李燕 李靜 楊潔 郝洪嶺 王素云 李杰 袁軍 王瑞倉
·論著·
多發(fā)性骨髓瘤骨髓病理檢測血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)情況
李燕 李靜 楊潔 郝洪嶺 王素云 李杰 袁軍 王瑞倉
目的 探討多發(fā)性骨髓瘤(MM)骨髓病理中,血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)情況。方法 應(yīng)用石蠟包埋的方法,經(jīng)過免疫組化的相關(guān)方法對10例缺鐵性貧血(對照組)的患者和40例MM患者(MM組)骨髓活檢組織,檢測血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)情況。結(jié)果 在本次研究中,VEGF在MM組和對照組的表達(dá)率比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。VEGF在多發(fā)性骨髓瘤不同分期中存在明顯差異(P<0.05)。結(jié)論 在多發(fā)性骨髓瘤中,骨髓病理檢測VEGF對于多發(fā)性骨髓瘤的診斷有重要意義,同時對于疾病的分期更有臨床價值,VEGF在MM的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有重要意義。
多發(fā)性骨髓瘤;骨髓活檢塑料包埋切片;血管內(nèi)皮生長因子
多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)的發(fā)病率較高,其中在惡性腫瘤中約占1%,在惡性血液病中約占10%,是一種血液科常見的惡性克隆性漿細(xì)胞疾病,至今不可治愈,可引起骨質(zhì)破壞、貧血、腎功能衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥[1]。研究顯示多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病機制復(fù)雜,考慮與多種細(xì)胞因子、生長因子及其在內(nèi)的多種相關(guān)因素相互作用有關(guān),內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF),對骨髓瘤細(xì)胞的生長、增殖、浸潤等有至關(guān)重要的作用,同時它也可以促進(jìn)血管的形成及增加骨髓微血管密度。MM嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量,發(fā)病人群大部分為老年人,主要采取化療或造血干細(xì)胞移植,但仍不能治愈此病,積極尋找更有效的檢查手段及診治方法,對早期有效的診斷及治療至關(guān)重要[1]。我院對初診的MM患者進(jìn)行骨髓病理的檢查,將患者的骨髓活檢組織進(jìn)行普通的石蠟包埋技術(shù),并且使用免疫組化法對患者的血管內(nèi)皮生長因子在MM患者的骨髓組織中的表達(dá)情況,同時觀察了血管內(nèi)皮生長因子的在不同分期的MM中相關(guān)表達(dá)關(guān)系,初步探討血管內(nèi)皮生長因子在MM的發(fā)病過程中能夠起到積極作用。
1.1 一般資料 選取河北省人民醫(yī)院在2013年5月至2014年8月間收治的MM患者40例為MM組,男25例,女15例;年齡40~86歲,平均年齡63歲。所有患者參考《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[2],并根據(jù)Purie-salmen分期標(biāo)準(zhǔn),通過骨髓細(xì)胞形態(tài)以及免疫固定電泳、全身骨掃描等明確診斷為MM,Ⅰ期10例,Ⅱ期16例,Ⅲ期14例。另外選取河北省人民醫(yī)院同期缺鐵性貧血10例為對照組,其中男6例,女4例。2組研究對象的一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
1.2 試劑 主要試劑為鼠抗人VEGF單克隆抗體,鼠抗人原始造血細(xì)胞的單克隆抗體CD34。免疫組化試劑盒為北京中山生物有限公司生產(chǎn)的免疫組化試劑盒,同時需要貯備烘片機、切片機、微波爐以及微量移液器。
1.3 實驗方法 標(biāo)本制備的過程需要使用B65-01骨髓活檢針在患者的髂前或髂后使用上棘局麻后對患者的活檢取材進(jìn)行抽吸的處理,并需要進(jìn)行4張涂片的制作。具體為5%~10%硝酸脫鈣, 其脫鈣的時間根據(jù)組織大小而定,脫鈣后充分沖洗、脫水,石蠟包埋、切片,切片厚約3 μm,并進(jìn)行HE染色及光鏡觀察。3%的過氧化氫進(jìn)行10 min的孵育,并且將內(nèi)源性的過氧化酶的活性進(jìn)行消除,微波爐抗原修復(fù)的方式進(jìn)行抗原的相關(guān)處理,滴加封閉用正常血清工作液的方式進(jìn)行相應(yīng)的處理,并在室溫的環(huán)境下進(jìn)行10 min左右的孵育,鼠抗人VEGF抗體以及鼠抗人原始造血細(xì)胞單克隆抗體CD34進(jìn)行處理,在4℃的環(huán)境下進(jìn)行處理,滴加通用型的生物素對相應(yīng)的IgG進(jìn)行標(biāo)記;最后需要滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液,在37℃環(huán)境下30 min,DAB顯色。
1.4 判定標(biāo)準(zhǔn) 在本次研究中VEGF的評分需要按照染色強度以及陽性細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行相應(yīng)的評分[2],其中染色強度的評分及顯色度按細(xì)胞顯色有無及深淺計分:沒有任何染色:0分,弱染色(淡黃色):1分,中染色(棕黃色):2分,強染色(棕褐色):3分。陽性細(xì)胞數(shù)量的評分方式為:沒有任何陽性細(xì)胞:0分,陽性細(xì)胞數(shù)量低于25%:1分,陽性細(xì)胞數(shù)量為25%~50%:2分,陽性細(xì)胞數(shù)量高于50%:3分。將陽性細(xì)胞數(shù)量評分以及染色強度評分相加為VEGF評分。0分為陰性(-),1~2分為低表達(dá)(+),3~4分為中度表達(dá)(++),5~6分為高表達(dá)(+++)。
1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件,計數(shù)資料采用χ2檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 VEGF在MM患者及缺鐵性貧血患者中的表達(dá) VEGF在MM患者及缺鐵性貧血患者組織中表達(dá)陽性率及表達(dá)強度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.951,P<0.05)。VEGF在MM中的表達(dá)陽性率明顯高于對照組。見表1。
表1 VEGF在MM組與對照組患者骨髓組織中的表達(dá) 例
注:與對照組比較,*P<0.05
2.2 VEGF在不同分期MM患者中的表達(dá) VEGF在不同分期的MM患者中表達(dá)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=32.814,P<0.05),VEGF的表達(dá)隨MM惡性程度的增高而增高。見表2。
表2 VEGF在不同分期的MM患者中的表達(dá) 例
注:與Ⅰ期比較,*P<0.05;與Ⅱ期比較,#P<0.05
2.3 免疫組化結(jié)果 在對照組中,正常的骨髓中的VEGF僅僅是在血管內(nèi)皮細(xì)胞中能夠見到陽性表達(dá)的情況,而在正常的漿細(xì)胞中沒有任何陽性表達(dá)。在MM患者中,漿細(xì)胞呈現(xiàn)出一種片狀浸潤以及結(jié)節(jié)狀的浸潤分布,同時VEGF在患者的骨髓瘤細(xì)胞中的胞漿呈現(xiàn)出陽性的表達(dá),并且可見棕色顆粒,在部分的細(xì)胞膜中的表達(dá)形式為邊緣為棕色的深環(huán)狀,在患者的血管內(nèi)皮細(xì)胞中能夠見到陽性表達(dá)的情況。見圖1~3。
對于MM而言,是一種較為常見的疾病,是一種惡性的漿細(xì)胞疾病,腫瘤細(xì)胞主要是起源于骨髓中的漿細(xì)胞,而漿細(xì)胞是一種B淋巴細(xì)胞發(fā)育到最終功能的細(xì)胞,因此我們可以發(fā)現(xiàn),MM往往可以歸結(jié)到B淋巴細(xì)胞的淋巴瘤周圍,目前國際衛(wèi)生組織也將MM歸結(jié)于B細(xì)胞淋巴瘤中的一種,將其稱之為漿細(xì)胞骨髓瘤或漿細(xì)胞瘤[3]。MM的特點是常有骨髓中異常漿細(xì)胞增生,并出現(xiàn)單克隆免疫球蛋白或M蛋白[4]。對于MM患者而言,往往會在發(fā)病初期出現(xiàn)骨骼變形、骨骼疼痛以及病理性骨折的情況,這主要是由于骨髓瘤細(xì)胞將患者的破骨細(xì)胞激活而發(fā)生的,同時患者也會出現(xiàn)出血以及貧血的癥狀,甚至有可能出現(xiàn)顱內(nèi)出血的現(xiàn)象[5]。而患者在發(fā)病的中后期也極有可能會出現(xiàn)淋巴結(jié)、肝、脾以及腎臟的病變情況,而患者的神經(jīng)系統(tǒng)在發(fā)病后往往會出現(xiàn)肢體癱瘓、昏迷、嗜睡、失明以及視力減退等情況,尤其是有較多患者在多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病后會出現(xiàn)慢性腎功能衰竭、高鈣血癥、高尿酸血癥以及高磷酸血癥等情況[6]。而正是由于MM的特點,在實際的發(fā)病過程中會對患者造成極為嚴(yán)重的危害,甚至威脅到患者的生命。因此一種及時有效的檢測MM的方式就顯得極為重要。有研究顯示,腫瘤血管的生成以及啟動的過程往往是需要通過上調(diào)腫瘤的血管網(wǎng),并且實現(xiàn)相關(guān)血管生成因子以及下調(diào)血管抑制因子來形成的[7]。
圖1 正常骨髓組織VEGF(+)(免疫組化×200)
圖2 MM患者的骨髓組織VEGF(++)(免疫組化×200)
圖3 MM患者的骨髓組織VEGF(+++)(免疫組化×200)
在本次研究中,我們使用骨髓活檢病理免疫組化的方法于MM患者的VEGF表達(dá)進(jìn)行了研究。我們發(fā)現(xiàn)觀察組的MM患者的骨髓涂片中的VEGF幾乎沒有表達(dá),周慷等[8]研究顯示,MM細(xì)胞會黏附在骨髓機制上,同時會形成一種阻礙抽吸的相關(guān)作用。而正是由于這樣的情況,在實際的VEGF檢驗過程中,往往較難以發(fā)現(xiàn)VEGF的表達(dá),而這種情況正是造成骨髓涂片中的骨髓瘤細(xì)胞數(shù)量明顯少于活檢切片的原因之一[9]。同時通過本次研究,也能夠說明對于血管新生而言,最為重要的原因就是需要調(diào)控因子VEGF參與其中,血管新生[2]。而通過對這種機制進(jìn)行研究,對治療MM提供了理論依據(jù)[10]。
VEGF在大部分實體瘤及其他腫瘤細(xì)胞中有所表達(dá),其中MM細(xì)胞及骨髓內(nèi)皮細(xì)胞能夠分泌VEGF、基質(zhì)金屬蛋白酶-2和金屬蛋白酶-9(MMP-2、 MMP-9),這些因子均與血管形成及疾病進(jìn)展密切相關(guān)。VEGF基因是由8個外顯子和7個內(nèi)含子組成。編碼VEGF的基因位于染色體6p21.3,全長14 kb。研究顯示MM中,骨髓中血管形成的增加考慮原發(fā)病進(jìn)展,提示預(yù)后不良??勺鳛樵u價預(yù)后的重要指標(biāo)。國內(nèi)外的研究顯示,具有促進(jìn)血管生成作用的一些細(xì)胞因子的過度表達(dá)影響MM的發(fā)生和發(fā)展[11-13]。目前針對MM的治療方法主要為化療及外周造血干細(xì)胞移植,治療的目前主要為減緩不適癥狀、延長生存期及改善生活質(zhì)量為主。其中化療方案中,主要以沙利度胺、硼替佐米(Bortezomib)、馬法蘭、強的松等化療方案為主,這些聯(lián)合方案的應(yīng)用已經(jīng)在MM的患者取得了非常好的治療效果[14]。
就目前而言,如果能早期獲得完全緩解,對患者的長期生存有深遠(yuǎn)影響[15],有較多種的抗MM的新藥已經(jīng)得到了關(guān)注,同時這些新藥在實際的使用過程中能夠較好的保證抑制血管新生的作用,甚至能夠?qū)⑵渥鳛橐环N藥物作用的主要靶點進(jìn)行使用。如來那度胺,主要是能夠?qū)M的細(xì)胞凋亡進(jìn)行誘導(dǎo),并通過這種形式將MM以及骨髓基質(zhì)細(xì)胞的粘附進(jìn)行相應(yīng)的阻斷。而通過這種形式,就能夠較好的保證患者能夠在實際的治療過程中得到切實有效的治療效果,并且將患者的骨髓血管新生進(jìn)行較為明顯的抑制,同時通過酪氨酸激酶的抑制作用,進(jìn)一步抑制血管新生以及腫瘤增殖目前有研究顯示,酪氨酸激酶的抑制劑能夠較好的對患者的骨髓瘤細(xì)胞增殖進(jìn)行抑制。這些作用能夠抑制住VEGF以及血管新生,在臨床上也取得了較好的效果,能夠?qū)⒒颊叩纳嬉约邦A(yù)后進(jìn)行明顯的改善。研究顯示硼替佐米的作用機制可以通過抑制 DNA的修復(fù)來進(jìn)一步抑制骨髓瘤細(xì)胞的增殖,同時體外實驗?zāi)壳耙策M(jìn)一步顯示如果硼替佐米聯(lián)合阿霉素、馬法蘭等多種藥物后,可加強對腫瘤細(xì)胞的抑制及清除作用[16]。
而在本次的研究過程中,患者的血清VEGF水平也顯示能夠有著較為滿意的臨床意義,與患者的治療療效及生存有關(guān),在臨床對MM患者進(jìn)行治療的過程中,值得推廣應(yīng)用。而患者的血清VEGF也與患者的實際年齡以及免疫分型和臨床分期等沒有顯著的意義。
1 李欣,魏秀珍,劉晉瑋,等.多發(fā)性骨髓瘤患者血清中VEGF水平的臨床意義.中國實驗血液學(xué)雜志,2014,22:108-111.
2 張之南主編.血液病診斷與療效標(biāo)準(zhǔn).第2版.北京:北京科學(xué)出版社,1998.373-380.
3 Seki R,Yamagishi SI,Matsui T,et al.Pigment epithelium-derived factor(PEDF)inhibits survival and proliferation of VEGF-exposed multiple myeloma cells through its anti-oxidative properties.Biochemical and Biophysical Research Communications,2013,431:693-697.
4 張蕾,陳世倫,陳文明,等.多發(fā)性骨髓瘤血管內(nèi)皮生長因子和白細(xì)胞介素-6相互作用的研究.中華內(nèi)科雜志,2005,44:85-88.
5 Claudia G,Gaetano V,Giuseppe V.Reduction of serum IGF-I levels in patients affected with Monoclonal Gammopathies of undetermined significance or Multiple Myeloma. Comparison with bFGF, VEGF gene mutation.Journal of Experimental & Clinical Cancer Research,2009,28:1671-1677.
6 姚軍萍,汪興洪,蘇貴平,等.多發(fā)性骨髓瘤中缺氧誘導(dǎo)因子-1α和VEGF的表達(dá)及相關(guān)性研究.皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2012,31:21-23.
7 Podar K,Tonon G,Sattler M,et al.The small-molecule VEGF receptor inhibitor pazopanib (GW786034B) targets both tumor and endothelial cells in multiple myeloma.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2006,103:19478-19483.
8 周慷,鄧建川,婁世鋒,等.多發(fā)性骨髓瘤survivin與VEGF表達(dá)的相關(guān)性及臨床意義.腫瘤防治研究,2009,36:593-595.
9 Zhang L,Hu Y,Sun CY,et al.Lentiviral shRNA silencing of BDNF inhibits in vivo multiple myeloma growth and angiogenesis via down-regulated stroma-derived VEGF expression in the bone marrow milieu.Cancer science,2010,101:1117-1124.
10 Sun CY,Hu Y,Huang J,et al.Brain-derived neurotrophic factor induces proliferation, migration, and VEGF secretion in human multiple myeloma cells via activation of MEK-ERK and PI3K/AKT signaling.Tumour biology,2010,31:121-128.
11 Cohen KS.Angiogenesis and multiple myeloma: is there a role for angiogenic biomarkers in the context of autologous stem cell transplant Leuk Lymphoma, 2011,52:1173-1175.
12 Marisavljevic D,Markovic O,Cemerikic V,et al.Clinical and his-topathological study of angiogenesis in multiple myeloma.J BUON,2011,16:98-103.
13 Rana C,Sharma S,Agrawal V,et al. Bone marrow angiogenesis in multiple myeloma and its correlation with clinicopathological factors.Ann Hematol,2010,89:789-794.
14 Palumbo A, Ambrosini MT, Benevolo G, et al. Bortezomib,melphalan, prednisone and thalidomide for relapsed multiple myeloma. Blood,2007,109:2767-2772.
15 Attal M,Harousseau JL,Facon T,et al.Double autologous transplantation improves survivalof multiple myeloma patients: final analysis of a pro-spectiverandomized study of the “ Intergroupe Franco-phone du Myelome” (IFM 94).Blood,2002,100:7-10.
16 Mitsiades N,Mitsiades CS,Richardson PG,et al.The proteasome inhibitor PS -341 potentiates sensitivity of multiple myeloma cells to conventionalchemotherapeutic agents: therapeutic applications.Blood, 2003, 101: 2377-2380.
Expression of VEGF in multiple myeloma by means of bone marrow biopsy
LIYan*,LIJing,YANGJie*,etal.
*DepartmentofHematology,HebiProvincialPeople’sHospital,Hebei,Shijiazhuang050051,China
Objective To investigate the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in multiple myeloma (MM) by means of bone marrow biopsy.Methods The expression levels of VEGF in bone marrow biopsy plastic embedding slices were detected by immunohistochemistry in 10 patients with iron deficiency anemia (control group) and 40 patients with MM (MM group).Results There were significant differences in the expression levels of VEGF between control group and MM group (P<0.05), moreover, there were significant differences in the expression levels of VEGF in MM group among different stages (P<0.05).Conclusion In multiple myeloma, the detection of expression levels of VEGF by means of pathological examination plays an important role in the diagnosis of MM,at the same time, which has significant clinical value in the pathological staging, pathogenesis,development and prognosis of MM.
multiple myeloma; bone marrow biopsy plastic embedding slice; vascular endothelial growth factor;expression
10.3969/j.issn.1002-7386.2016.08.004
050051 石家莊市,河北省人民醫(yī)院血液科(李燕、楊潔、郝洪嶺、王素云、李杰、袁軍、王瑞倉);河北省中醫(yī)院(李靜)
R 733.3
A
1002-7386(2016)08-1136-04
2015-11-27)