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卵形鯧鲹主要致病鏈球菌多重PCR診斷技術的建立*

0引言

【研究意義】隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展,鏈球菌(Streptococcus)導致的疾病頻繁暴發(fā),并在世界范圍內(nèi)造成重大經(jīng)濟損失。迄今為止，鏈球菌病的主要致病菌包括副乳房鏈球菌(Streptococcus parauberis)、海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)、停乳鏈球菌(Streptococcus dysgalactiae)、格式乳球菌(Lactococcus garvieae)、Lactococcus piscium、鮭魚漫游球菌(Vagococcus salmoninarum)、棲魚肉桿菌(Carnobacterium piscicola)[1-4]。1957年日本在養(yǎng)殖虹鱒魚(Oncorhychus mikiss)上發(fā)現(xiàn)鏈球菌病，這是最早發(fā)現(xiàn)的魚類鏈球菌感染性疾病[5]。20世紀80年代以后，已有多個國家報道了魚類鏈球菌病的暴發(fā)與流行，包括尼羅羅非魚(Tilapia nilotica(linnaeus))、 尼羅尖吻鱸(Lates niloticus)、大菱鲆(Psetta maxima)、卵形鯧鲹(Trachinoms ovatus)、黃獅魚(Seriola quinqueradiata)、紅鼓魚(Sciaenops ocellatus)、海鯛(Sparus auratus)、日本比目魚(Paralichthys olivaceus)[6-15]。而在中國，養(yǎng)殖羅非魚(Oreochromis speices)的鏈球菌發(fā)病率為20%～50%，死亡率為50%～70%，甚至更高,鏈球菌病已嚴重危害中國羅非魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[16]。近年來，卵形鯧鲹憑借其肉質(zhì)具有鲹類特殊鮮味、生長速度快、出口加工市場前景誘人等特點，養(yǎng)殖規(guī)模一度呈倍數(shù)增長態(tài)勢[17-18]。然而由于卵形鯧鲹主要養(yǎng)殖模式是采用高密度的近海網(wǎng)箱養(yǎng)殖，隨著該養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展和無序擴張，海區(qū)負荷過大，養(yǎng)殖環(huán)境不斷惡化，導致卵形鯧鲹細菌性病害暴發(fā)日益頻繁?！厩叭搜芯窟M展】2007年，周素明等[19]首次從卵形鯧鲹上分離到停乳鏈球菌，隨后在2014年，黃婷等[20]從患病的卵形鯧鲹上同時分離到無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)和海豚鏈球菌。本實驗室于2012-2014年針對卵形鯧鲹進行流行病學調(diào)查，陸續(xù)從北海、湛江、深圳、珠海等地分離到無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、格式乳球菌和海豚鏈球菌，發(fā)現(xiàn)鏈球菌的分離頻率不斷增加，這表明鏈球菌病已成為威脅卵形鯧鲹健康養(yǎng)殖的主要病原之一?！颈狙芯壳腥朦c】目前采用的生化反應、藥敏試驗和電鏡觀察等傳統(tǒng)的診斷方法耗時費力，因此有必要開發(fā)一種經(jīng)濟有效的,能快速檢測出卵形鯧鲹感染鏈球菌情況的診斷技術?！緮M解決的關鍵問題】建立一個多重PCR體系，旨在快速、準確地檢測無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、海豚鏈球菌和格式乳球菌4種主要的致病菌，為卵形鯧鲹的健康養(yǎng)殖提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

實驗用陽性對照的4種菌株(表1)：停乳鏈球菌和格式乳球菌由中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所徐力文副研究員惠贈。無乳鏈球菌和海豚鏈球菌為本實驗室-20℃保存。

表1實驗用的4種參考菌株信息表

Table 1Information of reference strains used in the experiment

細菌Microorganism菌株Strain宿主Host采樣地點Geographicorigin停乳鏈球菌S.dysgalactiaeTS01卵形鯧鲹T.ovatus深圳Shenzhen無乳鏈球菌S.agalactiaeTS02卵形鯧鲹T.ovatus北海Beihai海豚鏈球菌S.iniaeTS04卵形鯧鲹T.ovatus北海Beihai格式乳球菌L.garvieaeTS03海鱸Lateolabraxja-ponicas珠海Zhuhai

病原菌菌株(表2)：2014年6～8月在北海和湛江兩地采集臨床癥狀有食欲不振、昏睡、眼球突出、眼角膜混濁等的患病卵形鯧鲹11份,無菌條件下，分別取患病卵形鯧鲹的腦、肝臟、脾臟和腎臟組織接種于血平板上，于30℃下恒溫培養(yǎng)24～48 h，挑取優(yōu)勢單菌落在血平板上再次劃線分離純化。

表2自然發(fā)病卵形鯧鲹的病原菌菌株信息表

Table 2Bacterial strains from natural infected golden pompano were detected by m-PCR

菌株Strain組織Tissue采樣日期Date采樣地點GeographicoriginTS07腦Brain20140615北海BeihaiTS08肝臟Liver20140615北海BeihaiTS09腦Brain20140718湛江ZhanjiangTS10腎臟Kidney20140718湛江ZhanjiangTS11脾臟Spleen20140718湛江ZhanjiangTS12肝臟Liver20140718湛江ZhanjiangTS13脾臟Spleen20140728湛江ZhanjiangTS14肝臟Liver20140728湛江ZhanjiangTS15脾臟Spleen20140828北海BeihaiTS16肝臟Liver20140828北海BeihaiTS17腎臟Kidney20140828北海Beihai

試劑：DNA提取試劑盒MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit、PCR試劑(10×PCR緩沖液、MgCl2、 dNTPs、Taq DNA聚合酶)購自大連寶生物工程有限公司;4K DNA Marker 購自北京全式金生物技術有限公司。

BHI培養(yǎng)基：1 000 mL水中加入24.5 g腦心浸出液肉湯、10 g酵母粉、2 g葡萄糖，固體培養(yǎng)基加15 g 瓊脂，121℃高壓滅菌20 min。

1.2方法

1.2.1細菌基因組DNA的提取

將實驗菌株接入BHI液體培養(yǎng)基中，于33℃恒溫搖床220 r/min振蕩培養(yǎng)24～48 h后,按照MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit試劑盒(TaKaRa,Japan)說明書提取細菌基因組DNA，提取后保存至-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物的設計和合成

依據(jù)無乳鏈球菌的特異性基因cfb的序列，停乳鏈球菌的特異性基因tuf的序列，海豚鏈球菌和格式乳球菌的16S rRNA序列設計4對引物(表3)，由廣州英濰捷基有限公司合成。

1.2.3多重PCR反應體系的建立

25 μL反應混和液內(nèi)含1.0 μL模板DNA,1.5 mmol/L MgCl2,0.4 mmol/L dNTPs,1 U TaqDNA 聚合酶,2.5 μL 10×PCR緩沖液。多重PCR反應條件：94°C 預變性5 min;94°C變性35 s,55°C 退火40 s,72°C延伸45 s，32個循環(huán);72°C延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物在1.0% 瓊脂糖凝膠進行電泳,溴化乙錠染色,紫外線下觀察、拍照。用膠回收試劑盒從瓊脂糖凝膠中回收純化目的PCR擴增產(chǎn)物，由廣州英濰捷基有限公司完成測序。

1.2.4多重PCR條件的優(yōu)化

通過調(diào)整4對引物之間的比例以及退火溫度的梯度變化(48.0℃、49.3℃、51.8℃、54.3℃、57.0℃、58.6℃)，從中優(yōu)化出最適條件。

1.2.5多重PCR靈敏性檢測

將提取備用的4種檢測菌株的基因組DNA分別稀釋為8×10-1ng/μL、 4×10-1ng/μL、 2×10-1ng/μL、1×10-1ng/μL、5×10-2ng/μL，按照已優(yōu)化的多重PCR反應條件進行PCR擴增，測定其靈敏性。

表3多重PCR引物序列以及預期擴增片斷大小

Table 3Primer sequences used for PCR amplification and the expected amplicon size

引物Primerparis序列(5'3')Sequences(5'3')目的基因Targetgene變性溫度Annealingtemperature(℃)片段大小PCRamplicon(bp)菌種Pathogen參考文獻ReferencescfbFcfbRAAGCGTGTATTCCAGATTTCCTCAGTAATCAAGCCCAGCAAcfb51470無乳鏈球菌S.agalactiae[21]tufFtufRGTAGTTGCTTCAACAGACGGGGCGATTGGGTGGATCAACTCtuf51795停乳鏈球菌S.dysgalactiae[22]PLGFPLGRCATAACAATGAGAATCGCGCACCCTCGCGGGTTG16SrRNA501100格式乳球菌L.garvieae[23]SiFSiRCACTAATCCAAAGAGTTTTAGGCGGCTGGCTCCTAA16SrRNA501391海豚鏈球菌S.iniae[24]

1.2.6多重PCR對臨床樣品的檢測

將從自然發(fā)病的卵形鯧鲹中分離純化到的病原菌接種于BHI液體培養(yǎng)基中，擴大培養(yǎng)后提取病原菌基因組DNA后，利用優(yōu)化的多重PCR體系檢測。為驗證多重PCR的結果，用通用引物27 F (5′-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3′)和1492 R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)擴增16S rRNA基因。PCR產(chǎn)物測序由廣州英濰捷基有限公司完成，將所得序列在Genebank 中進行比對分析。

2結果與分析

2.1多重PCR條件的優(yōu)化

對比測試4對引物之間的比例，結果顯示當多重PCR的反應體系中分別加入0.2 μmol/L引物cfb-F/cfb-R，0.08 μmol/L引物tuf-F/tuf-R，1.6 μmol/L引物Si-F/Si-R和0.4 μmol/L引物PLG-F/PLG-R，即比例為1∶0.4∶8∶2時，4條PCR產(chǎn)物能同時擴出來。如圖1所示，退火溫度為54.3℃時各條帶亮度均勻，沒有非特異條帶產(chǎn)生，說明54.3℃為最佳退火溫度。

1和7：4K DNA Marker;2：陰性對照;3：S.iniae TS04;4：L.garvieae TS03;5：S.parauberis TS01;6：S.agalactiae TS02;8～13：退火溫度依次為48℃、49.3℃、 51.8℃、54.3℃、57℃、58.6℃

1 and 7:4K DNA Marker;2:negative control;3:S.iniae TS04;4:L.garvieae TS03;5:S.parauberis TS01;6:S.agalactiae TS02;8 to 13:the optimization of annealing temperature at 48℃,49.3℃,51.8℃,54.3℃,57℃ and 58.6℃,respectively

圖1多重PCR對單種細菌的擴增以及最適退火溫度

Fig.1Specificity of the m-PCR assay for the detection of S.iniae (1 391 bp), L.garvieae (1 100 bp),S.parauberis (795 bp) and S.agalactiae (470 bp),and the optimization of annealing temperature

2.2多重PCR靈敏度檢測

對多重PCR反應體系進行靈敏度檢測，結果顯示最低檢測濃度為5×10-2ng/μL(圖2)。

1：4K DNA Marker;2：0.8 ng/μL;3：0.4 ng/μL;4：0.2 ng/μL;5：0.1 ng/μL;6：0.05 ng/μL

圖2多重PCR靈敏度檢測

Fig.2Sensitivity of the m-PCR assay

2.3臨床樣品多重PCR的檢測結果

如圖3所示，多重PCR成功擴增出海豚鏈球菌的特異條帶1 391 bp 2條，無乳鏈球菌的特異條帶470 bp 4條，其余5份樣品未見目的條帶。所有菌株的16S rRNA基因PCR產(chǎn)物經(jīng)測序、比對相似性分析表明，分離菌株TS07、TS08與已報道的海豚鏈球菌(NCBI序列號：KC748467)16S rRNA 基因序列相似性為99%，TS09、TS10、TS11、TS13與已報道的無乳鏈球菌(NCBI序列號：JQ039375)16S rRNA 基因序列相似性為99%，TS12、TS14與已報道的氣囊水棲菌Enhydrobacter aerosaccus(NCBI序列號：KF013200)16S rRNA 基因序列相似性為99%，TS15、TS16與已報道的副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus(NCBI序列號：CP006008),TS17與已報道的創(chuàng)傷弧菌Vibrio vulnificus(NCBI序列號：CP009261)16S rRNA 基因序列相似性為100%。

1，13：4K DNA Marker;2：TS07；3：TS08；4:TS09；

5：TS10；6：TS11；7：TS12；8：TS13；9：TS14；10：TS15；11：TS16；12：TS17

圖3自然發(fā)病卵形鯧鲹病原樣品的多重PCR檢測

Fig.3Detection of bacterial from naturally infected T.ovatus samples by m-PCR

3討論

由于傳統(tǒng)鑒定致病菌的生化反應、藥敏試驗和電鏡觀察等診斷方法耗時、費力，建立一個快速、經(jīng)濟、靈敏的診斷技術能有效得防止疾病的暴發(fā)。Henegariu等[25]認為多重PCR體系構建成功的關鍵在于各引物對之間的相對濃度、PCR緩沖液的濃度、氯化物和dNTPs之間的平衡以及循環(huán)的溫度。多數(shù)學者[26-28]則認為多重PCR體系的優(yōu)化主要為改變退火溫度、MgCl2、dNTPs和聚合酶的濃度等。Panangala等[29]建立多重PCR時通過調(diào)整引物之間的濃度，其中最高濃度引物是最低濃度引物的1.5倍。本研究中，通過預試驗顯示多重PCR體系構建成功關鍵參數(shù)為4對引物之間的比例和退火溫度，其中海豚鏈球菌的特異基因最難擴增。因此，在反應體系中大幅度提高了海豚鏈球菌引物Si-F/Si-R的濃度，使得引物Si-F/Si-R的濃度是tuf-F/tuf-R的20倍；此外，當退火溫度為54.3℃時，可避免目的條帶不均勻擴增，非特異性條帶的出現(xiàn)，確定54.3℃為最佳退火溫度。

3對引物cfb-F/cfb-R,PLG-F/PLG-R,Si-F/Si-R的特異性在之前的文獻中都用系統(tǒng)進化相關菌進行過驗證[21，24，30]，均未擴增出相關條帶，而tuf基因能夠區(qū)分分類關系上即使是最相近的鏈球菌種[22]，所以本研究并沒有對該多重PCR體系進行特異性驗證。本實驗最低能夠檢測到5×10-2ng/μL 的基因組DNA模板的質(zhì)量濃度，這和其他學者的研究結果類似，比如鰻弧菌Vibrio anguillarum的最低檢測濃度為50 pg，海豚鏈球菌、無乳鏈球菌、副乳房鏈球菌、格式乳球菌為12.5～50 pg[30-31]，因此，本實驗的靈敏度能夠達到對鏈球菌病診斷的需求。

另外，為了驗證多重PCR的可靠性，本實驗用通用引物擴增其16S rRNA基因，產(chǎn)物測序后經(jīng)過比對證明。值得注意的是，結果顯示同一條魚上的不同組織可能感染不同的細菌，這與黃婷等[20]報道從發(fā)病卵形鯧鲹上首次同時分離到無乳鏈球菌和海豚鏈球菌的結果一致，但是傳統(tǒng)觀念認為一條魚只能感染一種細菌，這可能與不同組織的感染途徑不同有關，有待于進一步進行深入研究。

4結論

初步建立的多重PCR反應體系中引物cfb-F/cfb-R,tuf-F/tuf-R,Si-F/Si-R,PLG-F/PLG-R的最適濃度分別為0.2 μmol/L、0.08 μmol/L、1.6 μmol/L和0.4 μmol/L;最優(yōu)退火溫度為54.3℃，能同時檢測無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、海豚鏈球菌和格式乳球菌4種主要的卵形鯧鲹致病鏈球菌，為卵形鯧鲹的健康養(yǎng)殖提供依據(jù)。

致謝

感謝中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所徐力文副研究員惠贈無乳鏈球菌和停乳鏈球菌。

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(責任編輯：竺利波)

Development of Multiplex PCR Assay for Detection of Main Streptococcosis Pathogens in Trachinoms ovatus

熊向英，蔡小輝，彭銀輝，黃國強，梁志輝，王志成**

XIONG Xiangying,CAI Xiaohui,PENG Yinhui,HUANG Guoqiang，LIANG Zhihui,WANG Zhicheng

(廣西海洋研究所,廣西海洋生物技術重點實驗室,廣西北海536000)

(Guangxi Key Laboratory of Marine Biotechnology,Guangxi Institute of Oceanology,Beihai,Guangxi,536000,China)

摘要：【目的】快速、準確地檢測卵形鯧鲹(Trachinoms ovatus)感染無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)、停乳鏈球菌(Streptococcus dysgalactiae)、海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)和格式乳球菌(Lactococcus garvieae)4種主要的致病菌，為卵形鯧鲹的健康養(yǎng)殖提供依據(jù)?！痉椒ā酷槍?種致病菌的特異基因設計特異性引物cfb-F/cfb-R,tuf-F/tuf-R,Si-F/Si-R,PLG-F/PLG-R，建立多重PCR反應體系，通過調(diào)試各引物對之間的最佳比例以及最適退火溫度，對反應體系進行優(yōu)化及靈敏度測試。2014年6～8月，應用該體系對北海及湛江各養(yǎng)殖場的發(fā)病卵形鯧鲹進行檢測，然后用通用引物擴增16S rRNA基因，經(jīng)測序、比對檢測體系的準確性?！窘Y果】反應體系中cfb-F/cfb-R,tuf-F/tuf-R,Si-F/Si-R,PLG-F/PLG-R的最適濃度分別為0.2 μmol/L，0.08 μmol/L，1.6 μmol/L和0.4 μmol/L;最優(yōu)退火溫度為54.3℃;4種目標菌的檢測靈敏度為5×10(-2) ng/μL；11份病原樣品檢測中，2份出現(xiàn)海豚鏈球菌的目的條帶，4份出現(xiàn)無乳鏈球菌的目的條帶，5份未見目的條帶，和測序分析結果一致?！窘Y論】多重PCR方法能代替?zhèn)鹘y(tǒng)的微生物檢測方法特異、快速、靈敏地檢測4種致病菌。

關鍵詞：多重PCR鏈球菌病無乳鏈球菌停乳鏈球菌格式乳球菌海豚鏈球菌

Abstract：【Objective】A method with multiplex PCR was developed for rapid and accurate detection of the four main streptococcosis pathogens of Streptococcus agalactiae,Streptococcus dysgalactiae,Streptococcus iniae,and Lactococcus garvieae isolated from golden pompano Trachinotus ovatus,in order to provide theoretical foundation for healthy aquaculture of Trachinotus ovatus.【Methods】Each of the four pairs of oligonucleotide primers including cfb-F/cfb-R,tuf-F/tuf-R,Si-F/Si-R,PLG-F/PLG-R exclusively amplified the target gene of the specific microorganism.The multiplex PCR was optimized by testing the proportion between the four sets of primers and the annealing temperature.And the sensitivity of the multiplex PCR assay was evaluated using pure DNA.A total of 11 pathogen samples were collected from cultured Trachinotus ovatus from June to August in 2014,and analyzed using the established multiplex PCR to test its applicability.To verify the results of the multiplex PCR,molecular identification was performed by amplification of 16S rRNA gene with universal primers.【Results】The optimized relative concentrations of the primers were 0.2 μmol/L each of cfb-F/cfb-R,0.08 μmol/L each of tuf-F/tuf-R,1.6 μmol/L each of Si-F/Si-R and 0.4 μmol/L each of PLG-F/PLG-R.The sensitivity of the multiplex PCR using purified DNA was 5×10(-2)ng/μL.The application results revealed that 2 of the pathogen samples were S.iniae,4 samples were S.agalactiae and no products were amplified from the other 5 pathogen samples.Sequencing of 16S rRNA and BLAST analysis were consistent with the results of the multiplex PCR.【Conclusion】The above results indicated that the multiplex PCR is a sensitive,specific and reproducible assay method for the simultaneous detection of four pathogenic bacteria that cause disease in golden pompano.Therefore,it could be a useful alternative to the conventional method for microbial detection.

Key words:multiplex PCR,Streptococcosis,Streptococcus agalactiae,Streptococcus dysgalactiae,Streptococcus iniae,Lactococcus garvieae

中圖分類號：S941

文章標識碼：A

文章編號：1005-9164(2016)01-0035-06

作者簡介：熊向英(1984-)，女，助理研究員，主要從事水產(chǎn)動物病原生物學研究。

收稿日期：2015-06-15

修回日期：2015-08-05

*廣西面上基金項目(2012GXNSFAA053065)，廣西科技攻關項目(桂科攻1222013-2)，廣西區(qū)直屬公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資金項目(GXIF-2012-02)和國家海洋局項目(201205028-4)資助。

**通訊作者：王志成(1962-)，男，副研究員，主要從事海水養(yǎng)殖研究,E-mail:WZC66666@126.com。

廣西科學Guangxi Sciences 2016,23(1):35～40

網(wǎng)絡優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-03-15

網(wǎng)絡優(yōu)先數(shù)字出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/45.1206.G3.20160315.1515.028.html