何麗娟，張軍東，安毛毛，姜遠(yuǎn)英

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復(fù)方腸泰制劑對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸黏膜屏障的保護(hù)作用

何麗娟，張軍東，安毛毛，姜遠(yuǎn)英

[摘要]目的觀察復(fù)方腸泰制劑在小鼠潰瘍性結(jié)腸炎中對(duì)腸黏膜屏障的保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)制。方法建立葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)小鼠實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎模型，實(shí)驗(yàn)分為空白組、模型組、不同劑量治療組(4.3 g/kg與17.1 g/kg)、美沙拉嗪對(duì)照組和硫唑嘌呤對(duì)照組。造模7 d內(nèi)，觀察記錄各組小鼠體質(zhì)量和疾病活動(dòng)指數(shù)變化；采用透射電鏡觀察各組小鼠結(jié)腸的超微結(jié)構(gòu)；HE染色觀察各組小鼠炎癥； ELISA法測定各組小鼠結(jié)腸組織TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-10；蛋白質(zhì)印跡方法檢測各組小鼠結(jié)腸組織中ZO-1、Occludin和Claudin-1蛋白的表達(dá)。結(jié)果模型組小鼠體質(zhì)量、DAI和結(jié)腸長度與空白對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；結(jié)腸組織中TNF-α、IL-6和IFN-γ水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；組織病理顯示炎性細(xì)胞明顯浸潤，ZO-1、Occludin和Claudin-1蛋白的表達(dá)顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高劑量復(fù)方腸泰組與空白對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論高劑量復(fù)方腸泰制劑對(duì)小鼠腸黏膜屏障功能具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與腸上皮緊密連接蛋白表達(dá)升高以及腸道免疫功能調(diào)節(jié)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]潰瘍性結(jié)腸炎；緊密連接蛋白；腸屏障功能

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種自身免疫性疾病，病因不明，發(fā)病機(jī)制至今也沒有確定，一般認(rèn)為是環(huán)境因素、基因和免疫因素三者相互作用的結(jié)果[1]。在臨床上，這種疾病發(fā)病率逐年增高，治療難度較大，且反復(fù)發(fā)作，較難有效控制。國內(nèi)外近期研究普遍認(rèn)為其發(fā)作與腸道屏障功能密切相關(guān)[2]，本研究采用更接近人類UC病理及免疫特點(diǎn)的葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)誘導(dǎo)C57小鼠建立實(shí)驗(yàn)性UC模型，探討UC發(fā)病的可能機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)6～8級(jí)雌性C57BL/6小鼠共60只，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。采用數(shù)字表法隨機(jī)分為空白對(duì)照組(Control)、模型組(Model)、低劑量腸泰組(4.3 g/kg，LCT)、高劑量腸泰組(17.1 g/kg，HCT)、美沙拉嗪對(duì)照組(Mesalazine)和硫唑嘌呤對(duì)照組(Azathioprine)共6組。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于上海同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院清潔級(jí)動(dòng)物房。

1.1.2藥物及復(fù)方腸泰制備黃柏(CortexPhellodendri)50 g，地榆(radixsanguisorbae)、地錦草(EuphorbiahumifusaWilld.)和辣蓼(PolygonumflaccidumMeissn.)各37.5 g(購自上海同仁堂藥店)。藥物制備方法：取黃柏粗粉，加7倍量的70%乙醇，提取2次，每次2 h，濾過，合并濾液，回收乙醇，備用。藥渣與其余3味，加15倍的水煎煮2次，每次1.5 h，合并濾液，濃縮至相對(duì)密度為1.00～1.05，與黃柏濃縮液合并，繼續(xù)濃縮，最終得到的濃縮液分裝后凍存于-80 ℃冰箱備用。

1.1.3實(shí)驗(yàn)試劑DSS(MP公司)、莎爾福美沙拉嗪腸溶片(Dr. Falk Pharma GmbH公司)、硫唑嘌呤片(上海信誼藥廠有限公司)、羧甲基纖維素鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、甲醛(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、水合氯醛(美侖生物)、RIPA裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所)、ELISA試劑盒(eBioscience公司)、Western blot 抗體抗(Cell Signaling Technology公司)、二抗(北京鼎國生物技術(shù)公司)。

1.1.4主要儀器旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)、電子天平(梅特勒-托利多公司)、酶標(biāo)儀(Thermo scientific公司)、Haier立式超低溫保存箱(青島海爾特種電器有限公司)、冷凍高速離心機(jī)與轉(zhuǎn)膜儀(Bio-rad公司)、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(GE公司)、透射電鏡(日立H-800公司)。

1.2方法

1.2.1模型的建立和評(píng)價(jià)60只C57BL/6小鼠分完組后進(jìn)入清潔級(jí)動(dòng)物房，正常飼養(yǎng)3 d后造模，除空白對(duì)照組自由飲用滅菌水外，其余各組均自由飲用配置完畢的1.5% DSS水溶液共7 d。每天在固定時(shí)間段對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃等藥物干預(yù)(各組給藥劑量為：美沙拉嗪500 mg/kg，硫唑嘌呤2 mg/kg，低劑量復(fù)方腸泰4.3 g/kg，高劑量復(fù)方腸泰17.1 g/kg，模型組和空白組以生理鹽水代替)，藥物均以0.5%羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethylcellulose，CMC)溶液助溶，同時(shí)每天按時(shí)稱質(zhì)量記錄，仔細(xì)觀察各組小鼠活動(dòng)形態(tài)。每天換一次墊料，觀察糞便形態(tài)并測隱血評(píng)分。7 d后取材，每組取1只留作透射電鏡用，剩余所有小鼠麻醉后取出結(jié)腸段，迅速量取長度并選取各組代表性的結(jié)腸段作直觀對(duì)照?qǐng)D。每組各3只小鼠的整段結(jié)腸凍存于-80 ℃冰箱留作檢測細(xì)胞因子；剩余3只留作檢測蛋白使用，剪取一段結(jié)腸組織后均用PBS緩沖液沖洗后凍存于-80 ℃冰箱。

1.2.2小鼠結(jié)腸組織HE染色檢測各組炎癥細(xì)胞水平差異在距離小鼠肛門1 cm處剪取一段長約2 cm的結(jié)腸組織，縱向剖開，并用預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗腸道內(nèi)容物、組織液及血液，將洗凈后的結(jié)腸組織浸入4%多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋，切片后進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色，脫水透明后樹膠封固，光鏡下觀察。

1.2.3透射電鏡(TEM)觀察各組結(jié)腸組織緊密連接每組各1只小鼠進(jìn)行麻醉，從麻醉后的小鼠體內(nèi)取出一小段結(jié)腸末端組織，用4 ℃預(yù)冷的PBS沖洗內(nèi)容物和組織液，迅速使用預(yù)冷的手術(shù)刀片取下一小片所需的組織，立即放入4 ℃存放的2.5%戊二醛固定液中固定2 h后漂洗，并用1%鋨酸后固定，乙醇梯度脫水并樹脂包埋，過夜固化，切片后枸櫞酸鉛染色，水洗干燥后電鏡觀察。

1.2.4Western blot檢測ZO-1，Occludin，Claudin-1蛋白的表達(dá)從-80 ℃取出不同組別間各3只小鼠的一段結(jié)腸組織置于研缽中，液氮處理后使用研磨棒將其徹底碾成粉末，將這些粉末混勻后收集到EP管中，加入適量RIPA裂解液，混勻后置于4 ℃高速震蕩20 min后，轉(zhuǎn)入高速冷凍離心機(jī)中4 ℃離心10 min后取上清，95 ℃蛋白變性10 min后分裝，存入-80 ℃冰箱備用。將制備好的蛋白液體進(jìn)行SDS-PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)將蛋白從凝膠上轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉，一抗孵育過夜，PBST沖洗后二抗孵育，最后在化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)下進(jìn)行顯影。

1.2.5ELISA檢測小鼠結(jié)腸組織中細(xì)胞因子水平截取小鼠整段結(jié)腸，置于勻漿器中研磨成漿液，4 ℃離心后取上清，分裝后放入-80 ℃?zhèn)溆谩Ｊ褂孟鄳?yīng)的ELISA試劑盒按照規(guī)定檢測TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-10這4個(gè)細(xì)胞因子水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用GraphPad Prism 5.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，2組數(shù)據(jù)間的比較用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1復(fù)方腸泰制劑抑制小鼠實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎生成小鼠經(jīng)DSS造模后出現(xiàn)體質(zhì)量明顯下降、少動(dòng)、便血等癥狀，造模完成后，模型組小鼠結(jié)腸明顯縮短并且整體充血紅腫。和空白對(duì)照組相比，HCT組小鼠的結(jié)腸長度和體質(zhì)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。該結(jié)果提示高劑量復(fù)方腸泰制劑對(duì)小鼠結(jié)腸炎的發(fā)生具有明顯抑制作用，見圖1。

注：A為各組小鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)的體質(zhì)量相對(duì)變化量的比較；B為各組小鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期中的疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分比較；C為各組小鼠的結(jié)腸長度比較；D為各組小鼠代表性結(jié)腸外觀比較；Control為空白對(duì)照組，Model為模型組，LCT為低劑量組，HCT為高劑量組，Mesalazine為美沙拉嗪對(duì)照組，Azathioprine為硫唑嘌呤對(duì)照組圖1　復(fù)方腸泰制劑對(duì)各組小鼠體質(zhì)量、疾病活動(dòng)指數(shù)及長度外觀的影響

2.2光鏡下小鼠結(jié)腸組織病理變化表現(xiàn)DSS誘導(dǎo)模型組小鼠結(jié)腸組織黏膜受損，潰瘍累及黏膜全層，黏膜下層水腫，炎細(xì)胞浸潤，而HCT組由于藥物干預(yù)，結(jié)果為較少形成潰瘍，甚至沒有出現(xiàn)炎癥，見圖2。

注：A為空白對(duì)照組； B為模型組；C為低劑量腸泰組；D為高劑量腸泰組； E為美沙拉嗪對(duì)照組；F為硫唑嘌呤對(duì)照組圖2　各組小鼠結(jié)腸遠(yuǎn)端的組織病理結(jié)果(HE染色×200)

2.3各組小鼠結(jié)腸組織超微結(jié)構(gòu)的觀測結(jié)果與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠結(jié)腸段超微結(jié)構(gòu)可見部分微絨毛萎縮脫落，排列稀疏，緊密連接處稍有開放，細(xì)胞間隙擴(kuò)大。高劑量組結(jié)腸微絨毛排列整齊，緊密連接處結(jié)構(gòu)清晰無損壞，與空白對(duì)照組沒有可見差異。該結(jié)果提示高劑量復(fù)方腸泰對(duì)小鼠腸黏膜屏障功能具有保護(hù)作用，見圖3。

注：A為空白對(duì)照組； B為模型組；C為低劑量腸泰組；D為高劑量腸泰組； E為美沙拉嗪對(duì)照組；F為硫唑嘌呤對(duì)照組圖3　各組小鼠結(jié)腸組織超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果(TEM×5 000)

2.4緊密連接蛋白ZO-1，Occludin，Claudin-1的表達(dá)水平通過Western blot檢測，可以得出結(jié)果，即DSS造成模型組小鼠腸道組織緊密連接蛋白受到較大破壞，緊密連接蛋白水平明顯降低；相比空白對(duì)照組小鼠腸道組織緊密連接蛋白的高表達(dá)，HCT組小鼠無明顯可見差異，見圖4。

注：Control為空白對(duì)照組，Model為模型組，LCT為低劑量組，HCT為高劑量組，Mesalazine為美沙拉嗪對(duì)照組，Azathioprine為硫唑嘌呤對(duì)照組圖4　各組小鼠結(jié)腸組織中ZO-1，Occludin，Claudin-1水平

2.5小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-10的表達(dá)水平DSS誘發(fā)UC小鼠后，模型組結(jié)腸勻漿液中促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IFN-γ水平明顯升高，與空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HCT組經(jīng)過藥物干預(yù)后，這些細(xì)胞因子水平與模型組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而對(duì)于抑炎細(xì)胞因子IL-10的水平，模型組和HCT組相比表現(xiàn)出升高趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖5。

注：Control為空白對(duì)照組，Model為模型組，LCT為低劑量組，HCT為高劑量組，Mesalazine為美沙拉嗪對(duì)照組，Azathioprine為硫唑嘌呤對(duì)照組；A為TNF-α；B為IL-6；C為IFN-γ；D為IL-10。與空白對(duì)照組比較aP<0.05圖5　各組小鼠結(jié)腸組織勻漿液中細(xì)胞因子檢測水平

3討論

正常情況下，腸道除具有消化吸收功能外，在預(yù)防腸源性感染方面也起著非常重要的作用，這主要是基于完整的腸道黏膜屏障功能。其可以選擇性的轉(zhuǎn)運(yùn)離子、營養(yǎng)成分及其他有用物質(zhì)，且有效阻止腸腔內(nèi)細(xì)菌、毒素及炎性介質(zhì)等的旁細(xì)胞滲透轉(zhuǎn)運(yùn)，維持機(jī)體的生理平衡[3-5]。研究認(rèn)為UC易感基因和環(huán)境因素誘導(dǎo)腸黏膜屏障損壞，一旦腸黏膜屏障受損，黏膜下層暴露在大量抗原中，機(jī)體激活天然免疫反應(yīng)如升高促炎細(xì)胞因子 TNF-α、IFN-γ等，這些炎性因子可明顯損傷腸道屏障功能[6-7]，使腸黏膜通透性增加，腸道內(nèi)寄居的大量微生物及其代謝產(chǎn)物可引發(fā)或進(jìn)一步惡化腸道炎癥。無論從實(shí)驗(yàn)研究還是從臨床病例來看，在各種腸道疾病中都能觀察到腸屏障功能受損，腸道通透性增加[8-9]。因此可以判斷腸道感染及炎癥與UC發(fā)病過程密切相關(guān)。

UC已被世界衛(wèi)生組織評(píng)為世界難治性疾病之一，并發(fā)癥多，常易復(fù)發(fā)。目前臨床治療藥物主要為氨基水楊酸類、糖皮質(zhì)激素類和免疫抑制劑類，但是這些藥物往往治標(biāo)不治本[10]。中藥安全性高，不良反應(yīng)少，并以其多靶點(diǎn)多組分的特點(diǎn)在多病因的復(fù)雜慢性疾病中具有西藥無法比擬的優(yōu)勢(shì)[11]。復(fù)方腸泰制劑的治療作用前期已有研究證實(shí)[12]，也已經(jīng)進(jìn)入臨床研究階段。該復(fù)方制劑由黃柏、地榆、地錦草、辣蓼共4味傳統(tǒng)中藥組成，黃柏性寒味苦，能清腸腑之熱，燥腸中之濕，為君藥；地榆味苦、酸，性微寒，清熱涼血，瀉火斂瘡；地錦草性平味辛，清熱解毒止瀉，兩者為臣藥；辣蓼味辛性溫，溫中化濕，既可加強(qiáng)燥濕止瀉之力，又可制約黃柏過于苦寒之弊，為佐使藥。四藥合用，具有清熱燥濕、涼血解毒之效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，黃柏中的多種生物堿成分能夠通過下調(diào)促炎細(xì)胞因子及其他炎癥介質(zhì)表達(dá)、抑制T細(xì)胞過度增殖活化等發(fā)揮抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用[13-14]；地榆、地錦草、辣蓼也分別具有抗病原微生物、抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用[15-17]。

本實(shí)驗(yàn)采用中藥復(fù)方腸泰制劑對(duì)UC小鼠發(fā)病進(jìn)程進(jìn)行有效控制，通過7 d一個(gè)完整的造模周期，觀察發(fā)現(xiàn)HCT組的動(dòng)物在體質(zhì)量及疾病活動(dòng)指數(shù)等指標(biāo)上均強(qiáng)于模型組，證實(shí)復(fù)方腸泰制劑對(duì)UC小鼠的保護(hù)作用；通過常規(guī)HE染色觀察到動(dòng)物體內(nèi)結(jié)腸組織的炎癥狀況，HCT組沒有出現(xiàn)符合炎癥的病理組織學(xué)改變，說明腸泰對(duì)炎癥形成具有一定的抑制作用。同時(shí)從超微結(jié)構(gòu)和蛋白免疫印跡發(fā)現(xiàn)HCT組緊密連接蛋白的水平?jīng)]有出現(xiàn)大幅度改變，進(jìn)一步說明復(fù)方腸泰制劑對(duì)UC小鼠腸黏膜屏障的修復(fù)能力。最后通過ELISA檢測到細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-6的變化水平，從側(cè)面反映復(fù)方腸泰制劑對(duì)UC發(fā)病的減輕和維護(hù)作用。

綜上，本研究結(jié)果顯示復(fù)方腸泰制劑對(duì)UC可有效預(yù)防，其機(jī)制可能通過修復(fù)受損的腸道屏障功能來抑制炎癥，緩解炎癥進(jìn)程，啟示可以從維護(hù)腸道黏膜屏障方面來深入研究UC發(fā)病機(jī)理。了解腸黏膜屏障在UC發(fā)病過程中的病理生理作用有助于發(fā)現(xiàn)新的治療方法，也可為臨床治療UC提供參考。

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(本文編輯：張陣陣)

Protective effect of compound Changtai on the intestinal mucosal barrier in the treatment of ulcerative colitis in rats

He Lijuan, Zhang Jundong, An Maomao, Jiang Yuanying

(New Drug Research and Development Center, School of Pharmacy, Second Military Medical University,Shanghai 200433, China)

[Abstract]ObjectiveTo verify the protective effect of compound Changtai on the intestinal mucosal barrier in the treatment of ulcerative colitis (UC), and also to explore the possible mechanism involved.Methods The animal model of ulcerative colitis induced by dextran sodium sulfate (DSS) was established as a first step. The experimental animals were divided into 6 groups, i.e. the blank control group, the model group, the compound Changtai treatment groups with two different dosages (4.3 g/kg, 17.1g/kg), the mesalazine and azathioprine control groups. Seven days after the development of the model, changes in body weight and disease activity index (DAI) were observed and recorded. Colon ultrastructures in the animals of various groups were closely observed by transmission electron microscopy; inflammation in the animals of various groups was observed by HE staining; the levels of TNF-α, IL-6, IFN-γ and IL-10 in the colon of various animal groups were detected by ELISA; and the expression levels of ZO-1, Occludin and Claudin-1 in the colon of various groups were detected by Western blot.ResultsSignificant differences could be seen in the body weight, DAI, colon length in the animals of the model group, as compared with those of the control group(P<0.05). The levels of TNF-α,IL-6 and IFN-γ in the colon were significantly decreased(P<0.05), and the expression levels of Occludin, Claudin-1 and ZO-1 were also significantly decrease(P<0.05). Histopathological detection indicated that inflammatory infiltration was evident. Transmission electron microscopy detection showed a damaged opening dot in the tight junction protein in the colon of the model group. No significant differences could be noted, when comparisons were made between the high dosage Changtai group and the blank control group(P<0.05).ConclusionThe high dosage compound Changtai seemed to have certain protective effect on the intestinal mucosal barrier, the possible mechanism involved might be related with the increased expression level of the tight junction protein and the regulation of intestinal immune function.

[Key words]Ulcerative colitis; Tight junction protein; Intestinal barrier function

(收稿日期：2016-02-02)

[中圖分類號(hào)]R735.2

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[DOI]10.3969/j.issn.1009-0754.2016.02.007

[通信作者]姜遠(yuǎn)英，電子信箱：13761571578@163.com

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81274164)

·論著·

[作者單位]200433上海，第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心(何麗娟、姜遠(yuǎn)英)；同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院(張軍東)；同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院(安毛毛)