羅志軍　陳杏綺　王和庚　田舉

528403　廣東省中山市人民醫(yī)院燒傷整形科

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·論著·

自體富血小板血漿聯(lián)合低分子肝素對吸入性損傷大鼠治療效果的研究

羅志軍陳杏綺王和庚田舉

528403廣東省中山市人民醫(yī)院燒傷整形科

【摘要】目的探討自體富血小板血漿(PRP)聯(lián)合低分子肝素(LMWH)治療吸入性損傷大鼠的治療效果。方法選取SPF級健康雄性Wistar大鼠48只，隨機分為正常組、模型組、單用組、聯(lián)合組，每組12只，模型組、單用組和聯(lián)合組均建立煙霧吸入性損傷大鼠模型，模型組、正常組氣管內(nèi)滴入0.9%氯化鈉溶液，單用組致傷后氣管內(nèi)滴注PRP液、聯(lián)合組致傷后氣管內(nèi)滴注PRP和LMWH混合液。結果模型組、單用組、聯(lián)合組的肺組織含水量顯著的高于正常組(P<0.05)，聯(lián)合組的肺組織含水量顯著的低于模型組和單用組(P<0.05)； 模型組、單用組、聯(lián)合組的血清TNF-α、IL-6、IL-1β、PDGF顯著高于正常組(P<0.05)，聯(lián)合組的血清TNF-α、IL-6、IL-1β、PDGF顯著的低于模型組和單用組(P<0.05)；模型組、單用組、聯(lián)合組的肺組織Brdu免疫組化陽性標記指數(shù)顯著的高于正常組(P<0.05)，聯(lián)合組的肺組織Brdu免疫組化陽性標記指數(shù)顯著的高于模型組和單用組(P<0.05)。結論PRP聯(lián)合LMWH治療吸入性損傷大鼠能夠顯著的減輕肺水腫及炎性反應。

【關鍵詞】自體富血小板血漿；低分子肝素；吸入性損傷；治療結果

吸入性損傷作為一種兼有熱力及化學物質的損傷，多見于封閉的火災現(xiàn)場，由于吸入性損傷具有隱蔽性及嚴重性，是導致火災死亡的主要原因之一[1]。自體富血小板血漿(PRP)內(nèi)含有多種能促進組織修復和再生的生長因子，血小板衍生因子(PDGF)和轉化生長因子-β(TGF-β1)制成凝膠狀后，可用于修補組織缺損，并在局部能較長時間保持較高的生長因子濃度[2]。低分子肝素具有抑制炎癥、調節(jié)免疫、抗凝以及改善微循環(huán)等多種作用。本研究對PRP聯(lián)合低分子肝素(LMWH)治療吸入性損傷大鼠的治療效果進行探討，報告如下。

1材料與方法

1.1實驗動物選取SPF級健康雄性Wistar大鼠48只，隨機分為正常組、模型組、單用組、聯(lián)合組，每組12只。體重200～250 g，平均體重(221±11)g；喂養(yǎng)于光照12 h、相對濕度40%～60%、溫度23～25℃、自由進食進水的環(huán)境中。

1.2造模方法100 g干燥的松木木屑以及約30 ml煤油混勻，制作成發(fā)煙材料后以鐵制器皿盛裝放于高壓鍋內(nèi)電爐上，接通電源并預熱15 ～20 min，使鍋內(nèi)溫度逐漸上升到85～90℃?？刂茻熛涞臏囟仍?0℃左右，將大鼠放入煙箱內(nèi)。按下放煙鍵，使煙箱內(nèi)充滿煙霧，大鼠自行吸入煙霧10 min后取出，間隔2 min后再次放入10 min后觀察情況。傷后大鼠自由攝食飲水。

1.3實驗方法4組大鼠氣管內(nèi)滴入的液體總量為2 ml/kg，4組大鼠分別于致傷72 h后取右肺做肺組織干濕比，左肺做組織病理切片和BrdU免疫組化觀察肺上皮細胞的增生情況。模型組、正常組氣管內(nèi)滴入0.9%氯化鈉溶液，單用組致傷后氣管內(nèi)滴注PRP液、聯(lián)合組致傷后氣管內(nèi)滴注PRP和LMWH混合液。4組鼠于傷后8 h腹腔內(nèi)注射Brdu 100 mg/kg，72 h后活殺，取右肺稱重后置于80℃的恒溫烤箱中48 h取出，肺含水量=(肺濕重-肺干重)/肺干重；取左肺置于10%的甲醛溶液中固定，石蠟包埋并制成切片后，加入Brdu單克隆抗體以及生物素化山羊抗小鼠抗IgG，DAB顯色后使用顯微鏡進行觀察，細胞溶膠中出現(xiàn)棕黃色物質且其染色強度高于背景的非特異性染色者為陽性細胞。

1.4觀察指標對比4組實驗動物大鼠肺組織的含水量、肺組織中Brdu免疫組化陽性標記數(shù)(陽性標記指數(shù)=陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%)、血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-1β(IL-1β)、PDGF的水平差異。

1.5檢測方法IL-6、IL-1β、TNF-α的測定采用酶聯(lián)免疫吸附法，試劑盒為美國RB生物技術有限公司生產(chǎn)，操作方法嚴格按照說明書進行。PDGF的檢測采用免疫比濁法，試劑盒由廣州恒升科技實業(yè)有限公司生產(chǎn)，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

2結果

2.1病理學觀察正常組大鼠的肺組織HE染色病理學觀察可見肺泡完整、光滑、無炎癥細胞及紅細胞聚集浸潤；模型組大鼠可見肺泡壁增生、破裂破壞嚴重，肺泡內(nèi)大量的炎癥細胞浸潤、紅細胞大量聚集；單用組和聯(lián)合組的肺泡破壞程度顯著的減輕較模型組，同時炎癥細胞浸潤、紅細胞聚集現(xiàn)象減少。見圖1。

正常組模型組單用組聯(lián)合組

圖14組大鼠肺組織病理觀察(HE×200)

2.24組大鼠肺組織含水量測定模型組、單用組、聯(lián)合組的肺組織含水量顯著的高于正常組(P<0.05)，聯(lián)合組的肺組織含水量顯著低于模型組和單用組(P<0.05)。見表1。

表14組大鼠肺組織含水量測定

組別肺組織含水量F值P值正常組3.389±0.88719.863<0.05模型組6.704±1.392*單用組5.118±0.925*聯(lián)合組4.096±0.895*#△

注：與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05；與單用組比較，△P<0.05

2.34組大鼠血清細胞因子水平測定模型組、單用組、聯(lián)合組的血清TNF-α、IL-6、IL-1β、PDGF顯著高于正常組(P<0.05)，聯(lián)合組的血清TNF-α、IL-6、IL-1β、PDGF顯著低于模型組和單用組(P<0.05)。見表2。

表2　4組大鼠肺血清細胞因子水平測定　±s

注：與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05；與單用組比較，△P<0.05

2.44組大鼠肺組織Brdu免疫組化陽性標記指數(shù)比較模型組、單用組、聯(lián)合組的肺組織Brdu免疫組化陽性標記指數(shù)顯著高于正常組(P<0.05)，聯(lián)合組的肺組織Brdu免疫組化陽性標記指數(shù)顯著高于模型組和單用組(P<0.05)。見表3。

3討論

吸入性損傷后，由于煙霧產(chǎn)生的熱力及化學物質顆粒導致氣道黏膜及肺毛細血管內(nèi)皮細胞損傷的直接損傷，但吸入性損傷導致的肺毛細血管微血栓形成，血管通透性增加以及大量液體外滲引起的肺水腫，可直接影響肺內(nèi)血氧交換，進而導致低氧血癥以及急性肺損傷，嚴重可導致急性呼吸窘迫綜合征[3，4]。吸入性損傷后，大量異物顆粒被吸入并造成血管內(nèi)皮的損傷，肺臟處于高凝狀態(tài)，并產(chǎn)生大量的凝血酶進而誘導血小板活化因子、E-選擇素及P-選擇素的表達，進而促進血小板及中性粒細胞的黏附和聚集，進而促進炎癥的進一步加重[5]。早期炎性反應中，TNF-α、IL-6等炎性細胞及炎性介質被大量釋放入機體中，并激活內(nèi)皮細胞及多核白細胞，補體、凝血及纖溶系統(tǒng)被激活，肺泡局部過度炎性反應，進而導致肺損傷[6]。因此，在損傷的早期及時應用肝素及抗炎藥物可明顯減輕肺臟的炎癥損傷。

表3　4組大鼠肺肺組織Brdu免疫組化陽性標記指數(shù)比較　±s

注：與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05；與單用組比較，△P<0.05

PRP是通過離心分離自體全血而得到的血小板濃縮物，研究表明，富血小板血漿具有促進骨折愈合及骨缺損的修復與重建的作用[7]。PRP不僅含有高濃度的血小板，還富含有多種能促進組織修復和再生的生長因子，如：小板源性生長因子(PDGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、胰島素樣生長因子(IGFs)Ⅰ和Ⅱ、轉化生長因子(TGF)β1和β2以及表皮生長因子等[8,9]。PDGF和TGF-β1制成凝膠狀后，可用于組織缺損的修補治療中，并在局部能較長時間保持較高的生長因子濃度[10]。低分子肝素作為一種由普通肝素分解合成的抗凝藥物，具有選擇性的抗凝血因子Ⅹa的作用，但對其他凝血酶及凝血因子作用較小，因此其抗血栓作用和致出血作用分離，進而降低了出血風險[11]。本研究結果顯示，模型組、單用組、聯(lián)合組的肺組織含水量顯著的高于正常組，聯(lián)合組的肺組織含水量顯著的低于模型組、單用組。上述研究結果顯示，自體富血小板血漿聯(lián)合低分子肝素氣道內(nèi)給藥可以降低吸入傷后肺組織內(nèi)的含水量。模型組、單用組、聯(lián)合組的血清TNF-α、IL-6、IL-1β、PDGF水平顯著高于正常組(P<0.05)，聯(lián)合組的血清TNF-α、IL-6、IL-1β、PDGF顯著的低于模型組、單用組(P<0.05)；模型組、單用組、聯(lián)合組的肺組織Brdu免疫組化陽性標記指數(shù)顯著的高于正常組(P<0.05)，聯(lián)合組的肺組織Brdu免疫組化陽性標記指數(shù)顯著的高于模型組、單用組(P<0.05)。上述研究結果提示，自體富血小板血漿聯(lián)合低分子肝素氣道內(nèi)給藥既可以減輕大鼠吸入性損傷后肺組織的含水量，減少肺組織內(nèi)TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性細胞和炎性介質的含量，進而間接的促進肺上皮細胞的增殖與修復。分析其原因可能與自體富血小板血漿中富含的生長因子可直接促進吸入性損傷后肺血管上皮細胞的修復與增殖。自體富血小板血漿聯(lián)合低分子肝素氣道內(nèi)給藥僅作用于肺臟局部，全身作用較小，方法安全有效，并可減少患者的經(jīng)濟負擔和精神負擔[12]。

綜上所述，PRP聯(lián)合LMWH治療吸入性損傷大鼠肺能夠顯著的減輕肺水腫及炎性反應，值得臨床應用和推廣。

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Experimental study on the therapeutic effects of autologous platelet rich plasma combined with low molecular weight heparin on inhalation pulmonary injury in rats

LUOZhijun,CHENXingqi,WANGHegeng,etal.

DepartmentofBurnandPlasticSurgery,People’sHospitalofZhongshanCity,Guangdong,Zhongshan528403,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the therapeutic effects of autologous platelet rich plasma (PRP) combined with low molecular weight heparin (LMWH) on inhalation pulmonary injury in rats.MethodsForty-eight healthy rats (SPF grade) were randomly divided into control group,model group,with 12 rats in each group.The animal models with smoke inhalation pulmonary injury were established in rats of model group, single-use group and combination group,and the rats in model group and control group were given 0.9% sodium chloride solution by intratracheal instillation, however,after smoke inhalation pulmonary injury the rats in single-use group were given PRP liquor by intratracheal instillation,but the rats in combination group were given mixed liquor of PRP with LMWH by intratracheal instillation.ResultsThe water content of lung tissues in model group,single-use group, combination group was significantly higher than that in control group (P<0.05),moreover, which in combination group was significantly lower than that in model group and single-use group (P<0.05).The serum levels of TNF-α,IL-6,IL-1β,PDGF in model group,single-use group, combination group were significantly higher than those in control group (P<0.05),however, which in combination group were significantly lower than those in model group and single-use group (P<0.05). The Brdu positive immunohistochemical labeling indexes in model group,single-use group, combination group were significantly higher than those in control group (P<0.05), furthermore, which in combination group were significantly higher than those in model group and single-use group (P<0.05).ConclusionPRP combined with LMWH can obviously alleviate pulmonary edema and inflammation reaction in treatment of inhalation pulmonary injury in rats.

【Key words】autologous platelet-rich plasma; low molecular weight heparin; inhalation injury;therapeutic effects

(收稿日期：2015-12-14)

【中圖分類號】R 563

【文獻標識碼】A

【文章編號】1002-7386(2016)09-1300-03

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.09.005

項目來源：中山市科技計劃項目(編號:20122A038)