為1.0 mL·min-1；柱溫30℃。

2.8檢測限取本品供試品溶液，稀釋進樣至信噪比為3∶1，作為檢測限，氨氯地平檢測限為0.695ng，纈沙坦檢測限為0.775 ng，能滿足有關(guān)物質(zhì)檢查的要求。

2.9溶液放置穩(wěn)定性試驗取供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12 h，精密量取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖,結(jié)果顯示供試品溶液中氨氯地平和纈沙坦在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定，RSD=1.36%。

2.10強制降解試驗

2.10.1未破壞取本品細(xì)粉適量(約相當(dāng)于纈沙坦80 mg，氨氯地平5 mg)，置50 mL帶刻度的具塞試管中，加入流動相A—流動相B(1∶1)適量，超聲15 min，放冷，加流動相A—流動相B(1∶1)稀釋至50 mL，濾過，取續(xù)濾液作為破壞前溶液。

2.10.2酸破壞試驗取本品細(xì)粉適量(約相當(dāng)于纈沙坦80 mg，氨氯地平5 mg)，置50 mL帶刻度的具塞試管中，加1 mol·L-1鹽酸溶液3 mL，置80℃水浴中加熱約30 min，放冷至室溫，用1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)至中性，加流動相A—流動相B(1∶1)稀釋至50 mL，濾過，取續(xù)濾液作為酸破壞溶液。

2.10.3堿破壞試驗操作步驟同酸破壞試驗，僅將鹽酸換位氫氧化鈉，得堿破壞溶液。

2.10.4氧化破壞試驗取本品細(xì)粉適量(約相當(dāng)于纈沙坦80 mg，氨氯地平5 mg)，置50 mL帶刻度的具塞試管中，加30%的雙氧水溶液5 mL，靜置2 h，加流動相A—流動相B(1∶1)稀釋至50 mL，濾過，取續(xù)濾液作為氧化破壞溶液。

2.10.5高溫破壞試驗取本品細(xì)粉適量(約相當(dāng)于纈沙坦80 mg，氨氯地平5 mg)，置50 mL帶刻度的具塞試管中，加流動相A—流動相B(1∶1)5 mL，置100℃水浴中加熱約2 h，放冷至室溫，加流動相A—流動相B(1∶1)稀釋至50 mL，濾過，取續(xù)濾液作為高溫破壞溶液。

2.10.6光照破壞試驗取本品細(xì)粉適量(約相當(dāng)于纈沙坦80 mg，氨氯地平5 mg)，置50 mL帶刻度的具塞試管中，置照度為(4 500±500)Lx的光照箱中48 h，加入流動相A—流動相B(1∶1)適量，超聲15 min，放冷，加流動相A—流動相B(1∶1)稀釋至50 mL，濾過，取續(xù)濾液作為光照破壞溶液。

另取空白輔料、纈沙坦和氨氯地平的混合原料(按處方比例混合)、被仿制品細(xì)粉，同法操作。分別精密量取上述溶液各10 μL，注入液相色譜儀。

圖3　強制降解試驗色譜圖

圖3可見本品在酸、堿、高溫、氧化、光照條件下均不穩(wěn)定，原料帶入雜質(zhì)B，酸破壞降解產(chǎn)物主要有雜質(zhì)D和相對氨氯地平峰保留時間約為0.24的未知雜質(zhì)，堿破壞降解產(chǎn)物主要有雜質(zhì)B、D和相對氨氯地平峰保留時間在0.35～0.42 min之間的未知雜質(zhì)，氧化破壞降解產(chǎn)物主要有雜質(zhì)D，高溫破壞降解產(chǎn)物主要有雜質(zhì)B、D和相對氨氯地平峰保留時間約為0.24 min的未知雜質(zhì)，光照破壞降解產(chǎn)物主要有雜質(zhì)B、D和一些未知雜質(zhì)。自制樣品降解產(chǎn)物個數(shù)和變化趨勢與上市樣品基本一致。

3討論

《英國藥典》(2009年版)中纈沙坦氨氯地平片有關(guān)物質(zhì)中，纈沙坦與氨氯地平分別記錄了4種有關(guān)物質(zhì)，查閱相關(guān)文獻[11-13]，均將氨氯地平雜質(zhì)D和纈沙坦雜質(zhì)B列入考察標(biāo)準(zhǔn)中。

本試驗分別從系統(tǒng)適應(yīng)性、專屬性以及強制降解試驗方面分別考察了HPLC測定纈沙坦氨氯地平片有關(guān)物質(zhì)的方法，結(jié)果顯示的目標(biāo)色譜峰與有關(guān)物質(zhì)分離效果良好，本HPLC法測定有關(guān)物質(zhì)方法簡便、快捷、可靠，可用于纈沙坦氨氯地平復(fù)方片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)物質(zhì)的檢測。

參考文獻：

[1]呂晴,郝玲花,李東輝,等.高效液相色譜法測定纈沙坦氫氯噻嗪片有關(guān)物質(zhì)[J].中國新藥雜志,2014,23(15):1754-1757.

[2]魏春燕,沈利,王延松.HPLC法測定復(fù)方氨氯地平纈沙坦片有關(guān)物質(zhì)[J].中國藥師,2011,14(8):1142-1144.

[3]王燕,毛白楊,狄斌,等. LC-MS/MS法分析復(fù)方纈沙坦氨氯地平片中的有關(guān)物質(zhì)[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2013,36(5):611-617.

[4]國家藥典委員會.中國藥典(二部)[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2010:1136-1137.

[5]張少樺,王錦剛,蔣海松.HPLC 法檢查左乙拉西坦緩釋片的有關(guān)物質(zhì)[J].中國藥房,2014,25(13):1212-1215.

[6]鄧紫薇,盧欣,李美珍,等.復(fù)方氫氯噻嗪片劑的質(zhì)量控制[J].天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2012,18(4):514-517.

[7]荊小燕,王勇軍,徐麗潔,等.高效液相色譜法測定纈沙坦氨氯地平片中的有關(guān)物質(zhì)[J].中國新藥,2013,22(19):2323-2327.

[8]劉憲勇,劉世軍,孫克明,等. HPLC法測定奧拉西坦原料藥中的有關(guān)物質(zhì)[J].中國藥房,2014,25(1):66-68.

[9]彭熙琳,吳品江,周唯蘭,等.應(yīng)用高效液相色譜法測定纈沙坦氨氯地平片有關(guān)物質(zhì)[J].重慶醫(yī)學(xué),2014,43(17):2571-2577.

[10] 付長華,楊琴香,蔡華吉.HPlC法測定苯磺酸左旋氨氯地平片的含量及有關(guān)物質(zhì)[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2013,25(6):58-60.

[11] 張翠蘭.高效液相色譜法測定那格列奈膠囊的有關(guān)物質(zhì)[J].安徽醫(yī)藥，2015，19(12):2310-2313.

[12] 唐杰,邱幸琛.苯磺酸氨氯地平片有關(guān)物質(zhì)測定[J].海峽藥學(xué),2012,24(10):96-98.

[13] 張輝,丁雙婷.HPLC梯度洗脫法檢查纈沙坦氫氯噻嗪分散片的有關(guān)物質(zhì)[J].食品與藥品,2012,14(9):343-345.

Research on related substance of valsartan Amlodipine

ZHOU Zhi-yong1，HUANG He-fei2，ZHANG Ye2

(1.CollegeofMedicalScience,ChinaThreeGorgesUniversity; 2.DepartmentofPharmacy,SecondCollegeofClinicalMedicalScience,ChinaThreeGorgesUniversity,Yichang,Hubei443003,China)

Abstract:Objective Aimed to establish an analytical method for related substances of valsartan Amlodipine tablets. Methods The sample was determined by HPLC (Agilent1220). The analysis was performed on Eclipse plus C(18 )column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) with the detection wavelength at 237 nm. Using phosphate buffer (10 ml triethylamine volumetric to 1 000 mL,adjusted to pH 2.8 with phosphoric acid) as mobile phase A, methanol - acetonitrile (70∶30) as mobile phase B, and linear gradient, mobile phase was initiated at a flow rate of 1.0 mL·min(-1).Results The resolution of amlodipine and impuritie D was 14.44;the resolution of amlodipine and impuritie B was 9.46, and there was good resolution between each substance. Conclusions This method is accurate, reproducible and reliable, which can be used to determine the related substances of valsartan Amlodipine tablets.

Key words:valsartan amlodipine;related substance;HPLC

(收稿日期：2015-10-20，修回日期：2016-02-26)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.04.010