王丁丁 付麗麗 寇麗杰 張婷 董巧香 趙愛華

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豚鼠模型卡介苗接種所引發(fā)的淋巴結(jié)炎致病菌的分離和鑒定

王丁丁 付麗麗 寇麗杰 張婷 董巧香 趙愛華

目的 建立由卡介苗接種所引發(fā)的淋巴結(jié)炎致病菌分離與菌型鑒定的豚鼠模型，研究卡介苗臨床不良反應(yīng)病原學(xué)的鑒定方法。 方法 按照隨機(jī)數(shù)字表法將39只豚鼠分為生理鹽水組(3只)，高劑量和低劑量卡介苗接種組(各18只)。分別于注射生理鹽水和卡介苗后4、5、8周對(duì)豚鼠進(jìn)行解剖，手術(shù)摘取卡介苗接種后豚鼠的淋巴結(jié)與局部膿腫，研磨處理為組織懸液。將組織懸液接種于改良羅氏培養(yǎng)基、7H11培養(yǎng)基、7H9液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)對(duì)組織懸液進(jìn)行抗酸染色與卡介菌特異性缺失區(qū)1(BCG RD1)的檢測(cè)。培養(yǎng)結(jié)束后對(duì)3種培養(yǎng)物均進(jìn)行抗酸染色與BCG RD1的檢測(cè)。結(jié)果 組織懸液在改良羅氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)陽性結(jié)果為淋巴結(jié)33/33，膿腫6/6；在7H11培養(yǎng)基上培養(yǎng)陽性結(jié)果為淋巴結(jié)33/33，膿腫6/6；在7H9液體培養(yǎng)基陽性結(jié)果為淋巴結(jié)22/33，膿腫6/6。培養(yǎng)物抗酸染色結(jié)果呈陽性，細(xì)菌形態(tài)與特性與卡介菌一致；培養(yǎng)物BCG RD1的檢測(cè)結(jié)果與卡介苗DNA國(guó)家參考品及皮內(nèi)注射用卡介苗特異性鑒別試驗(yàn)用國(guó)家參考品的擴(kuò)增結(jié)果一致(196 bp)。結(jié)論 卡介苗接種導(dǎo)致的淋巴結(jié)炎的相關(guān)標(biāo)本可以通過固體培養(yǎng)法培養(yǎng)出致病菌，對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行BCG RD1的檢測(cè)可以鑒定菌型?？ń槊绺邉┝棵庖?、選取腫大淋巴結(jié)作為檢查樣本和固體培養(yǎng)基培養(yǎng)法更有利于模型的建立。

卡介苗; 免疫; 淋巴結(jié)炎; 基因缺失; 診斷，鑒別

按國(guó)家《預(yù)防接種工作規(guī)范》[1]中疫苗接種程序規(guī)定，卡介苗(BCG)在嬰兒出生時(shí)即接種，通常在出生24 h內(nèi)完成。根據(jù)近年疫苗疑似預(yù)防接種異常反應(yīng)(adverse events following immunization，AEFI)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)分析，BCG接種后會(huì)出現(xiàn)一定程度的不良反應(yīng)。主要不良反應(yīng)為淋巴結(jié)炎，發(fā)生率為17.7/100萬劑～54.4/100萬劑，其中，嚴(yán)重不良反應(yīng)包括全身播散性卡介菌感染，其病死率高，預(yù)后差[2-5]。能夠準(zhǔn)確無誤地鑒定 BCG在臨床上具有重要意義，比如醫(yī)生如果可以準(zhǔn)確判斷得淋巴結(jié)炎的患者是因?yàn)锽CG接種所導(dǎo)致的并發(fā)癥，就可以確保由BCG接種引發(fā)異常反應(yīng)的患者及時(shí)得到國(guó)家醫(yī)療賠償[6]。

目前，臨床上對(duì)BCG接種后淋巴結(jié)炎及其他不良反應(yīng)的診斷主要是根據(jù)BCG接種史、X線胸部攝影、B超檢查輔助診斷，以及查看淋巴結(jié)及其膿液所含的菌株類型。其中對(duì)菌株的鑒定主要通過對(duì)針吸膿液和手術(shù)切除物等方法所得標(biāo)本進(jìn)行涂片觀察是否呈抗酸桿菌陽性，以及細(xì)菌培養(yǎng)并根據(jù)培養(yǎng)物對(duì)噻吩-2-羧酸肼(TCH)的敏感情況來判斷菌種是否為牛結(jié)核分枝桿菌[7]。如果菌種鑒定為牛結(jié)核分枝桿菌，則臨床上可以將其等同為BCG。雖然這一方法目前被有些學(xué)者認(rèn)為是臨床診斷由BCG接種所引發(fā)淋巴結(jié)炎的金標(biāo)準(zhǔn)[8-11]，但是，通過培養(yǎng)物對(duì)TCH的敏感性來辨別菌種是否為牛結(jié)核分枝桿菌存在敏感度低和假陽性率高的問題，因此這一方法在實(shí)質(zhì)上難以作為鑒定牛結(jié)核分枝桿菌的可靠依據(jù)[12-13]。此外，國(guó)際上對(duì)類似病例的病原菌鑒別多鑒定到BCG甚至BCG亞株[14-15]。分枝桿菌全基因組測(cè)序研究發(fā)現(xiàn)了不同分枝桿菌遺傳學(xué)上的差異，卡介菌與其他有毒分枝桿菌遺傳學(xué)上的差異研究，采用分子生物學(xué)方法來鑒別卡介菌與牛結(jié)核分枝桿菌及結(jié)核分枝桿菌[16-17]，但不能作為BCG接種后淋巴結(jié)炎及其他不良反應(yīng)的診斷依據(jù)。因此，這些問題是國(guó)內(nèi)目前在臨床上對(duì)于BCG接種所引發(fā)的不良反應(yīng)致病菌鑒定的主要局限。致病菌鑒定面臨以下3個(gè)問題：(1)培養(yǎng)方法標(biāo)準(zhǔn)化與檢出率問題；(2)牛結(jié)核分枝桿菌與結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定的方法學(xué)問題；(3)牛結(jié)核分枝桿菌與BCG菌種鑒定的方法學(xué)問題。

為了克服現(xiàn)有的這些局限，從而提高臨床上對(duì)BCG病菌鑒定的敏感度和準(zhǔn)確性，本研究旨在:(1)建立豚鼠模型來模擬人BCG接種導(dǎo)致的淋巴結(jié)炎；(2)利用該豚鼠模型來探索不同的體外培養(yǎng)方法對(duì)BCG病菌檢出率的影響；(3)驗(yàn)證利用現(xiàn)有分子生物學(xué)方法鑒定BCG特異性的可行性。

材料和方法

一、材料

1. 材料：BCG (D2PB302)、皮內(nèi)注射用卡介苗特異性鑒別試驗(yàn)用國(guó)家參考品(2014國(guó)生參字0055)、BCG DNA國(guó)家參考品(2014國(guó)生參字0053)[18]、改良羅氏培養(yǎng)基(L-J)、稀釋蘇通培養(yǎng)基由中國(guó)食品藥品檢定院提供。7H9液體培養(yǎng)基為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。引物：ET1：5′-AAGCGGTTGCCGCCGACCGACC-3′；ET2： 5′-CTGGCTATA-TTCCTGGGCCCGG-3′；ET3：5′-GAGGCGATCTGGCGGTTTGGGG-3′由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，Taq酶購(gòu)自Takara公司(日本)，抗酸染色試劑由中國(guó)食品藥品檢定院提供。7H11培養(yǎng)基購(gòu)自Sigma公司(美國(guó))。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：無特定病原體(specific pathogen free, SPF)級(jí)Hartley豚鼠，250～350 g/只，雌性，39只，由中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

二、 淋巴結(jié)炎動(dòng)物模型的建立

根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)選取Hartley豚鼠用于3個(gè)處理組：生理鹽水對(duì)照組(用作病理切片對(duì)照)3只，再分為3個(gè)時(shí)間點(diǎn)組(4周組、5周組、8周組)，每組1只；低劑量BCG接種組18只，再分為3個(gè)時(shí)間點(diǎn)組(4周組、5周組、8周組)，每組 6只；高劑量BCG接種組18只，再分為3個(gè)時(shí)間點(diǎn)組(4周組、5周組、8周組)，每組6只。分別于左后大腿內(nèi)側(cè)皮內(nèi)注射0.2 ml生理鹽水(對(duì)照)、0.2 ml 1人劑量(0.05 mg)BCG、0.2 ml 10人劑量(0.5 mg)BCG，然后于免疫后4、5、8周觀察和解剖注射部位側(cè)的腹股溝淋巴結(jié)及局部膿腫來查看淋巴結(jié)炎的狀況。

三、方法

1. 淋巴結(jié)和膿腫標(biāo)本的獲取和預(yù)處理：從注射側(cè)腹股溝解剖獲取淋巴結(jié)和從注射部位解剖獲取膿腫組織，將這些組織置于5%硫酸中浸泡約30 s，然后用生理鹽水洗滌3次，最后用稀釋蘇通培養(yǎng)基洗滌1次放入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)備用。

2. 淋巴結(jié)和膿腫標(biāo)本的研磨：將上述預(yù)處理過的標(biāo)本移入無菌玻璃研磨器內(nèi)，加入3 ml稀釋蘇通培養(yǎng)基進(jìn)行研磨獲取均勻組織懸液。

3. 細(xì)菌培養(yǎng)：將上述所得組織懸液用稀釋蘇通培養(yǎng)基進(jìn)行10倍系列稀釋，分別吸取原液及10倍系列稀釋液接種到3種不同的培養(yǎng)基上，其中改良羅氏培養(yǎng)基(8 ml中管規(guī)格)接種0.1～0.3 ml/支，7H11培養(yǎng)基(30 ml平皿規(guī)格)接種0.3～0.5 ml/個(gè)，7H9液體培養(yǎng)基(7.8 ml小管規(guī)格)接種0.5 ml/支。改良羅氏(L-J)培養(yǎng)基與7H11培養(yǎng)基置(37.5±0.5)℃培養(yǎng)4～5 周，觀察記錄長(zhǎng)出菌落的數(shù)量和所需時(shí)間。7H9液體培養(yǎng)基置BACTEC MGIT 960中培養(yǎng)，觀察48 d，觀察記錄報(bào)告陽性(簡(jiǎn)稱“報(bào)陽”)的數(shù)量和所需時(shí)間。隨機(jī)選取9例淋巴結(jié)樣本同時(shí)進(jìn)行L-J培養(yǎng)基和7H11培養(yǎng)基培養(yǎng)，觀察記錄兩種固體培養(yǎng)基培養(yǎng)出的菌落數(shù)。用Statistics 17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

4.抗酸染色：將組織懸液和培養(yǎng)物研磨液加入生理鹽水稀釋，取50 μl涂片，自然干燥火焰固定后進(jìn)行抗酸染色，顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)與特征。

5. PCR反應(yīng)模板制備：取培養(yǎng)物菌落，懸浮于無菌生理鹽水中，80 ℃ 30 min滅活后，6010×g離心10 min，棄上清，留下約20～40 μl液體重懸樣品，沸水浴10 min，6010×g離心10 min，取上清作為PCR反應(yīng)模板。

6．多重PCR擴(kuò)增(菌型鑒定)[19-20]：采用多重PCR法檢測(cè)卡介菌特異性缺失區(qū)1(RD1), 用國(guó)家參考品及BCG DNA國(guó)家參考品作為對(duì)照對(duì)皮內(nèi)注射用BCG進(jìn)行特異性鑒定，根據(jù)試驗(yàn)樣品擴(kuò)增片段大小與BCG及BCG DNA國(guó)家參考品是否一致作出判斷。

結(jié) 果

一、 淋巴結(jié)炎動(dòng)物模型建立結(jié)果

生理鹽水組3只豚鼠在注射后4周解剖1只分離出1枚淋巴結(jié)；注射后5周解剖1只分離出1枚淋巴結(jié)；注射后8周解剖1只分離出淋巴結(jié)。3只豚鼠均未見局部膿腫(圖1)。

高劑量組18只豚鼠在注射后4周解剖6只每只各分離出1枚淋巴結(jié)，均未見局部膿腫；在注射后5周解剖6只每只各分離出1枚淋巴結(jié)，其中有3只各分離出1個(gè)膿腫；在注射后8周解剖6只每只各分離出1枚淋巴結(jié)，其中有3只各分離出1個(gè)膿腫。分離出的淋巴結(jié)肉眼可見腫大、變硬，腫大的淋巴結(jié)包膜完整、質(zhì)地較柔軟(圖2)；變硬的淋巴結(jié)則表面充血(圖3)；膿腫尚未破潰，包膜完整(圖4)。

低劑量組18只豚鼠在注射后4周解剖6只每只各分離出1枚淋巴結(jié)；在注射后5周解剖6只其中有3只各分離出1枚淋巴結(jié)，另外3只未分離出淋巴結(jié)；在注射后8周解剖6只每只各分離出1枚淋巴結(jié)；18只豚鼠均未見局部膿腫。

圖1 生理鹽水組分離的淋巴結(jié)。依次為注射后4、5、8周時(shí)分離的淋巴結(jié)

圖2 BCG免疫高劑量組分離的腫大淋巴結(jié)。肉眼可見腫大、變硬，腫大的淋巴結(jié)包膜完整、但質(zhì)地較柔軟

圖3 BCG免疫高劑量組分離的淋巴結(jié)。其質(zhì)地變硬，表面充血淋巴結(jié)(肉眼可見表面充血)

圖4 BCG免疫高劑量組分離的局部膿腫

淋巴結(jié)病理切片結(jié)果： BCG高劑量注射組淋巴結(jié)表現(xiàn)為淋巴結(jié)皮質(zhì)內(nèi)大量上皮樣細(xì)胞灶狀聚集，可見多核巨細(xì)胞，肉芽腫中心可見干酪樣壞死區(qū)(圖5)。

淋巴結(jié)皮質(zhì)內(nèi)大量上皮樣細(xì)胞灶狀聚集，可見多核巨細(xì)胞，肉芽腫中心可見干酪樣壞死區(qū)圖5 BCG高劑量組淋巴結(jié)病理切片(HE ×100)

BCG低劑量注射組淋巴結(jié)表現(xiàn)為淋巴結(jié)皮質(zhì)內(nèi)大量上皮樣細(xì)胞灶狀聚集，可見多核巨細(xì)胞、上皮樣細(xì)胞彌漫性分布(圖6)。

淋巴結(jié)皮質(zhì)內(nèi)大量上皮樣細(xì)胞灶狀聚集，可見多核巨細(xì)胞、上皮樣細(xì)胞彌漫性分布圖6 BCG低劑量注射組淋巴結(jié)病理切片(HE ×100)

生理鹽水對(duì)照組淋巴結(jié)切片表現(xiàn)為淋巴結(jié)的皮質(zhì)、髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，淋巴結(jié)內(nèi)淋巴小結(jié)可見，髓質(zhì)內(nèi)淋巴竇及髓索結(jié)構(gòu)完整，淋巴濾泡未見明顯增生，未表現(xiàn)出病變(圖7)。

淋巴結(jié)的皮質(zhì)、髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，淋巴結(jié)內(nèi)淋巴小結(jié)可見，髓質(zhì)內(nèi)淋巴竇及髓索結(jié)構(gòu)完整，淋巴濾泡未見明顯增生，未表現(xiàn)出病變圖7 生理鹽水對(duì)照組淋巴結(jié)切片(HE ×100)

二、細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果

在L-J培養(yǎng)基上表現(xiàn)為有突起的皺型和擴(kuò)散型兩類菌落，呈淺黃色；在7H11培養(yǎng)基上表現(xiàn)為擴(kuò)散型扁平淺黃色菌落，細(xì)菌形態(tài)與卡介菌相似。接種于3種培養(yǎng)基的報(bào)陽結(jié)果見表1。

表1 樣本在3種培養(yǎng)基上培養(yǎng)的報(bào)陽結(jié)果

9枚淋巴結(jié)樣本在L-J培養(yǎng)基和7H11培養(yǎng)基上培養(yǎng)， L-J培養(yǎng)基陽性結(jié)果為淋巴結(jié)9/9、膿腫3/3，7H11培養(yǎng)基陽性結(jié)果為淋巴結(jié)9/9、膿腫3/3，見表2。對(duì)兩種固體培養(yǎng)基形成的菌落數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)兩組數(shù)據(jù)正態(tài)性，兩組數(shù)據(jù)均服從正態(tài)分布(L-J培養(yǎng)基菌落數(shù)P=0.172>0.05；7H11培養(yǎng)基菌落數(shù)P=0.089>0.05)；對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，t=0.804,P=0.440>0.05, L-J培養(yǎng)基和7H11培養(yǎng)基上培養(yǎng)生長(zhǎng)的菌落數(shù)沒有差異。

將組織懸液接種于L-J培養(yǎng)基、7H11培養(yǎng)基和7H9液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。L-J培養(yǎng)基和7H11培養(yǎng)基第4周開始有菌落長(zhǎng)出，第5周全部長(zhǎng)出菌落；7H9液體培養(yǎng)基第10天開始報(bào)陽，25 d后不再報(bào)陽。淋巴樣本平均報(bào)陽時(shí)間為13 d，膿腫樣本平均報(bào)陽時(shí)間為12 d。

表2 9枚淋巴結(jié)樣本在固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基上的細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果

注 CFU：菌落形成單位(colony-forming units)

取組織研磨液直接進(jìn)行涂片，做抗酸染色實(shí)驗(yàn)，顯微鏡下未觀察到抗酸陽性分枝桿菌。將固體培養(yǎng)物與液體培養(yǎng)物涂片后進(jìn)行抗酸染色，顯微鏡下觀察可見聚集成團(tuán)與分散的抗酸陽性桿菌，細(xì)菌形態(tài)及特征與分枝桿菌一致。

三、培養(yǎng)菌菌型鑒定結(jié)果

將不同標(biāo)本來源培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行卡介菌特異性RD1檢測(cè)試驗(yàn)，可見：淋巴結(jié)培養(yǎng)物與膿腫培養(yǎng)物經(jīng) PCR反應(yīng)后，均擴(kuò)增出一條約200 bp的核酸片段，大小與皮內(nèi)注射用卡介苗特異性鑒別用國(guó)家參考品及BCG DNA 國(guó)家參考品結(jié)果一致，說明培養(yǎng)物為卡介菌(圖8)。

1～7為淋巴結(jié)樣品；a、b、c為膿腫樣本。M:50 bp DNA梯狀圖譜； C1: 卡介苗對(duì)照品； C2：BCG DNA 國(guó)家參考品； C: 試劑對(duì)照?qǐng)D8 培養(yǎng)物卡介苗菌型鑒定結(jié)果

討 論

BCG接種后不良反應(yīng)較多，輕者表現(xiàn)為淋巴結(jié)炎、局部膿腫；重者形成膿腫破潰、播散性骨髓炎、全身播散性卡介菌病等。目前，臨床上對(duì)BCG不良反應(yīng)診斷主要根據(jù)BCG的接種史判斷，對(duì)于病原學(xué)鑒定通常以發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌、培養(yǎng)陽性后以其對(duì)對(duì)硝基苯甲酸(PNB)與TCH的敏感情況進(jìn)行菌種鑒定[7]，通常鑒定到牛結(jié)核分枝桿菌。

BCG 是由牛結(jié)核分枝桿菌經(jīng)過 230 代傳種后獲得的減毒菌株，具體表現(xiàn)為失去了致病性，保留了免疫原性，究其本質(zhì)是在傳代過程中丟失了毒力編碼基因，與結(jié)核分枝桿菌的基因組比較，BCG 菌株的基因組可找到 16 個(gè)長(zhǎng)度 1903～12 733 bp 不等的缺失區(qū)域(regions of difference，RD)，這些區(qū)域被依次命名為RD1～RD16[21]，其中 RD1 是一個(gè)很特殊的片段，這個(gè)片段只存在于有毒分枝桿菌中(包括結(jié)核分枝桿菌與牛結(jié)核分枝桿菌)，但在所有 BCG 亞株共同缺失。RD1 片段全長(zhǎng)為 9458 bp，基于 RD1 區(qū)所設(shè)計(jì)的 3 條引物，其中 ET1 和 ET3跨越 RD1 區(qū)，位于 RD1 區(qū)兩側(cè)，而引物 ET2 則位于 RD1 區(qū)內(nèi)。當(dāng)菌株缺失RD1 區(qū)時(shí)，兩側(cè)引物結(jié)合，擴(kuò)增將得到一條約 200 bp 長(zhǎng)度的片段；若菌株存在RD1 區(qū)時(shí)，兩側(cè)引物雖然結(jié)合但是由于產(chǎn)物過長(zhǎng)不能有效擴(kuò)增，而 ET3 和 ET2結(jié)合擴(kuò)增生成1條 150 bp 長(zhǎng)度的片段。擴(kuò)增產(chǎn)物為 200 bp 左右為 BCG，為 150 bp 左右為有毒的分枝桿菌復(fù)合群，其他分枝桿菌無擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)。這個(gè)基因水平上的特點(diǎn)將卡介菌與牛型分枝桿菌及其他分枝桿菌復(fù)合群區(qū)分開來。通過檢測(cè) RD1 區(qū)的存在與否，可以特異性的鑒別 BCG[22-23]。根據(jù)BCG基因組的特點(diǎn)，世界衛(wèi)生組織已經(jīng)推薦采用分子生物學(xué)的方法(如 PCR 方法)來特異性鑒別BCG；同時(shí) 2015 版中國(guó)藥典，對(duì)BCG的質(zhì)量控制也增加了分子生物學(xué)特異性鑒別方法，相比于早期采用的抗酸染色鑒別方法，克服了僅從形態(tài)上來鑒別BCG無專屬性的缺陷，該方法已用卡介菌多糖核酸注射液的鑒別[18-19,24-25]。

臨床上 BCG 不良反應(yīng)病原菌的特異性鑒定，對(duì)于病因診斷、醫(yī)患糾紛的解決，以及后續(xù)治療都有積極的意義，國(guó)際上對(duì)類似病例的病原菌鑒別多鑒別到BCG 甚至 BCG 亞株[14-15]，國(guó)內(nèi)則鑒別不多，或僅鑒定到牛結(jié)核分枝桿菌。

本研究建立動(dòng)物 BCG 接種后不良反應(yīng)模型，對(duì) BCG 高劑量組 18 只豚鼠解剖均獲取腫大淋巴結(jié)，且有 6 只出現(xiàn)局部膿腫，BCG 低劑量組 18 只豚鼠解剖有 15 只獲取腫大淋巴結(jié)，但均未出現(xiàn)局部膿腫。對(duì)接種后淋巴結(jié)及局部膿腫進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，固體培養(yǎng)基培養(yǎng)法培養(yǎng)結(jié)果全為陽性，且長(zhǎng)出的菌落數(shù)量無差異，但需要 4～5 周 時(shí)間；液體培養(yǎng)法陽性結(jié)果為淋巴結(jié) 22/33、膿腫 6/6，平均耗時(shí)淋巴結(jié)培養(yǎng)物13 d、膿腫培養(yǎng)物12 d，最長(zhǎng)為25 d。培養(yǎng)物采用中國(guó)藥典規(guī)定的BCG 特異性鑒別方法均鑒定為 BCG，與皮內(nèi)注射用 BCG 特異性鑒別試驗(yàn)用國(guó)家參考品及 BCG DNA 國(guó)家參考品的結(jié)果一致。通過本研究可發(fā)現(xiàn)，BCG高劑量免疫、選取腫大淋巴結(jié)作為檢查樣本和固體培養(yǎng)基培養(yǎng)更有利于模型的建立。

BCG 低劑量組有 3 只豚鼠解剖未獲取淋巴結(jié)，可能由于人為原因未能找到淋巴結(jié)或解剖過程中淋巴結(jié)破損。組織研磨液直接進(jìn)行涂片未有陽性結(jié)果，可能原因是標(biāo)本處理方法不當(dāng)，直接用組織研磨的標(biāo)本涂片，標(biāo)本涂片厚，染色時(shí)容易引起標(biāo)本脫落，或者蛋白太多，鏡下不容易看到。

本研究所采用的方法對(duì)于臨床實(shí)踐可能不是最簡(jiǎn)單、最方便、最好的鑒定方法，但希望為 BCG 臨床不良反應(yīng)病原菌分離、鑒別的標(biāo)準(zhǔn)化提供研究基礎(chǔ)。

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(本文編輯：范永德)

Isolation and identification of pathogens in lymphadenitis of Guinea pigs caused by BCG vaccination

WANGDing-ding*,FULi-li,KOULi-jie,ZHANGTing,DONGQiao-xiang,ZHAOAi-hua.

*InstituteofEnvironmentalSafetyandHumanHealth,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325000,China

s：ZHAOAi-hua,Email:tbtestlab@nifdc.org.cn；DONGQiao-xiang,Email:dqxdong@163.com

Objective To establish a model of isolation and identification pathogens of lymphadenitis caused by BCG vaccination of Guinea pigs and provide a method for etiological identification in clinical diagnosis with adverse reactions caused by BCG vaccination. Methods Thirty-nine Guinea pigs were divided into 3 groups according to random number table method: normal saline group (3 Guinea pigs), high dose of BCG vaccine and low dose of BCG vaccine groups (each 18 Guinea pigs). Lymph glands and local abscess were obtained from Guinea pigs 4, 5 and 8 weeks after injected by normal saline and BCG and were homogenized. The homogenates was cultured in L-J culture medium, 7H11 medium plate and 7H9 liquid medium. Meanwhile, the homogenates were detected by acid-fast staining and specific detecting of BCG RD1. After culturing, the 3 kinds of cultured pathogens were also detected by acid-fast staining and specific detecting of BCG RD1. Results The positive results of the cultured homogenates were lymph gland 33/33 and local abscess 6/6 in L-J culture medium, lymph gland 33/33 and local abscess 6/6 in 7H11 medium plate, lymph gland 22/33 and local abscess 6/6 in 7H9 liquid medium. All cultured pathogens showed positive results by acid-fast staining and the bacterial morphs of the detected pathogens were same to BCG. The specific detecting of BCG RD1 of the cultured pathogens was consistent with national references of BCG DNA and BCG controls (196 bp). Conclusion Pathogens can be detected from BCG immunized lymphadenitis samples by pathogenic bacterium using solid culture method. Subtype of bacteria can be identified by specific detecting of RD1 of BCG. High dose of BCG，selection of lymph glands as the tested sample and cultured in solid culture medium were more beneficial to establish the model.

BCG； Vaccination, Lymphadenitis； Gene deletion； Diagnosis,differential

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.03.011

“十二五”國(guó)家科技重大專項(xiàng)(2012ZX10004701)

325000 溫州醫(yī)科大學(xué)環(huán)境安全與健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究院(王丁丁、董巧香)；中國(guó)食品藥品檢定研究院結(jié)核病疫苗室(付麗麗、寇麗杰、張婷、趙愛華)

趙愛華，Email: tbtestlab@nifdc.org.cn；董巧香，Email: dqxdong@163.com

2015-08-13)

注：王丁丁和付麗麗對(duì)本研究有同等貢獻(xiàn)，為并列第一作者