王慧琳 王偉 劉京銘 李傳友 高孟秋

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趨化因子5和趨化因子受體5基因多態(tài)性與肺結(jié)核易感性的關(guān)系

王慧琳 王偉 劉京銘 李傳友 高孟秋

目的 探討趨化因子5(CCL5)及趨化因子受體5(CCR5)基因多態(tài)性與肺結(jié)核(pulmonary tuberculosis, PTB)易感性的關(guān)系。方法 選取2014年2月至2015年4月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院收治的PTB患者作為病例組，共494例；選取413名健康志愿者作為對(duì)照組。采集研究對(duì)象靜脈血，使用競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR方法檢測(cè)其CCL5啟動(dòng)子區(qū)rs2107538和CCR5啟動(dòng)子區(qū)rs1799987基因型，計(jì)算病例組和對(duì)照組的基因型及等位基因頻率，并對(duì)其分布情況進(jìn)行比較，分析各基因多態(tài)性與PTB患病的相關(guān)性。結(jié)果 CCL5啟動(dòng)子區(qū)rs2107538基因-403位點(diǎn)GG、GA、AA基因型及等位基因G、A的頻次和頻率病例組分別為：202(41%)、224(45%)、68(14%)和628(64%)、360(36%)；對(duì)照組分別為：152(38%)、209(51%)、52(13%)和513(62%)、313(38%)，兩組之間基因型分布和等位基因分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為2.50和0.35，P值均>0.05)。CCR5啟動(dòng)子區(qū)rs1799987基因-2459位點(diǎn)AA、AG、GG基因型及等位基因A、G的頻次和頻率病例組分別為：99(20%)、272(55%)、123(25%)和470(48%)、518(52%)；對(duì)照組分別為：67(16%)、210(51%)、136(33%)和344(42%)、482(58%)，兩組之間基因型分布和等位基因分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為7.62和6.14，P值均<0.05)。攜帶該位點(diǎn)基因型GG和等位基因G可降低PTB患病風(fēng)險(xiǎn)[OR(95%CI)值分別為：0.68(0.50～0.91)、0.78(0.64～0.94)]。結(jié)論 CCL5啟動(dòng)子區(qū)rs2107538基因多態(tài)性與PTB患病無(wú)相關(guān)性；攜帶CCR5啟動(dòng)子區(qū)rs1799987基因-2459位點(diǎn)基因型GG和等位基因G可降低PTB患病風(fēng)險(xiǎn)。

趨化因子類； 多態(tài)性，單核苷酸； 結(jié)核，肺； 疾病易感性

肺結(jié)核(pulmonary tuberculosis, PTB)是Mtb感染引起的慢性傳染性疾病。目前，全球約有1/3的人感染了Mtb，但僅有5%～10%發(fā)展為PTB[1]，這表明PTB發(fā)病存在個(gè)體差異。Mtb感染引起免疫應(yīng)答時(shí)，趨化因子及其受體調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞到達(dá)感染部位。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，含有Mtb氣溶膠吸入人體后，通過(guò)形成特征性肉芽腫及多種免疫細(xì)胞間的相互作用，可有效控制其感染[2]，而這一過(guò)程中趨化因子5(CCL5)起重要作用。CCL5優(yōu)先通過(guò)與受體趨化因子受體5(CCR5)結(jié)合[3]，募集γ-干擾素(IFN-γ)、抗原特異性T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞等到達(dá)炎癥組織，促進(jìn)肉芽腫形成[2]。CCL5啟動(dòng)子區(qū)rs2107538基因突變和CCR5啟動(dòng)子區(qū)rs1799987基因突變影響其轉(zhuǎn)錄活性[4-5]，與PTB易感性可能存在一定關(guān)系。目前，以上2個(gè)基因位點(diǎn)多態(tài)性與PTB易感性相關(guān)性報(bào)道較少，值得進(jìn)一步研究。本研究應(yīng)用快速、簡(jiǎn)便的競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR (kompetitive allele specific PCR，KASP)分型技術(shù)，探討CCL5的rs2107538及CCR5的rs1799987基因型和等位基因在PTB人群與健康人群中分布情況，分析其基因多態(tài)性與PTB易感性的關(guān)系。

資料和方法

1.對(duì)象：選取2014年2月至2015年4月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院收治的確診PTB患者(有細(xì)菌學(xué)證據(jù)者)和臨床診斷PTB患者(無(wú)細(xì)菌學(xué)證據(jù)，有影像學(xué)證據(jù)、可疑臨床癥狀，并排除其他肺部疾病者)作為病例組，共494例。所有患者均符合診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，排除癌癥患者、糖尿病患者、長(zhǎng)期使用免疫抑制劑者及HIV感染免疫功能低下者。選取2014年2月至2015年4月胸科醫(yī)院查體確診既往無(wú)結(jié)核病史，胸部X線攝片檢查未見(jiàn)異常，結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)硬結(jié)平均直徑小于5 mm，結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)結(jié)果陰性的健康志愿者作為對(duì)照組，共413名。排除兩組中存在血緣關(guān)系者。

研究對(duì)象中病例組494例，包括男300例(60.7%)，女194例(39.3%)；平均年齡為(35.0±15.0)歲，均為漢族；其中，確診PTB患者213例，臨床診斷PTB患者281例。對(duì)照組共413名，包括男240名(58.1%)，女173名(41.9%)；均為漢族，平均年齡為(33.9±12.8)歲。病例組和對(duì)照組年齡和性別構(gòu)成差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.13，χ2=0.54，P值均>0.05)，具有可比性。本研究已獲得首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院科研倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

2.DNA提取：采集研究對(duì)象外周靜脈血2 ml，應(yīng)用全血試劑盒(購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司)提取基因組DNA。DNA提取質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：紫外分光光度計(jì)吸光度值A(chǔ)260/280值在1.8～2.0之間。

3.基因分型：采用KASP試劑盒(購(gòu)自英國(guó)LGC有限公司)。使用試劑盒推薦的PCR反應(yīng)體系，應(yīng)用ABI7500實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行基因分型。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)熱15 min，10個(gè)循環(huán)的降落PCR(94 ℃ 20 s、65 ℃ 25 s、每個(gè)循環(huán)降落0.6 ℃)、26個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增PCR(94 ℃ 20 s、55 ℃ 60 s)，若基因分型較分散，則通過(guò)增加循環(huán)數(shù)，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行調(diào)整。數(shù)據(jù)分析讀取采用ABI7500系統(tǒng)軟件。引物是由美國(guó)Invitrogen公司合成，序列見(jiàn)表1。使用ABI7500實(shí)時(shí)定量PCR儀讀取基因分型結(jié)果。讀取每個(gè)樣本等位基因所對(duì)應(yīng)的FAM和HEX熒光信號(hào)，形成等位基因分型圖，從而判定待測(cè)樣本基因型結(jié)果。

表1 趨化因子5啟動(dòng)子區(qū)rs2107538基因及趨化因子受體5啟動(dòng)子區(qū)rs1799987基因擴(kuò)增引物序列

4.質(zhì)量控制：在基因分型時(shí)，每96孔板中設(shè)置2個(gè)不同基因型已知樣本作為陽(yáng)性對(duì)照，1～2個(gè)陰性對(duì)照進(jìn)行質(zhì)量控制。陽(yáng)性對(duì)照是由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序，rs2107538測(cè)序結(jié)果如圖1，rs1799987測(cè)序結(jié)果如圖2。

a為基因型CC；b為基因型CT圖1 趨化因子5啟動(dòng)子區(qū)rs2107538基因擴(kuò)增片段測(cè)序結(jié)果

a為基因型AA；b為基因型AG圖2 趨化因子受體5啟動(dòng)子區(qū)rs1799987基因擴(kuò)增片段測(cè)序結(jié)果

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用R2.11.1軟件進(jìn)行分析。病例組與對(duì)照組研究對(duì)象年齡的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；性別構(gòu)成的比較采用χ2檢驗(yàn)。分析各位點(diǎn)基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg(HWE)遺傳平衡，計(jì)算病例組與對(duì)照組各基因型和等位基因的頻數(shù)及頻率，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異的比較，并計(jì)算OR(95%CI)值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.Hardy-Weinberg平衡分析：使用R2.11.1軟件中HWE計(jì)算公式對(duì)兩個(gè)基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)位點(diǎn)基因型頻數(shù)進(jìn)行計(jì)算，發(fā)現(xiàn)rs2107538和rs1799987基因型頻率在對(duì)照組分布均符合遺傳平衡(P>0.05)，提示選取的對(duì)照組具有群體代表性。

2.基因多態(tài)性分析：結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病例組和對(duì)照組CCL5啟動(dòng)子區(qū)rs2107538基因型頻率與等位基因頻率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CCR5啟動(dòng)子區(qū)rs1799987等位基因頻率和基因型頻率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，攜帶基因型GG和等位基因G可以降低PTB患病風(fēng)險(xiǎn)，而攜帶等位基因A則會(huì)增加PTB患病風(fēng)險(xiǎn)，見(jiàn)表2。

表2 趨化因子5啟動(dòng)子區(qū)rs2107538基因和趨化因子受體5啟動(dòng)子區(qū)rs1799987基因多態(tài)性分析結(jié)果

注 表中括號(hào)外數(shù)值為“頻數(shù)”，括號(hào)內(nèi)數(shù)值為“頻率(%)”

討 論

PTB是嚴(yán)重危害人類健康的全球公共衛(wèi)生問(wèn)題，也是我國(guó)重點(diǎn)防控的疾病之一。PTB發(fā)病是環(huán)境因素和宿主遺傳因素共同作用的結(jié)果。以往研究發(fā)現(xiàn)，CCL5及其受體在抗Mtb感染過(guò)程中起重要作用：(1)CCL5與特征性肉芽腫形成有關(guān)。Chensue等[7]在感染Mtb的小鼠中發(fā)現(xiàn)高濃度的CCL5與肉芽腫形成有關(guān)，抗CCL5藥物應(yīng)用使肉芽腫成分改變和形成減少，CCL5敲除小鼠無(wú)抗原提呈細(xì)胞或趨化因子受體陽(yáng)性T細(xì)胞到達(dá)肉芽腫組織[8]。(2)在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)CCL5可以有效抑制Mtb在巨噬細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)[9]。(3)CCL5趨化T細(xì)胞、單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)移至炎癥部位[9-10]。Mtb感染時(shí)，CCL5蛋白優(yōu)先選擇與CCR5受體結(jié)合發(fā)揮免疫學(xué)效應(yīng)。Mtb感染CCR5敲除小鼠后，其早期抗菌能力較野生型小鼠明顯下降[2]，形成的肉芽腫中淋巴細(xì)胞、髓細(xì)胞數(shù)目增加，同時(shí)IFN-γ、誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(NOS2)、重組人白細(xì)胞介素-12(IL-12)等細(xì)胞因子增加，這些成分可有效控制Mtb感染[11]。Pokkali和Das[3]發(fā)現(xiàn)，PTB患者細(xì)胞表面的CCR5水平明顯高于健康組。CCL5蛋白表達(dá)基因位于17q11，長(zhǎng)約8 kb，位于啟動(dòng)子區(qū)rs2107538的A等位基因與CCL5低表達(dá)呈正相關(guān)[12]。CCR5蛋白表達(dá)基因定為3q21.3，長(zhǎng)約1.9 kb，包含4個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，啟動(dòng)子中-2459A/G突變調(diào)整其轉(zhuǎn)錄活性影響蛋白表達(dá)[5]。

本研究未發(fā)現(xiàn)CCL5啟動(dòng)子區(qū)rs2107538基因-403 G/A多態(tài)性與PTB易感性的相關(guān)，與相關(guān)報(bào)道一致[13-16]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在西班牙北部人群中，等位基因G是結(jié)核病保護(hù)性因素[17]；在印度人群中，基因型AA是罹患結(jié)核病的危險(xiǎn)因素[17]。不同地區(qū)研究結(jié)果不一致可能與種族、研究對(duì)象數(shù)量及納入排除標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)。推測(cè)本研究未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性的原因可能是：(1)CCL5基因啟動(dòng)子含有多個(gè)調(diào)控基因，rs2107538可能是與其他調(diào)控基因共同調(diào)節(jié)。例如，在中國(guó)香港人群?jiǎn)为?dú)研究rs2107538、-28C/G和內(nèi)含子Inl.1T/C時(shí)未發(fā)現(xiàn)其與PTB易感性的關(guān)系，而對(duì)其單倍體研究時(shí)發(fā)現(xiàn)A-C-T和G-C-C可增加結(jié)核病患病風(fēng)險(xiǎn)，且-28C/G和Inl.1T/C的基因型組合GA/TT和GG/TC與結(jié)核病易感性明顯相關(guān)[13]。(2)機(jī)體通過(guò)復(fù)雜的免疫系統(tǒng)調(diào)控結(jié)核病，CCL5僅是其中一環(huán)，還可被其他趨化因子或通路代償。在CCL5敲除小鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，CCL5表達(dá)缺乏未改變?nèi)庋磕[的形成，僅在早期影響了肉芽腫發(fā)展，中晚期CCL5敲除小鼠肺部形成的肉芽腫反而比野生型小鼠更大更多[8]。

同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)CCR5啟動(dòng)子區(qū)rs1799987基因-2459 A/G多態(tài)性與PTB易感性相關(guān)。其中，攜帶基因型GG和等位基因G可以降低PTB患病風(fēng)險(xiǎn)。Mamtani等[19]在哥倫比亞成年人群中研究也發(fā)現(xiàn)，攜帶rs1799987 G等位基因的HH-單倍體群(包括-2733 A/G, -2554 G/T, -2459 G/A, -2135 T/C, -2132 C/T, -2086 A/G, and -1835 C/T)與PTB易感性相關(guān)。CCR5啟動(dòng)子區(qū)rs1799987基因在對(duì)照組中的突變頻率為58%，與南美有色人種(52%)及非洲科薩人(62.5%)相似，遠(yuǎn)高于秘魯人(34%)[20]，說(shuō)明此位點(diǎn)存在種族、地域差異，因此該位點(diǎn)基因多態(tài)性與PTB易感性在不同地區(qū)不同民族可能存在一定差異。

綜上所述，本次研究未發(fā)現(xiàn)CCL5啟動(dòng)子區(qū)rs2107538基因多態(tài)性與中國(guó)漢族PTB發(fā)病相關(guān)，其基因多態(tài)性可能不是影響PTB發(fā)病的重要因素；發(fā)現(xiàn)CCR5啟動(dòng)子區(qū)rs1799987基因多態(tài)性與PTB發(fā)病易感性相關(guān)，攜帶基因型GG和等位基因G是PTB患病的保護(hù)基因，攜帶等位基因A是PTB患病的危險(xiǎn)因素。CCR5基因多態(tài)性在PTB發(fā)生的具體調(diào)控機(jī)制、調(diào)控過(guò)程中是否與配體或受體相互作用還需進(jìn)一步探討。PTB的發(fā)病是多因素共同作用的結(jié)果，本研究受研究對(duì)象數(shù)量、地域、種族等多種因素影響，結(jié)果有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

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(本文編輯：李敬文)

Relationship between polymorphism of CCL5 gene and CCR5 gene and susceptibility of pulmonary tuberculosis

WAGNHui-lin,WANGWei,LIUJing-ming,LIChuan-you,GAOMeng-qiu.

BeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity;BeijingTuberculosisandThoracicTumorResearchInstitute;BacteriaImmunologyLaboratory,BeijingKeyLaboratoryofDrug-resistantTuberculosisResearch,Beijing101149,China

Correspongdingauthor:GAOMeng-qiu，Email:gaomqwdm@aliyun.com

Objective To study the relationship between CCL5, CCR5 gene polymorphism and susceptibility of pulmonary tuberculosis (PTB). Methods A total of 494 PTB patients from Beijing Chest Hospital, Capital Medical University from February 2014 to April 2015 were selected as case group. Of 413 healthy volunteers were selected as a control group. By collecting venous blood, the single nucleotide polymorphisms (SNPs) ofrs2107538 in CCL5 promoter region andrs1799987 in CCR5 promoter region were detected using competitive allele-specific PCR SNPline program. The genotype and allele frequencies for the SNPs were calculated for case group and control group separately in order to analyze the relationship between CCL5, CCR5 gene polymorphism and susceptibility of PTB. Results For the SNP ofrs2107538 in CCL5, the frequencies for genotype GG, GA, AA and allele G, A were 202 (41%), 224 (45%), 68 (14%), and 628 (64%), 360 (36%) in case group; 152 (38%), 209 (51%), 52 (13%), and 513 (62%), 313 (38%) in control group. There was no statistically significant difference in genotype and allele frequencies between the two groups (χ2=2.50, 0.35, allPvalues >0.05). For the SNP ofrs1799987 in CCR5, the genotype GG, GA, AA and allele G, A frequencies were 99 (20%), 272 (55%), 123 (25%) and 470 (48%), 518 (52%) in case group; 67 (16%), 210 (51%), 136 (33%) and 344 (42%), 482 (58%) in control group. The differences in genotype and allele frequencies between the two groups were statistically significant (χ2=7.62 for genotype frequencies,χ2=6.14 for allele frequencies, allPvalues <0.05). The GG genotype or G allele ofrs1799987 in CCR5 may reduce the risk of PTB (OR(95%CI)：0.68 (0.50-0.91), 0.78(0.64-0.94)). Conclusion There was no correlation betweenrs2107538 polymorphism in CCL5 and susceptibility of PTB. The GG genotype or G allele ofrs1799987 in CCR5 promoter region may reduce the risk of PTB.

Chemotactic factors; Polymorphism, single nucleotide； Tuberculosis, pulmonary； Disease susceptibility

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.03.008

北京市醫(yī)院管理局臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展專項(xiàng)(ZYLX201304)

101149 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院 北京結(jié)核病胸部腫瘤研究所 耐藥結(jié)核病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌免疫學(xué)研究室(王慧琳、王偉、劉京銘、李傳友)；首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院結(jié)核二科(高孟秋)

高孟秋，Email：gaomqwdm@aliyun.com

2015-11-23)