朱琳 徐穎 孔聰 粟海波 黃琪 朱勝玲 王洪海

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結(jié)核分枝桿菌新型抗原Rv3400的免疫原性研究

朱琳 徐穎 孔聰 粟海波 黃琪 朱勝玲 王洪海

目的 用結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)特異性抗原Rv3400 聯(lián)合弗氏不完全佐劑(incomplete Freund’s adjuvant，IFA)構(gòu)建結(jié)核亞單位疫苗(Rv3400-IFA)，在 C57BL/6小鼠體內(nèi)評(píng)估其免疫效應(yīng)。體外用抗原Rv3400感染巨噬細(xì)胞RAW264.7并評(píng)估其免疫應(yīng)答。方法 PCR擴(kuò)增基因Rv3400，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a(+)-Rv3400，轉(zhuǎn)入大腸埃希菌BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞中，誘導(dǎo)表達(dá)并純化Rv3400蛋白。用抗原Rv3400、陽性對(duì)照脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)，分別刺激小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，陰性對(duì)照為未刺激的巨噬細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面分子表達(dá)，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，ELISA 檢測(cè)細(xì)胞因子的分泌。另一方面純化的Rv3400蛋白與IFA充分乳化構(gòu)建亞單位疫苗免疫小鼠；C57BL/6小鼠采用數(shù)字表法隨機(jī)分為3組，分別為實(shí)驗(yàn)組Rv3400組、陽性對(duì)照組Rv3425組、 陰性對(duì)照組IFA組，每組5只，每2周1次、共免疫3次。分別采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)技術(shù)(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA) 技術(shù)對(duì)免疫小鼠的細(xì)胞免疫和體液免疫進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果 (1)成功克隆表達(dá)并純化結(jié)核分枝桿菌特異性抗原Rv3400。(2)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：Rv3400抗原刺激巨噬細(xì)胞，其表面分子CD80、CD86、CD40、MHCⅡ表達(dá)量顯著提高，陽性細(xì)胞比率[分別由未刺激的(34.70±2.40)%、(31.25±18.31)%、(41.80±6.01)%、(44.30±0.44)%提高至1 μg/ml Rv3400抗原刺激后的(90.45±7.71)%、(90.10±4.10)%、(89.97±7.79)%、(85.13±5.12)%]；能促進(jìn)細(xì)胞分泌高水平的腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)，分別達(dá)(49 217.0±390.61)pg/ml、(1783.4±51.18) pg/ml。(3)免疫小鼠后，ELISPOT結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組Rv3400組小鼠分泌INF-γ的斑點(diǎn)形成細(xì)胞(spot forming cells,SFC)(136.20±95.09)顯著高于陰性對(duì)照組(14.00±9.62)(t=2.859，P<0.01)；ELISA結(jié)果顯示: Rv3400組小鼠T細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α和IFN-γ的水平[(247.38±142.268)pg/ml、(325.45±75.19)pg/ml)]明顯高于陰性對(duì)照組[(69.25±60.06)pg/ml、(2.22±1.28)pg/ml(t=2.579，P<0.05；t=8.597，P<0.01)]；(4)Rv3400 組小鼠脾CD4+CD44high、CD4+CD62Llow、CD8+CD44high、CD8+CD62LlowT淋巴細(xì)胞百分比[(44.20±11.95)%，(43.56±11.90)%，(48.88±7.42)%，(47.04±7.72)%]與對(duì)照組IFA組[(27.02±6.56)%，(62.60±4.73)%， (30.57±6.00)%，(58.48±6.06)%]相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(one-way ANOVA，F(xiàn)=18.460，F(xiàn)=8.108，F(xiàn)=32.194；F=4.080；P<0.05，P<0.01，P<0.01，P<0.05)，呈顯著性增加。(5)通過間接ELISA測(cè)定免疫后的小鼠血清抗體IgG效價(jià)水平高達(dá)1∶409 600，表明抗原Rv3400也能誘導(dǎo)有效的體液免疫應(yīng)答；IgG2b/IgG1水平為1.8，說明抗原Rv3400誘導(dǎo)小鼠以Th1型免疫反應(yīng)為主。結(jié)論 亞單位疫苗Rv3400-IFA 在C57BL/6 小鼠體內(nèi)可產(chǎn)生較好的細(xì)胞免疫和體液免疫效應(yīng)。結(jié)核分枝桿菌特異性抗原Rv3400有望成為新的結(jié)核病疫苗設(shè)計(jì)及診斷的候選抗原。

分枝桿菌，結(jié)核； Rv3400； 亞單位疫苗； 細(xì)胞免疫； 體液免疫

結(jié)核病(TB)是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的重大傳染病，是世界上僅次于艾滋病(AIDS)的第二大高死亡率的傳染性疾病。根據(jù)WHO 2015年度報(bào)告統(tǒng)計(jì)，2014年全球新發(fā)結(jié)核病患者960萬例，死亡高達(dá)150萬例[1]。盡管大部分的肺結(jié)核是可控可治的，但每年結(jié)核病的死亡率仍然很高。卡介苗(BCG)是目前惟一用于人結(jié)核病的預(yù)防性疫苗，初生嬰兒接種BCG可顯著降低兒童原發(fā)性肺結(jié)核、粟粒型肺結(jié)核和結(jié)核性腦膜炎的發(fā)病率和死亡率，但對(duì)于成人肺結(jié)核的保護(hù)效率差異極大，導(dǎo)致成人接種BCG 的效果較差[2]。因此，亟待研究開發(fā)新型高效的結(jié)核病預(yù)防疫苗。亞單位疫苗成分明確，可以誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答，由于亞單位疫苗的保護(hù)效果難以超過BCG，對(duì)優(yōu)秀的Mtb抗原，可以構(gòu)建亞單位疫苗，采用BCG初始免疫-亞單位疫苗增強(qiáng)免疫的策略，可以提高成人的免疫效果[3]。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究顯示，Rv3400抗原在結(jié)核病患者的血清學(xué)檢查中具有較高的敏感度和特異度。通過基因組比對(duì)發(fā)現(xiàn)，Mtb基因組中的一些片段在BCG 基因組中缺失，這些缺失片段被稱為差異區(qū)域(region of differences，RD)，Rv3400位于RD16區(qū)域，研究表明Rv3400作為水解酶，參與分枝菌酸合成途徑[4]。而Mtb的生長(zhǎng)、致病性、耐藥性及抗酸特性都與菌株中所含的分枝菌酸有關(guān)，但是目前對(duì)其生物學(xué)功能還知之甚少。本實(shí)驗(yàn)在體外用Rv3400抗原刺激巨噬細(xì)胞，顯示Rv3400抗原能促進(jìn)細(xì)胞分泌高水平的白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，引發(fā)較強(qiáng)的免疫反應(yīng)；另外選擇Rv3400和能引起強(qiáng)烈細(xì)胞免疫反應(yīng)的弗氏不完全佐劑(incomplete Freund’s adjuvant，IFA)構(gòu)建亞單位疫苗(Rv3400-IFA)，以觀察免疫動(dòng)物的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，初步評(píng)估其免疫效應(yīng)，旨在尋找新型結(jié)核病亞單位疫苗，更好地預(yù)防結(jié)核病。

材料和方法

一、材料

1.菌株和細(xì)胞系：表達(dá)菌株大腸埃希菌(E.coli)BL21(DE3)pLysS(北京全式金生物技術(shù)有限公司提供), 巨噬細(xì)胞系RAW264.7由本實(shí)驗(yàn)室保存。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為6～8周雌性C57BL/6清潔級(jí)小鼠，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，購買后飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房。

3.主要試劑：pET-28a(+)質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存；H37Rv基因組由上海市肺科醫(yī)院提供；TransStart FastPfu DNA 聚合酶 (北京全式金生物技術(shù)有限公司提供)； EcoR I、HindⅢ (日本TaKaRa公司提供)；T4 DNA 連接酶 (美國New England Biolabs公司提供)；20×PBS(磷酸鹽緩沖液)(生工生物工程上海股份有限公司提供)；親和層析所用介質(zhì)Ni-NTA(nitrilotriacetic acid，氨三乙酸) His·Bind resin(德國Novagen公司提供)；弗氏不完全佐劑(incomplete Freund’s adjuvant, IFA； 德國Sigma公司提供)；Mouse IFN-γ、TNF-α ELISPOT kit(PVDF)(荷蘭U-CyTech biosciences公司提供)；小鼠淋巴細(xì)胞分離液(加拿大Cedarlane公司提供)。流式檢測(cè)所用熒光抗體： 異硫氰酸熒光素(FITC)偶聯(lián)抗鼠CD62L抗體、聚乙烯(PE)/Cy5偶聯(lián)抗鼠CD8a抗體、PE偶聯(lián)抗鼠 CD44抗體、PE/Cy5偶聯(lián)抗鼠 CD4抗體 (美國eBioscience公司提供)； PE 偶聯(lián)抗鼠 CD80抗體、FITC 偶聯(lián)抗鼠 CD86抗體、FITC 偶聯(lián)抗鼠 CD40 抗體(美國BD Biosciences公司提供)；PE 偶聯(lián)抗鼠 I-A/I-E抗體 (美國eBioscience公司提供)；Mouse 預(yù)包被ELISA kit (深圳市達(dá)科為生物技術(shù)有限公司提供)。

二、方法

1.Rv3400的擴(kuò)增及原核表達(dá)載體pET28a(+)-Rv3400的構(gòu)建：以Mtb H37Rv的基因組序列為模板，用TransStart FastPfu DNA 聚合酶進(jìn)行所需基因序列的擴(kuò)增。上游引物的序列為：5′-CCGGAATTCATGGCGAACTGGTATCGCCC-3′(下劃線部分為EcoR I酶切位點(diǎn))，下游引物序列為： 5′-CCCAAGCTTCTACAGCAGCTCGGCGAGAT-CG-3′(下劃線部分為Hind Ⅲ酶切位點(diǎn))，預(yù)期得到的目的片段大小為789 bp。用 EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切基因產(chǎn)物, 回收的目的片段與同樣酶切后的pET28a(+)載體連接, 轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑選2個(gè)菌落, 分別接種于3 ml含50 μg/ml卡納霉素的LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)液, 37 ℃ 振蕩培養(yǎng)過夜。堿裂解法提取質(zhì)粒DNA, 用EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組質(zhì)粒正確后，將重組質(zhì)粒pET28a(+)-Rv3400送至上海睿迪生物科技有限公司測(cè)序，將測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)PLysS感受態(tài)，挑選陽性克隆用于蛋白表達(dá)。

2. Rv3400蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化：將構(gòu)建好的表達(dá)菌株BL21(DE)-pET28a(+)-Rv3400接到3 ml含50 μg/ml卡納霉素的LB培養(yǎng)液，過夜培養(yǎng)。將過夜培養(yǎng)物以1∶50的體積比稀釋后，37 ℃搖床，轉(zhuǎn)速為180 轉(zhuǎn)/min，培養(yǎng)至吸光度(A)在波長(zhǎng)600 nm時(shí)=0.4～0.6，加入β-硫代半乳糖苷(IPTG)使其終濃度為0.5 mmol/L，28 ℃誘導(dǎo)過夜，誘導(dǎo)產(chǎn)物通過12%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)進(jìn)行分析。按照上述確定的最佳條件擴(kuò)大培養(yǎng)，離心收菌，用PBS將菌體重懸后進(jìn)行超聲波破碎菌體，收集上清。利用Novagen公司的純化柱純化目的蛋白，將純化、透析后得到的蛋白樣品置于-70 ℃保存。

3. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：將培養(yǎng)好的巨噬細(xì)胞RAW264.7計(jì)數(shù)后以每孔5×105個(gè)細(xì)胞鋪24孔板，將細(xì)胞培養(yǎng)過夜后分別加入終濃度為1 μg/ml、10 μg/ml 的Rv3400抗原，陽性對(duì)照為用1 μg/ml 脂多糖(LPS)，陰性對(duì)照為未刺激的細(xì)胞，放置在37 ℃、 5% CO2、100%濕度的條件下靜置培養(yǎng)，分別于24、48、72 h后收集細(xì)胞，重懸于PBS中洗2～3次，加入相應(yīng)的熒光標(biāo)記抗體，室溫避光孵育30 min，洗滌后重懸于PBS中，濾膜過濾進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)表面分子CD80、CD86、CD40、MHCⅡ的表達(dá)量；收集細(xì)胞上清ELISA 檢測(cè)細(xì)胞因子TNF-a、IL-6的分泌情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

4. 免疫小鼠實(shí)驗(yàn)：將小鼠按數(shù)字表法隨機(jī)分成3組，每組5只。選取本實(shí)驗(yàn)室的優(yōu)秀抗原Rv3425作為陽性對(duì)照組Rv3425組，實(shí)驗(yàn)組Rv3400組，陰性對(duì)照組IFA組。免疫方法為皮下注射；免疫策略：用50 μg純化好的蛋白R(shí)v3425、Rv3400和等體積IFA充分乳化混勻，陰性對(duì)照組每只小鼠免疫50 μl IFA。分別于第1、3、5周免疫3次，于第7周取小鼠眼球血處死小鼠，取脾臟分離脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行免疫指標(biāo)的檢測(cè)。

5.檢測(cè)方法：(1)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞CD4+CD44highCD62Llow、CD8+CD44highCD62LlowT細(xì)胞百分比。計(jì)數(shù)后的脾淋巴細(xì)胞懸液加入到12孔板中，每孔加入2.5×105個(gè)細(xì)胞(500 μl)，蛋白R(shí)v3425、Rv3400刺激物濃度為10 μg/ml，混合均勻，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h。離心后收集計(jì)數(shù)后培養(yǎng)的脾淋巴細(xì)胞并收集細(xì)胞沉淀，重懸于PBS中洗2～3次，加入相應(yīng)的熒光標(biāo)記抗體，避光孵育30 min，洗滌后重懸于PBS中，濾膜過濾進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)，F(xiàn)lowJo7.6軟件分析結(jié)果。(2)采用ELISPOT檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子IFN-γ分泌水平。處死小鼠后，分離小鼠淋巴細(xì)胞，免疫細(xì)胞以2.5×105個(gè)細(xì)胞(500 μl)接種，加入同體積的蛋白刺激物(刺激物濃度為10 μg/ml，1640雙抗培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)的濃度)，混合均勻，于37 ℃，5% CO2濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，按照試劑盒說明書檢測(cè)脾細(xì)胞細(xì)胞因子分泌，板子干燥完全后，送至達(dá)科為生物技術(shù)有限公司讀板計(jì)數(shù)斑點(diǎn)。(3)采用ELISA檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞上清細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-4分泌。收集細(xì)胞培養(yǎng)36 h的上清用于細(xì)胞因子檢測(cè)，按試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，所用的試劑盒為mouse IFN-γ、TNF-α、IL-4預(yù)包被ELISA kit。(4)采用ELISA檢驗(yàn)外周血免疫球蛋白抗體IgG、IgG1、IgG2b水平。采集小鼠眼球外周血并分離血清，用包被緩沖液稀釋抗原(Rv3425、Rv3400)至適當(dāng)濃度(5 μg/ml)，每孔加入100 μl 抗原，4 ℃包被過夜，封閉1 h，按照對(duì)比稀釋的方法加入從1/400 開始對(duì)比稀釋的血清，孵育1 h，分別加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG、IgG1、IgG2b二抗抗體，孵育后顯色終止，450 nm處讀板，空白組為對(duì)照。

結(jié) 果

一、 Rv3400蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

對(duì)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組菌株BL21(DE)-pET28a(+)-Rv3400進(jìn)行SDS-PAGE分析，在相對(duì)分子質(zhì)量28 000處出現(xiàn)目的蛋白條帶，而空載體菌株BL21(DE)-pET28a(+)無此條帶。表明Rv3400基因在大腸桿菌中得到了成功表達(dá)。目的蛋白在細(xì)菌裂解上清和包涵體均有表達(dá)，主要在上清表達(dá)，收集上清用Ni-NTA 親和純化柱純化目的蛋白，得到較高純度的蛋白(圖1)。

M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：未誘導(dǎo)重組BL21(DE)-pET28a(+)；2：未誘導(dǎo)重組BL21(DE)-pET28a(+)-Rv3400全菌；3：誘導(dǎo)后重組BL21(DE)-pET28a(+)-Rv3400全菌；4：誘導(dǎo)后重組BL21(DE)-pET28a(+)-Rv3400上清；5：誘導(dǎo)后重組BL21(DE)-pET28a(+)-Rv3400沉淀；6：Ni-NTA 純化后的Rv3400蛋白(相對(duì)分子質(zhì)量28 000)圖1 重組蛋白R(shí)v3400純化的SDS-PAGE電泳分析

二、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1．流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞表面分子CD80、CD86、CD40、主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ表達(dá)：用1 μg/ml、10 μg/ml Rv3400抗原， 1 μg/ml LPS分別刺激巨噬細(xì)胞，放置在37 ℃、 5% CO2、100%濕度的條件下靜置培養(yǎng)24、48、72 h后，分別收集巨噬細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。未刺激的巨噬細(xì)胞做陰性對(duì)照。結(jié)果用FlowJo 7.6軟件分析，以未刺激的巨噬細(xì)胞表達(dá)CD80、CD86、CD40、MHCⅡ陽性細(xì)胞為基準(zhǔn)畫門，得到1 μg/ml、10 μg/ml Rv3400抗原、1 μg/ml LPS刺激的巨噬細(xì)胞表達(dá)CD80、CD86、CD40、MHCⅡ陽性細(xì)胞百分比。檢測(cè)抗原刺激細(xì)胞后的3個(gè)時(shí)間相比，刺激24 h后的巨噬細(xì)胞表面分子表達(dá)量最高。如表1所示，與未刺激的巨噬細(xì)胞相比，用1 μg/ml、10 μg/ml Rv3400抗原刺激巨噬細(xì)胞后的CD80表達(dá)量顯著提高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(one-way ANOVA：F=104.198，P<0.01)；CD86、CD40、MHCⅡ的表達(dá)而言，用1 μg/ml、10 μg/ml Rv3400抗原刺激巨噬細(xì)胞后表達(dá)量同樣顯著提高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[one-way ANOVA：F=19.900，F(xiàn)=83.567，F(xiàn)=210.811，P值均<0.01]；說明Rv3400抗原可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞的分化成熟。

2． ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清特異性TNF-α、IL-6的水平：收集不同抗原刺激的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清，ELISA檢測(cè)細(xì)胞TNF-α、IL-6分泌情況。結(jié)果如表2所示，與未刺激的細(xì)胞相比，Rv3400蛋白刺激的巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6的能力顯著升高。1 μg/ml Rv3400、10 μg/ml Rv3400抗原刺激的細(xì)胞TNF-α分泌水平與未刺激的細(xì)胞相比差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(one-way ANOVA，F(xiàn)=377.715，P<0.01),；IL-6的分泌水平來說，10 μg/ml Rv3400抗原刺激細(xì)胞的分泌水平高于1 μg/ml Rv3400抗原刺激的分泌水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；1 μg/ml Rv3400刺激的細(xì)胞IL-6分泌水平與未刺激的細(xì)胞IL-6分泌水平相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(one-way ANOVA，F(xiàn)=10.524，P<0.05)；未刺激的巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-6的分泌水平極低。

表1 巨噬細(xì)胞表面分子CD80、CD86、CD40、MHCⅡ表達(dá)量(采用不同劑量Rv3400抗原刺激巨噬細(xì)胞24 h后與未刺激巨噬細(xì)胞表達(dá)量比較)

表2 采用不同劑量Rv3400抗原刺激巨噬細(xì)胞24 h后與未刺激組細(xì)胞因子分泌量

二、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾CD4+CD44highCD62Llow、CD8+CD44highCD62LlowT淋巴細(xì)胞分群：如圖2所示，Rv3400組的小鼠可以誘導(dǎo)CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表面分子CD44顯著性上調(diào)和CD62L 顯著性下調(diào)。Rv3400組CD4+CD44+、CD8+CD44+雙陽性T淋巴細(xì)胞百分比[(44.20±11.95)%，(48.88±7.42)%]與對(duì)照組IFA組[(27.02±6.56)%，(30.57±6.00)%]相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(one-way ANOVA，F(xiàn)=18.460，F(xiàn)=32.194；P<0.05，P<0.01)，T淋巴細(xì)胞表面的CD44受到特異性抗原刺激后表達(dá)明顯升高；CD62L的表達(dá)來說，Rv3400組小鼠T淋巴細(xì)胞CD4+CD62L+，CD8+CD62L+百分比[(43.56±11.90)%，(47.04±7.72)%]顯著性降低(one-way ANOVA，F(xiàn)=8.108,F=4.080；P<0.01，P<0.05),而對(duì)照組IFA組CD4+CD62L+，CD8+CD62L+T淋巴細(xì)胞比率為(62.60±4.73)%，(58.48±6.06)%。

one-way ANOVA，最小顯著性差異法(LSD)比較組間差異，a：P<0.05；b：P<0.01圖2 CD4+CD44high、 CD4+CD62Llow， CD8+CD44high、 CD8+CD62Llow T淋巴細(xì)胞百分比

2.ELISPOT方法檢測(cè)各組小鼠脾淋巴細(xì)胞特異性分泌IFN-γ的水平：在特異性抗原刺激下，實(shí)驗(yàn)組小鼠Rv3400組脾淋巴細(xì)胞特異性分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)[斑點(diǎn)形成細(xì)胞(sport forming cells, SFC)]顯著高于陰性對(duì)照組(成組t檢驗(yàn)，t=2.859，P<0.05)，免疫效果與陽性對(duì)照組Rv3425組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)

SFC/2.5×105細(xì)胞: 2.5×105個(gè)細(xì)胞中的SFC；成組t檢驗(yàn)，a：P<0.05，b：P<0.01圖3 ELISPOT 檢測(cè)免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞特異性分泌IFN-γ水平

3. ELISA檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清特異性TNF-α、 IFN-γ、IL-4的水平：在特異性抗原刺激下，與對(duì)照組IFA組相比，Rv3400組小鼠有更好的TNF-α和IFN-γ的分泌能力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(成組t檢驗(yàn)，t=2.578，P=0.033；t=8.587，P=0.003)；IL-4的分泌水平很低，且各組間的水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明Rv3400傾向于引起Th1型的免疫反應(yīng)。

成組t檢驗(yàn)，a：P<0.05；b：P<0.01圖4 ELISA 檢測(cè)小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清特異性細(xì)胞因子TNF-α、 IFN-γ、IL-4的分泌

4． ELISA檢驗(yàn)外周血免疫球蛋白IgG、IgG2b/IgG1水平：用抗原Rv3400，Rv3425預(yù)包被ELISA 96孔板，對(duì)比稀釋血清，檢測(cè)小鼠血清中IgG的效價(jià)來評(píng)價(jià)抗原Rv3400引起小鼠體液免疫水平的變化。結(jié)果如圖5所示，Rv3400蛋白有較高的抗體IgG滴度，抗體效價(jià)達(dá)1∶409 600，與Rv3425的效果相當(dāng)。說明抗原Rv3400能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性抗體。對(duì)IgG2b/IgG1水平來說,同組的血清IgG2b水平高于IgG1水平(如圖6)，比值為1.8，說明抗原Rv3400誘導(dǎo)小鼠Th1型免疫反應(yīng)為主，而結(jié)核病的保護(hù)性免疫恰恰與一個(gè)強(qiáng)的Th1型T細(xì)胞反應(yīng)的建立有關(guān)。

圖5 用抗原Rv3400、Rv3425預(yù)包被ELISA 96孔板，對(duì)比稀釋血清后血清中IgG抗體水平的檢測(cè)結(jié)果

討 論

結(jié)核病是當(dāng)前危害人類健康的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題，是世界上由單病原菌引起的死亡人數(shù)最多、造成危害性最大的疾病。而目前惟一使用的結(jié)核病預(yù)防疫苗卡介苗保護(hù)效果不理想，近年來結(jié)核病的發(fā)病率一直居高不下且致死率高，蛋白亞單位疫苗作為新型抗結(jié)核疫苗的一種，具有其安全性優(yōu)勢(shì)，還可以特異性誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞活化，是較為理想的疫苗之一[5]。

圖6 用抗原Rv3400、Rv3425預(yù)包被ELISA 96孔板，對(duì)比稀釋血清后血清中IgG2b、IgG1抗體水平的檢測(cè)結(jié)果

結(jié)核分枝桿菌是一種胞內(nèi)寄生菌，在結(jié)核分枝桿菌入侵時(shí)，宿主會(huì)啟動(dòng)第一道防線即天然免疫系統(tǒng)來抵抗結(jié)核分枝桿菌的感染，在天然免疫系統(tǒng)中，巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等對(duì)于結(jié)核感染起重要作用[6]。結(jié)核分枝桿菌通過Toll樣受體(TLR)等模式識(shí)別受體, 激活巨噬細(xì)胞的天然免疫反應(yīng), 清除細(xì)菌和調(diào)節(jié)獲得性免疫反應(yīng)。CD80、CD86是表達(dá)在抗原提呈細(xì)胞(APC)表面的重要協(xié)同刺激分子，是T細(xì)胞活化的必需共刺激信號(hào)。未受抗原刺激的APC幾乎不表達(dá)CD80、CD86分子，但經(jīng)活化后CD80、CD86的表達(dá)顯著上調(diào)[7]。CD40可直接誘導(dǎo)共刺激分子CD80、CD86 的表達(dá)。有文獻(xiàn)報(bào)道, 表達(dá)于巨噬細(xì)胞表面的CD40與T細(xì)胞表面CD40L結(jié)合能促使溶酶體與吞噬小體融合, 促進(jìn)病原體的清除[8-10]。CD40是在抗原提呈細(xì)胞表面的共刺激因子,其可以通過NF-kB上調(diào)IL-6、黏附分子CD54和抗凋亡蛋白的表達(dá), 促進(jìn)細(xì)胞增殖。巨噬細(xì)胞通過調(diào)節(jié)其表面分子如CD80、CD86、MHCⅠ和MHCⅡ來激活 Toll樣受體2通路，是機(jī)體激發(fā)固有免疫和適應(yīng)性免疫的關(guān)鍵[11]；MHCⅡ是免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)的重要組成部分，巨噬細(xì)胞表面MHCⅡ的表達(dá)是完成抗原提呈的必須條件，分子抗原與抗原多肽結(jié)合并將抗原呈遞給CD4+T細(xì)胞，進(jìn)而誘導(dǎo)其產(chǎn)生細(xì)胞因子[12]。

巨噬細(xì)胞在細(xì)胞免疫中還起到重要的效應(yīng)器作用,在結(jié)核分枝桿菌和其他細(xì)胞因子的刺激下,能夠產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，如: IL-6、TNF-α等[13]。TNF-α對(duì)于機(jī)體包圍感染部位防止擴(kuò)散起到很重要的作用[14]。IL-6 和TNF-α、IL-1β一起啟動(dòng)早期炎癥反應(yīng),增強(qiáng)T細(xì)胞和B細(xì)胞反應(yīng)[15]。本研究用重組表達(dá)的抗原Rv3400蛋白體外刺激小鼠巨噬細(xì)胞系，顯示Rv3400可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表面分子CD80、CD86、CD40、MHCⅡ表達(dá)增加，提高巨噬細(xì)胞的抗原提呈能力，參與T細(xì)胞的激活。同時(shí)Rv3400刺激巨噬細(xì)胞能夠產(chǎn)生高水平的促炎因子IL-6和TNF-α的分泌。因此，結(jié)核桿菌特異性抗原Rv3400可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的活性，更有效地激活T細(xì)胞，有利于機(jī)體識(shí)別結(jié)核分枝桿菌，抵抗結(jié)核分枝桿菌的早期感染。

本實(shí)驗(yàn)將Rv3400蛋白與佐劑混合后免疫小鼠，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Rv3400蛋白能夠有效誘導(dǎo)脾臟淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性的IFN-γ和TNF-α, Rv3400組顯著高于對(duì)照組IFA組(P<0.01)，并且分泌水平顯著高于誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-4的分泌水平，呈現(xiàn)顯著的Th1型免疫應(yīng)答趨勢(shì)。結(jié)核分枝桿菌為胞內(nèi)寄生菌，一般認(rèn)為在控制結(jié)核分枝桿菌感染過程中以CD4+T 細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ為特征的Th1 型免疫應(yīng)答起重要作用[13-14]。IFN-γ是控制結(jié)核分枝桿菌感染的關(guān)鍵性Ⅰ型細(xì)胞因子，可以誘導(dǎo)Th0細(xì)胞向Th1 細(xì)胞分化[16],從而激活巨噬細(xì)胞，參與免疫應(yīng)答。TNF-α作為主要的Ⅰ型細(xì)胞因子在宿主結(jié)核肉芽腫的形成和維持過程中起著關(guān)鍵作用。Th0細(xì)胞在IL-4的誘導(dǎo)下分化成Th2細(xì)胞。Th2細(xì)胞通過分泌IL-4、IL-5、IL-6等促進(jìn)B細(xì)胞的增殖分化和形成抗體，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。在IFN-γ的檢測(cè)中，筆者運(yùn)用了ELISPOT和ELISA兩種檢測(cè)方法，檢測(cè)結(jié)果一致，都能很好地反映細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的水平差異；ELISPOT作為ELISA的改良技術(shù)，更靈敏，結(jié)果更直觀。

免疫記憶是評(píng)價(jià)疫苗的重要因素，T細(xì)胞中CD44highCD62Llow的表達(dá)是評(píng)價(jià)一個(gè)疫苗免疫記憶效應(yīng)的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)表明，Rv3400/IFA免疫的小鼠脾淋巴細(xì)胞有更明顯的CD4+CD44highCD62Llow、CD8+CD44highCD62Llow分群。CD44、CD62L 是效應(yīng)型記憶T 細(xì)胞的表面標(biāo)志[17]。一般來說，效應(yīng)型記憶T細(xì)胞的表面表達(dá)CD44highCD62Llow表型。CD44是存在于淋巴細(xì)胞表面的蛋白，是淋巴細(xì)胞外滲到炎癥部位的重要調(diào)節(jié)因子。受到刺激后其上調(diào)是所有記憶T細(xì)胞的標(biāo)志[18]。CD62L是被認(rèn)為的是初始T細(xì)胞(即未接觸到特異性抗原的一類T細(xì)胞)表面的歸巢受體。其在T細(xì)胞群被激活后是下調(diào)的[19]。有研究表明，受到感染后CD4+、CD8+T細(xì)胞表面分子CD62L表達(dá)下調(diào)，CD44表達(dá)上調(diào)[18]。因此，抗原Rv3400顯示出很好的免疫記憶性。

本實(shí)驗(yàn)采用間接ELISA對(duì)小鼠血清中的抗體效價(jià)進(jìn)行檢測(cè)，Rv3400/IFA 組小鼠的抗體IgG滴度顯著高于對(duì)照組IFA組，抗體IgG效價(jià)水平高達(dá)1∶409 600說明亞單位疫苗Rv3400/IFA 不僅可以刺激小鼠的細(xì)胞免疫反應(yīng)，又可以使小鼠體內(nèi)產(chǎn)生高滴度的抗體水平。IgG1是依賴Th2途徑免疫應(yīng)答的特征性標(biāo)志, 而IgG2b是依賴Th1途徑免疫應(yīng)答的特征性標(biāo)志。本研究中免疫小鼠免疫Rv3400/IFA后，其IgG2b水平高于IgG1，說明抗原Rv3400誘導(dǎo)小鼠Th1型免疫反應(yīng)為主，且可以引起持久的Th1型免疫反應(yīng)。

綜上結(jié)果表明: 體外巨噬細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示, 抗原Rv3400能夠誘導(dǎo)高水平IL-6 和TNF-α的分泌，增加巨噬細(xì)胞表面分子CD80、CD86、CD40、MHCⅡ的表達(dá)，提高巨噬細(xì)胞吞噬能力；抗原Rv3400聯(lián)合不完全佐劑IFA免疫小鼠后增強(qiáng)小鼠TNF-α、IFN-γ分泌能力，引起抗原特異性的Th1 型細(xì)胞免疫應(yīng)答；小鼠有明顯的CD4+CD44highCD62Llow、CD8+CD44highCD62Llow分群，顯示良好的免疫記憶性，同時(shí)促進(jìn)血清IgG水平增加，可以引起強(qiáng)烈的體液免疫，Rv3400有望成為新的結(jié)核疫苗設(shè)計(jì)的候選抗原。

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(本文編輯：薛愛華)

Immunologenicity of specific antigen Rv3400 ofMycobacteriumtuberculosis

ZHULin,XUYing,KONGCong,SUHai-bo,HUANGQi,ZHUSheng-ling,WANGHong-hai.

SchoolofLifeSciencesFudanUniversity,Shanghai200438,China

Correspondingauther:WANGHong-hai,Email:hhwang@fudan.edu.cn

Objective To construct a subunit vaccine (Rv3400-IFA) by combining specific antigen Rv3400 ofMycobacteriumtuberculosiswith incomplete Freund’s adjuvant (IFA), to assess its immune effects in C57BL/6 mice and by infecting the macrophages RAW264.7 with antigen Rv3400. Methods TheRv3400 gene fragment was amplified by PCR, and inserted into plasmid pET28a(+). The protein Rv3400 was expressed inE.coliBL21 (DE3) pLysS and purified. The macrophages RAW264.7 were divided into 3 groups including positive control group [treated with 1 μg/ml lipopolysaccharides (LPS)], test group (treated with 1 μg/ml Rv3400), negative control group (no treated), the expression of cell surface markers was examined by flow cytometry, and cell culture supernatant was collected and detected the cytokines secreted by ELISA. Rv3400 protein and IFA were equally mixed and emulsified. The C57BL/6 mice were randomly divided into 3 groups with each group 5 mice including test group (treated with Rv3400-IFA), positive control group (treated with Rv3425-IFA), negative control group (treated with IFA), immunized 3 times at 2 week interval. The humoral and cellular immune responses in mice were analysed by enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT), ELISA and flow cytometry. Results (1) The Rv3400 protein was successfully expressed and purified. (2) The macrophages were stimulated with 1 μg/ml Rv3400 antigen, significantly improved the expression of surface markers CD80 [from (34.70±2.40)% to (90.45±7.71)%], CD86 [from (31.25±18.31)% to (90.10±4.10)%], CD40 [from (41.80±6.01)% to (89.97±7.79)%] and MHCⅡ [from (44.30±0.44)% to (85.13±5.12)%], and promoted pro-inflammatory cytokine production [TNF-α (49 217.0±390.61)pg/ml, IL-6 (1783.4±51.18)pg/ml]. (3) The spot forming cells (SFC) of IFN-γ in mice immunized with Rv3400-IFA was (136.20±95.09), significantly higher than that in IFA group (14.00±9.62) (t=2.859,P<0.01). The TNF-α and IFN-γ levels in spleen lymphocyte culture supernatants were (247.38±142.268)pg/ml and (325.45±75.19)pg/ml respectively, significantly higher than those in IFA group [(69.25±60.06)pg/ml and (2.22±1.28)pg/ml] (t=2.579，P<0.05；t=8.597，P<0.01). (4) The percentages of CD4+CD44high[(44.20±11.95)%], CD4+CD62Llow[(43.56±11.90)%], CD8+CD44high[(48.88±7.42)%] and CD8+CD62LlowT cells [(47.04±7.72)%] in Rv3400-IFA group were significantly higher than those in IFA group [(27.02±6.56)%，(62.60±4.73)%， (30.57±6.00)% and (58.48±6.06)%], (one-way ANOVA，F(xiàn)=18.460，F(xiàn)=8.108，F(xiàn)=32.194；F=4.080；P<0.05，P<0.01，P<0.01，P<0.05). (5) The serum IgG level in test group was as high as 1∶409 600. The level of IgG2b/IgG1 was 1.8. Conclusion The subunit vaccine Rv3400-IFA can induce strong humoral and cellular immune responses in C57BL/6 mice.MycobacteriumtuberculosisRv3400 protein may be a novel candidate antigen for designing the TB vaccine and diagnosing the TB．

Mycobacteriumtuberculosis; Rv3400; Subunit vaccine; Cellular immunity; Humoral immunity

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.03.010

“十二五”國家科技重大專項(xiàng)(2012ZX10003008)

200438，上海，復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

王洪海，Email：hhwang@fudan.edu.cn

2015-10-20)