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多粘類芽孢桿菌同步糖化發(fā)酵玉米粉生產(chǎn)(R,R)-2,3-丁二醇*

0引言

【研究意義】2,3-丁二醇(2,3-butanediol)在化工、能源、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，其微生物發(fā)酵生產(chǎn)是現(xiàn)代生物化工的重要課題。2,3-丁二醇氧化脫氫可生成高價(jià)值食品風(fēng)味劑2,3-丁二酮，或者選擇性氧化獲得3-羥基-2-丁酮[1-2]，后者可作為醫(yī)藥中間體和食用香料，目前應(yīng)用前景較好；2,3-丁二醇與乙酸反應(yīng)生成的二乙酸-2,3-丁二醇酯是水果香氣物質(zhì)的重要成分；另外，2,3-丁二醇脫水可生成甲乙酮、1,3-丁二烯，前者可作為一種高價(jià)值的液體燃料添加劑和低沸點(diǎn)溶劑，后者可用于合成橡膠和樹脂；此外，2,3-丁二醇可作為液體燃料、辛烷值提升劑，或可用于合成聚酯、聚氨酯等高附加值產(chǎn)品[3-4]。據(jù)專家推測(cè)，2,3-丁二醇關(guān)鍵下游產(chǎn)品潛在的市場(chǎng)容量達(dá)到3200 萬(wàn)t/年，價(jià)值430億美元[5]。2,3-丁二醇存在3種立體異構(gòu)體，分別是(R,R)-2,3-丁二醇、(S,S)-2,3-丁二醇和meso-2,3-丁二醇[6-7]。單一構(gòu)型的(R,R)-2,3-丁二醇不僅具有混旋型2,3-丁二醇的基本功能，而且在不對(duì)稱合成方面優(yōu)勢(shì)突出，是合成手性試劑和手性配體的重要前體，在高價(jià)值手性電子材料、醫(yī)藥和農(nóng)藥中間體的合成中應(yīng)用廣泛[8-10]。此外，(R,R)-2,3-丁二醇凝固點(diǎn)較低(-60℃)，是一種優(yōu)良的高級(jí)抗凍劑[8-9]。傳統(tǒng)的(R,R)-2,3-丁二醇化學(xué)合成法存在使用化石原料、環(huán)境污染嚴(yán)重和手性拆分成本高昂等問(wèn)題，難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模低成本生產(chǎn)[11]。開(kāi)發(fā)微生物法利用可再生資源高效合成光學(xué)純(R,R)-2,3-丁二醇的研究有利于提升該產(chǎn)業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力和拓展下游產(chǎn)業(yè)鏈。【前人研究進(jìn)展】多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa，過(guò)去稱為Bacillus polymyxa)是到目前為止發(fā)現(xiàn)的唯一能夠高效生產(chǎn)光學(xué)純(R,R)-2,3-丁二醇(光學(xué)純度大于98%)的天然微生物[12-13]。目前關(guān)于P.polymyxa發(fā)酵制備(R,R)-2,3-丁二醇的報(bào)道大多使用傳統(tǒng)的葡萄糖和蔗糖作為碳源，高昂的原料成本限制了(R,R)-2,3-丁二醇的工業(yè)化生產(chǎn)[6]，所以尋找既低價(jià)又有效的原料是推進(jìn)其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的必經(jīng)之路。目前有文獻(xiàn)報(bào)道利用纖維素水解液為碳源發(fā)酵生產(chǎn)(R,R)-2,3-丁二醇，但最終產(chǎn)物濃度都不高[14-16]；另外，P.polymyxa能利用菊芋發(fā)酵產(chǎn)生36.9 g/L (R,R)-2,3-丁二醇，光學(xué)純度大于98%[17]，但其仍未達(dá)到工業(yè)化應(yīng)用的要求?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】玉米粉是工業(yè)中一種較廉價(jià)的原料。在美國(guó)和加拿大常利用廉價(jià)易得的玉米粉大批量生產(chǎn)價(jià)格較低的燃料乙醇[18]；另外，玉米粉也可用于生產(chǎn)乳酸[19-20]、丁酸[21]等有機(jī)酸。因此，本文從低廉的玉米粉出發(fā)，研究其高效發(fā)酵生產(chǎn)(R,R)-2,3-丁二醇的工藝條件。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究對(duì)P.polymyxa高產(chǎn)菌株利用玉米粉同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)(R,R)-2,3-丁二醇的條件進(jìn)行優(yōu)化，以獲得低成本高效的(R,R)-2,3-丁二醇生產(chǎn)技術(shù)。

1材料與方法

1.1菌種

發(fā)酵菌種為P.polymyxa DSM 365，購(gòu)自德國(guó)微生物菌種保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，DSMZ)。

1.2酶與試劑

利可來(lái)耐高溫淀粉酶supra(酶活力≥135 KNU/g)、復(fù)合糖化酶DX(標(biāo)準(zhǔn)酶活力為500 AGU/mL)均購(gòu)自諾維信公司；市售的普通玉米粉(含水量約8%，淀粉含量為75%)； 酵母粉和蛋白胨均購(gòu)自O(shè)XOID公司，其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3培養(yǎng)基

微量元素溶液： FeSO40.4 g/L，MnCl2·4H2O 5.0 g/L，ZnSO4·7H2O 0.1 g/L，H3BO30.8 g/L，CuSO4·5H2O 0.04 g/L，NaMoO4·2H2O 0.04 g/L，Co(NO3)2·6H2O 0.08 g/L，CaCl2·2H2O 1.0 g/L，biotin 0.01 g/L(文獻(xiàn)[12])。種子培養(yǎng)基：葡萄糖 50 g/L，酵母粉 20 g/L，蛋白胨 10 g/L，(NH4)2SO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，Na2HPO4·12H2O 2 g/L，KH2PO43 g/L，微量元素溶液2 mL，pH值6.5。初始發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉 140 g/L，酵母粉 30 g/L，(NH4)2SO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，Na2HPO4·12H2O 4 g/L，KH2PO46 g/L，微量元素溶液2 mL，pH值為6.5。以上培養(yǎng)基除微量元素溶液采用無(wú)菌的0.22 μm膜過(guò)濾除菌外，其余一律115℃，20 min滅菌，糖與其它成分分開(kāi)滅菌。

1.4玉米粉液化處理

稱取一定量的玉米干粉(扣除含水量)，分別裝入若干個(gè)250 mL三角瓶中，加入適量水溶解之后按0.4 KNU/g玉米干粉的比例添加高溫淀粉酶，95℃水浴，振蕩30 min。

1.5同步糖化發(fā)酵

種子培養(yǎng)：從-80℃冰箱取出甘油保藏菌，接入裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37℃，250 r/min培養(yǎng)14 h，連續(xù)活化兩次。發(fā)酵培養(yǎng)：按10%的接種量轉(zhuǎn)接二級(jí)種子到發(fā)酵培養(yǎng)基中(250 mL三角瓶裝液量為60 mL)，并按3 AGU/g玉米干粉的比例加入復(fù)合糖化酶，37℃，230 r/min，發(fā)酵50 h。

1.6檢測(cè)方法

1.6.1還原糖濃度的測(cè)定

將發(fā)酵液于12 000 r/min條件下離心10 min，取上清液，然后加入5 mol/L的HCl酸化，沸水浴15 min，迅速冷卻后用5 mol/L的NaOH中和，然后參照文獻(xiàn)[22]的還原糖濃度測(cè)定方法測(cè)定。

1.6.2(R,R)-2,3-丁二醇光學(xué)純度的測(cè)定

采用氣相色譜儀(Agilent 7890A)測(cè)定。色譜柱為Agilent CycloSil-B手性毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；采用FID氫火焰檢測(cè)器，氮?dú)庾鳛檩d氣，流速為1.6 mL/min。起始柱溫為100℃，保留1 min；然后先以10℃/min程序升溫至120℃，保留0 min；再以6℃/min程序升溫至130℃，保留0 min；最后以20℃/min程序升溫至230℃，進(jìn)樣口溫度為200℃，檢測(cè)器溫度240℃。

1.6.3乙偶姻和(R,R)-2,3-丁二醇濃度的測(cè)定

采用氣相色譜儀(Agilent 7890A)測(cè)定。色譜柱為Phenomenex ZB-WAXplus毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；采用FID氫火焰檢測(cè)器，氮?dú)庾鳛檩d氣，流速為1.6 mL/min。起始柱溫為100℃，保留1 min，然后以20℃/min程序升溫到180℃，保留3 min，進(jìn)樣口溫度為250℃，檢測(cè)器溫度為250℃，內(nèi)標(biāo)物為乙腈。

2結(jié)果與分析

2.1玉米粉濃度對(duì)(R,R)-2,3-丁二醇發(fā)酵的影響

玉米粉的主要成分是玉米淀粉，此外還含有少量的維生素、微量元素、生長(zhǎng)因子等，因此玉米粉的用量對(duì)菌體生長(zhǎng)及(R,R)-2,3-丁二醇的發(fā)酵有著重要影響。

由表1可知，(R,R)-2,3-丁二醇的產(chǎn)量隨著玉米粉濃度的增加而升高。當(dāng)玉米粉濃度低于120 g/L時(shí)，(R,R)-2,3-丁二醇產(chǎn)量、得率等均不高，經(jīng)濟(jì)效益不佳；玉米粉濃度為140 g/L時(shí)，得率、轉(zhuǎn)化率雖與120 g/L時(shí)的相近，但(R,R)-2,3-丁二醇產(chǎn)量較高，達(dá)到55.2 g/L。當(dāng)玉米粉濃度高于140 g/L時(shí)，(R,R)-2,3-丁二醇得率及轉(zhuǎn)化率開(kāi)始下降，說(shuō)明糖濃度過(guò)高會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)和(R,R)-2,3-丁二醇的發(fā)酵，因而確定最佳玉米粉濃度為140 g/L。

2.2氮源對(duì)(R,R)-2,3-丁二醇發(fā)酵的影響

氮源物質(zhì)為微生物提供氮素來(lái)源，是核酸和蛋白質(zhì)及某些含氮代謝物合成的重要元素，對(duì)微生物生長(zhǎng)繁殖和發(fā)酵都起著重要作用。本實(shí)驗(yàn)控制氮源濃度為20 g/L，分別以酵母粉、蛋白胨、牛肉膏、(NH4)2SO4、(NH4)2HPO4、尿素作為氮源，考察各種氮源對(duì)(R,R)-2,3-丁二醇發(fā)酵的影響(表2)。

表1玉米粉對(duì)(R,R)-2,3-丁二醇發(fā)酵的影響

Table 1Effect of corn flour on the production of (R,R)-2,3-butanediol

玉米粉DriedCornflour(g/L)殘還原糖含量Residualsugar(g/L)(R,R)2,3丁二醇含量(R,R)2,3butanediol(g/L)產(chǎn)率Productivity(g/(L.h))得率aYielda(g/g)轉(zhuǎn)化率bConversionrateb(%)807.1±0.125.5±0.70.51±0.010.35±0.0170.5±2.01007.7±0.537.2±0.50.74±0.010.40±0.0080.4±1.212010.2±0.447.6±0.20.95±0.000.44±0.0087.2±0.414015.5±1.355.2±0.51.10±0.010.44±0.0087.0±0.916025.1±3.557.8±0.81.16±0.020.40±0.0179.8±1.1

注：a得率等于(R,R)-2,3-丁二醇質(zhì)量(g)除以(初始淀粉質(zhì)量(g)乘以1.11)；b 轉(zhuǎn)化率等于(R,R)-2,3-丁二醇摩爾數(shù)(mol)除以葡萄糖摩爾數(shù)(mol)

Note：a(R,R)-2,3-butanediol(g)/(initial starch(g)×1.11 )；b(R,R)-2,3-butanediol (mol)/glucose (mol)

由表2可知，蛋白胨、牛肉膏、酵母粉作為氮源時(shí)，(R,R)-2,3-丁二醇產(chǎn)量、得率及還原糖轉(zhuǎn)化率均優(yōu)于無(wú)機(jī)氮源，可能是由于有機(jī)氮源營(yíng)養(yǎng)豐富，所含的多種維生素、微量元素、蛋白質(zhì)、游離氨基酸及生長(zhǎng)因子等能促進(jìn)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成。當(dāng)以酵母粉作為氮源時(shí)，(R,R)-2,3-丁二醇產(chǎn)量、得率、轉(zhuǎn)化率等指標(biāo)均是最高的，因此選擇酵母粉作為最適氮源。

2.3酵母粉濃度對(duì)(R,R)-2,3-丁二醇發(fā)酵的影響

酵母粉營(yíng)養(yǎng)充足，能提供菌體生長(zhǎng)所需的各種維生素、蛋白質(zhì)、微量元素、生長(zhǎng)因子等，是一種常用的有機(jī)氮源。本實(shí)驗(yàn)在初始玉米粉濃度為140 g/L時(shí)，考察酵母粉濃度對(duì)菌株產(chǎn)(R,R)-2,3-丁二醇發(fā)酵的影響(表3)。

由表3可知，隨著酵母粉濃度的增加，(R,R)-2,3-丁二醇產(chǎn)量、得率、還原糖轉(zhuǎn)化率呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)酵母粉濃度為30 g/L時(shí)，(R,R)-2,3-丁二醇產(chǎn)量(57.3 g/L)、得率(0.45 g/g葡萄糖)等指標(biāo)達(dá)到最大值，而當(dāng)酵母粉濃度超過(guò)30 g/L時(shí)，(R,R)-2,3-丁二醇產(chǎn)量、得率卻開(kāi)始下降，這可能是由于營(yíng)養(yǎng)過(guò)于豐富，導(dǎo)致菌體過(guò)度生長(zhǎng)而消耗過(guò)多的碳源，減少了流向(R,R)-2,3-丁二醇合成路徑的碳架物質(zhì)，阻礙代謝流量向最大轉(zhuǎn)化率的方向變化。因此，我們確定酵母粉的最適濃度為30 g/L。

2.4無(wú)機(jī)鹽對(duì)(R,R)-2,3-丁二醇發(fā)酵的影響

無(wú)機(jī)鹽是微生物生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)物合成所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如磷酸鹽、銨鹽、硫、鈉、鉀、鎂等化合物，它們?cè)谖⑸镏械淖饔弥饕亲鳛樯砘钚晕镔|(zhì)的組成部分或生理活性的調(diào)節(jié)物。本實(shí)驗(yàn)在以140 g/L玉米粉、30 g/L酵母粉分別作為碳源和氮源的情況下，以不加無(wú)機(jī)鹽作為空白對(duì)照，考察添加不同濃度的Na2HPO4、KH2PO4、(NH4)2SO4、MgSO4對(duì)(R,R)-2,3-丁二醇發(fā)酵的影響。

由圖1可知，低濃度的無(wú)機(jī)鹽離子對(duì)(R,R)-2,3-丁二醇的合成是有促進(jìn)作用的，而濃度過(guò)高則起抑制作用，當(dāng)Na2HPO4為3 g/L、KH2PO4為3 g/L、 (NH4)2SO4為2 g/L、MgSO4為0.8 g/L時(shí)，(R,R)-2,3-丁二醇的產(chǎn)量最高。

2.5(R,R)-2,3-丁二醇的發(fā)酵過(guò)程曲線

在優(yōu)化培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上測(cè)定P.polymyxa發(fā)酵產(chǎn)(R,R)-2,3-丁二醇的發(fā)酵曲線，定時(shí)取樣，以了解在最佳條件下菌體的(R,R)-2,3-丁二醇合成情況，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，(R,R)-2,3-丁二醇的濃度隨著糖的消耗而逐漸升高，在0～10 h，糖耗速率較快，發(fā)酵5 h后(R,R)-2,3-丁二醇開(kāi)始積累而且濃度不斷提高，這表明在發(fā)酵前期，菌體的生長(zhǎng)繁殖也伴隨著(R,R)-2,3-丁二醇的合成，Magee等[23]認(rèn)為可能是菌體生長(zhǎng)和代謝過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物有機(jī)酸致使培養(yǎng)基pH值降低，當(dāng)有機(jī)酸達(dá)到一定濃度時(shí)，(R,R)-2,3-丁二醇合成代謝途徑被激活，以阻止環(huán)境的進(jìn)一步酸化對(duì)菌體造成傷害。發(fā)酵50 h后，糖基本耗完，(R,R)-2,3-丁二醇濃度達(dá)到56.28 g/L，得率為0.44 g/g葡萄糖，產(chǎn)率為1.13 g/(L·h)，轉(zhuǎn)化率為88.7%，光學(xué)純度為98.3%。在0～35 h，乙偶姻濃度極低，而在35～50 h，乙偶姻積累較多，有研究[24-25]認(rèn)為這與發(fā)酵液的溶氧變化有關(guān)：發(fā)酵前期發(fā)酵液營(yíng)養(yǎng)較為豐富，菌體生長(zhǎng)旺盛，消耗過(guò)多的氧氣致使發(fā)酵液處于缺氧狀態(tài)，胞內(nèi)過(guò)量的NADH會(huì)促使乙偶姻還原為(R,R)-2,3-丁二醇；而到發(fā)酵后期營(yíng)養(yǎng)消耗殆盡，菌體不再生長(zhǎng)甚至自溶導(dǎo)致發(fā)酵液溶氧增加，從而有利于乙偶姻的積累。

表2氮源對(duì)(R,R)-2,3-丁二醇發(fā)酵的影響

Table 2Effect of different nitrogen resources on the production of (R,R)-2,3-butanediol

氮源Nitrogenresources殘還原糖含量Residualreducingsugar(g/L)(R,R)2,3丁二醇含量(R,R)2,3butanediol(g/L)產(chǎn)率Productivity(g/(L.h))得率Yield(g/g)轉(zhuǎn)化率Conversionrate(%)(NH4)2HPO475.9±1.112.2±0.70.24±0.010.10±0.0119.2±1.2H2NCONH243.4±0.234.0±0.80.68±0.020.27±0.0153.7±1.3(NH4)2SO440.2±0.235.3±0.50.71±0.010.28±0.0055.6±0.8蛋白胨Tryptone10.9±1.548.2±1.80.96±0.040.38±0.0175.9±2.8牛肉膏Beefextract9.3±1.053.0±1.11.06±0.020.42±0.0183.6±1.8酵母粉Yeastextract10.2±1.754.2±1.11.08±0.020.43±0.0185.5±1.7

表3酵母粉對(duì)(R,R)-2,3-丁二醇發(fā)酵的影響

Table 3Effect of yeast extract on the production of (R,R)-2,3-butanediol

酵母粉濃度Yeastextract(g/L)殘還原糖含量Residualreducingsugar(g/L)(R,R)2,3丁二醇含量(R,R)2,3butanediol(g/L)產(chǎn)率Productivity(g/(L.h))得率Yield(g/g)轉(zhuǎn)化率Conversionrate(%)1513.8±0.748.7±1.00.97±0.020.38±0.0176.8±1.62012.2±1.453.3±0.41.07±0.040.42±0.0284.0±3.22511.2±0.954.0±0.61.08±0.010.43±0.0085.2±1.03011.1±1.457.3±1.21.15±0.020.45±0.0190.4±1.9409.4±0.148.9±0.90.98±0.020.39±0.0177.0±1.4

圖1無(wú)機(jī)鹽對(duì)(R,R)-2,3-丁二醇發(fā)酵的影響

Fig.1Effect of inorganic salts on the production of (R,R)-2,3-butanediol

圖2P.polymyxa利用玉米粉同步糖化發(fā)酵產(chǎn)(R,R)-2,3-丁二醇的過(guò)程曲線

Fig.2Fermention profile of (R,R)-2,3-butanediol production by P.polymyxa

3討論

單一構(gòu)型的(R,R)-2,3-丁二醇由于在不對(duì)稱合成方面的突出優(yōu)勢(shì)而具有特殊用途，因此微生物發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純(R,R)-2,3-丁二醇成為當(dāng)前研究的熱門課題。目前關(guān)于P.polymyxa高效生產(chǎn)(R,R)-2,3-丁二醇的報(bào)道大多使用蔗糖和葡萄糖，如H?βler T等[12]利用P.polymyxa DSM 365以蔗糖為碳源，通過(guò)批次補(bǔ)料發(fā)酵，獲得濃度高達(dá)111 g/L的(R,R)-2,3-丁二醇；此外Dai等[26]利用P.polymyxa CJX518以葡萄糖為碳源，進(jìn)行批次補(bǔ)料發(fā)酵54 h，獲得71.71 g/L的(R,R)-2,3-丁二醇，得率為0.4 g/g葡萄糖。但由于以上研究成本過(guò)高，不利于(R,R)-2,3-丁二醇的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。基于降低成本的考慮，近年來(lái)也有研究者使用低價(jià)的菊芋、木糖、纖維素水解液等發(fā)酵生產(chǎn)(R,R)-2,3-丁二醇，如Gao J等[16]以菊芋為碳源，采用一步法發(fā)酵42 h，(R,R)-2,3-丁二醇濃度高達(dá)36.92 g/L，產(chǎn)率為0.88 g/(L·h) ；Adlakha N等[15]利用P.polymyxa ICGEB2008以纖維素水解液為碳源發(fā)酵80 h，(R,R)-2,3-丁二醇的產(chǎn)量為21 g/L，產(chǎn)率為0.27 g/(L·h)，得率為0.33 g/g總糖；Marwoto B等[27]以15 g/L木糖為碳源，利用P.polymyxa批次發(fā)酵24 h，(R,R)-2,3-丁二醇產(chǎn)量為3.5 g/L，產(chǎn)率為0.15 g/(L·h)，得率為0.23 g/g木糖。以上研究均使用低價(jià)原料作為底物，但發(fā)酵效率、產(chǎn)量或者轉(zhuǎn)化率較低，達(dá)不到產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)要求。本研究以玉米粉為碳源，利用P.polymyxa DSM 365進(jìn)行同步糖化發(fā)酵50 h，(R,R)-2,3-丁二醇的濃度為56.28 g/L(光學(xué)純度為98.3%)，得率為0.44 g/g葡萄糖，產(chǎn)率為1.13 g/(L·h)。本研究以低價(jià)易得的玉米粉作為原料同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)(R,R)-2,3-丁二醇，可為未來(lái)低成本高效產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)(R,R)-2,3-丁二醇提供有價(jià)值的參考。

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(責(zé)任編輯：米慧芝)

Simultaneous Sccharification and (R,R)-2,3-butanediol Fermentation from Corn Flour by Paenibacillus polymyxa

李億1,2，李檢秀1,2，劉海余1，黃艷燕2，陸琦2，謝能中2，黃日波1,2**

LI Yi1,2,LI Jianxiu1,2,LIU Haiyu1,HUANG Yanyan2,LU Qi2,XIE Nengzhong2,HUANG Ribo1,2

(1.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530005；2.廣西科學(xué)院，非糧生物質(zhì)酶解國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家非糧生物質(zhì)能源工程技術(shù)研究中心，廣西生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西生物質(zhì)產(chǎn)業(yè)化工程院，廣西南寧530007)

(1.College of Life Science and Technology,Guangxi University,Nanning,Guangxi,530005,China;2.State Key Laboratory of Non-food Biomass and Enzyme Technology,National Engineering Research Center for Non-food Biorefinery,Guangxi Key Laboratory of Biorefinery,Guangxi Biomass Industrialization Engineering Institute,Guangxi Academy of Sciences,Nanning,Guangxi,530007,China)

摘要：【目的】對(duì)多粘類芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa的玉米粉同步糖化發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，以獲得低成本、高效的(R,R)-2,3-丁二醇生產(chǎn)技術(shù)?！痉椒ā垦芯坑衩追蹪舛?、氮源種類和氮源濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)、耗糖能力以及(R,R)-2,3-丁二醇產(chǎn)量、產(chǎn)率、得率和轉(zhuǎn)化率的影響，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步考察培養(yǎng)基中其它成分對(duì)(R,R)-2,3-丁二醇發(fā)酵的影響?！窘Y(jié)果】?jī)?yōu)化后的培養(yǎng)基組分為玉米干粉140 g/L，酵母粉30 g/L，Na2HPO4 3 g/L，KH2PO4 3 g/L，(NH4)2SO4 2 g/L，MgSO4 0.8 g/L，微量元素溶液2 mL/L。使用優(yōu)化后的培養(yǎng)基進(jìn)行同步糖化發(fā)酵，發(fā)酵50 h后(R,R)-2,3-丁二醇產(chǎn)量達(dá)到56.28 g/L(光學(xué)純度為98.3%)，對(duì)葡萄糖的得率為0.44 g/g，產(chǎn)率為1.13 g/(L·h)。【結(jié)論】(R,R)-2,3-丁二醇生產(chǎn)技術(shù)低價(jià)高效，可為其工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

關(guān)鍵詞：(R,R)-2,3-丁二醇多粘類芽孢桿菌同步糖化發(fā)酵工藝低價(jià)碳源

Abstract:【Objectives】In this study,corn flour simultaneous saccharification and fermentation process was optimized to achieve a low-cost and efficient (R,R)-2,3-butanediol production technology.【Methods】The effects of different types and concentrations of nitrogen,and different concentrations of corn flour on cell growth,consumption of sugar,(R,R)-2,3-butanediol production,productivity,yield and conversion rate were investigated based on corn flour simultaneous saccharification and fermentation.Furthermore, the effects of other components in the medium on (R,R)-2,3-butanediol fermentation were observed.【Results】The optimized composition of culture medium was as follows:140 g/L dried corn flour,30 g/L yeast extract,3 g/L Na2HPO4,3 g/L KH2PO4,2 g/L (NH4)2SO4,0.8 g/L MgSO4 and 2 mL/L trace element solution.Under abovementioned conditions,up to 56.28 g/L (R,R)-2,3-butanediol(optical purity>98.3%) could be achieved within 50 h with the yield on glucose of 0.44 g/g and the conversion rate of 1.13 g/(L·h).This is the highest production of (R,R)-2,3-butanediol titer so far reported from low-cost carbon source.【Conclusion】This study develops a technology utilizing low-cost carbon to produce (R,R)-2,3-butanediol efficiently，which provides meaningful guidance for its future industrial production.

Key words:(R,R)-2,3-butanediol，Paenibacillus polymyxa，simultaneous saccharification，fermentation process，low-cost carbon source

中圖分類號(hào)：Q815

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1005-9164(2016)01-0041-06

作者簡(jiǎn)介：李億(1988-)，男，碩士研究生，主要從事合成生物學(xué)與發(fā)酵工程研究。

收稿日期：2015-11-13

修回日期：2016-01-26

*國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31400079,21466007,31160023)，中科院微生物生理與代謝工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(KLIM-201304)和廣西科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(桂科合14125008-2-22)資助。

**通訊作者：黃日波(1958-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事微生物生物技術(shù)以及酶工程研究，E-mail：rbhuang@gxas.cn。

廣西科學(xué)Guangxi Sciences 2016,23(1):41～46

網(wǎng)絡(luò)優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-03-15

網(wǎng)絡(luò)優(yōu)先數(shù)字出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/45.1206.G3.20160315.1510.012.html