劉　杰，潘曉秋，周　暉，張海林，齊宏亮，廖　丹，倪雪松(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院鞍山醫(yī)院藥學(xué)部，遼寧 鞍山　114011)

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枸杞多糖的提取及其抗衰老的研究

劉杰*，潘曉秋，周暉，張海林，齊宏亮，廖丹，倪雪松(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院鞍山醫(yī)院藥學(xué)部，遼寧 鞍山114011)

DOI10.14009/j.issn.1672-2124.2016.03.029

摘要目的：優(yōu)選枸杞多糖的最佳提取工藝，通過建立D-半乳糖致衰老小鼠模型，研究枸杞多糖的抗衰老作用。方法：采用正交設(shè)計法對提取工藝進行研究；應(yīng)用D-半乳糖連續(xù)注射，造成實驗性衰老小鼠模型，通過測定血液丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)和過氧化氫酶(CAT)的含量及超氧化物歧化酶(SOD)的活力和皮膚中SOD、MDA及羥脯氨酸(Hyp)的水平來檢測枸杞多糖抗衰老的能力。結(jié)果：通過正交設(shè)計確定的枸杞多糖的最佳提取方案為：料液比為1∶30，提取2次，1次90 min，功率為100 kHz。通過研究可見，枸杞多糖可提高小鼠血液中SOD、CAT、GSH-px水平，降低MDA值；可提高小鼠皮膚SOD活力，降低皮膚MDA含量，提高Hyp含量。結(jié)論：本研究建立的提取方法簡單、易行，枸杞多糖的提出率高。枸杞多糖具有抗D-半乳糖所致小鼠衰老的作用。

關(guān)鍵詞枸杞多糖； 提??； 抗衰老； D-半乳糖

Research on the Extraction and Anti-aging of Lycium Barbarum Polysaccharide

LIU Jie, PAN Xiaoqiu, ZHOU Hui, ZHANG Hailin, QI Hongliang, LIAO Dan, NI Xuesong (Dept.of Pharmacy, the First Affiliated Anshan Hospital of China Medical University, Liaoning Anshan 114011, China)

ABSTRACTOBJECTIVE：To optimize the optimum extraction technology of lycium barbarum polysaccharide and establish senile mice model byD-galactose, so as to research the anti-aging effects of lycium barbarum polysaccharide. METHODS: Orthogonal design method was adopted to research the extraction technology. The senile mice model was established by injection ofD-galactose. The anti-aging capacibility of lycium barbarum polysaccharide were determined by the detection of malonaldehyde(MDA), glutathione peroxidase(GSH-PX), the content of catalase(CAT), activity of superoxide dismutase(SOD) and level of SOD, MDA and hydroxyproline(Hyp) in the skin. RESULTS: The optimum extraction technology scheme by orthogonal design method were: the ratio of solid to liquid was 1∶30, 2 times of extraction, 90 min for once, the power was 100 kHz. Lycium barbarum polysaccharide could increase the level of SOD, CAT and GSH-px in rats, decrease MDA, improve the SOD activity, decrease MDA and increase the content of Hyp in the skin of mice. CONCLUSIONS: The extraction method established by this research is simple and feasible, with high extraction rate of lycium barbarum polysaccharide. Meanwhile, lycium barbarum polysaccharide has significant effects on the senile mice model induced by injection ofD-galactose.

KEYWORDSLycium barbarum polysaccharide; Extraction; Anti-aging;D-galactose

枸杞子(Fructus Lycii)是茄科枸杞(Lycium barbarum L)成熟的果實，具有滋補肝腎，益精明目的功效。其主要化學(xué)成分為枸杞多糖、甜菜堿,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要用于增強免疫[1-2]，延緩衰老[3-4]，降低血糖[4-6]促進核酸和蛋白質(zhì)合成并具有抗腫瘤[7-8]、抗氧化[9-10]、治療心血管疾病等作用?？紤]到枸杞多糖的食用性，本研究選擇水做溶劑進行提取，探討枸杞多糖抗衰老的作用，現(xiàn)報告如下。

1材料

1.1藥品與試劑

枸杞(寧夏中寧縣杞香源貿(mào)易有限公司)；苯酚、濃硫酸(分析純)；D-半乳糖(北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司)；無水葡萄糖(河北圣雪葡萄糖有限責(zé)任公司)超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、羥脯氨酸(Hyp)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-px)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2動物

Wistar小鼠50只，購自大連醫(yī)科大學(xué)動物中心。

1.3儀器與設(shè)備

UV2100 ultraviolet and visible spectrophotometer[USA UNICO (Shanghai) Instrument Co.Ltd]；Analytical balance FA2004(Shanghai Balance Instrument Plant)；PT1600E型組織勻漿機(浙江機械廠)；DL-4000B冷凍離心機(河南凱達科學(xué)儀器有限公司)。

2方法

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取于105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖對照品0.100 5 g加入到100 ml量瓶中，用蒸餾水溶解并稀釋至刻度[11]。分別精密量取對照品儲備液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 ml置于100 ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，然后分別取1.0 ml置于具塞的試管中，分別加入5%的苯酚溶液1 ml，搖勻后加入濃硫酸5.0 ml，立即混勻后置于冷水浴中至室溫。以蒸餾水為空白對照，在490 nm處檢測吸光度值。以吸光度值為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程為Y=11.653X+0.039 2，r=0.999 6(n=6)。

2.2枸杞多糖的提取及含量的測定

根據(jù)預(yù)實驗，選擇對超聲水提工藝有影響的主要因素(溶劑用量、提取時間、超聲功率、提取次數(shù))按照四因素三水平進行L934正交試驗[12]。各因素水平見表1。樣品的測定方法同“2.1”項下，并按照下式計算枸杞中多糖的含量:多糖含量(%)=(C×Df/m)×100%(注：C=供試溶液中葡萄糖含量μg/ml；D=供試溶液的稀釋倍數(shù)；f=換算因子；m=樣品質(zhì)量μg)。

2.3動物模型的制作及分組

60只Wistar小鼠平均體質(zhì)量(25.00±1.00) g，雌雄各半，按隨機數(shù)字表法分為正常組、模型衰老組、模型維生素E組、用藥低劑量組、用藥中劑量組、用藥高劑量組，每組10只。正常組小鼠皮下注射1日100 mg/kg的0.9%氯化鈉注射液，灌服0.9%氯化鈉注射液1 ml/100 g·d；模型衰老組小鼠皮下注射D-半乳糖1日100 mg/kg，灌服0.9%氯化鈉注射液1 ml/100 g·d；用藥低劑量組小鼠皮下注射D-半乳糖1日100 mg/kg，灌服枸杞多糖水溶液10 mg/100g·d；用藥中劑量組小鼠皮下注射D-半乳糖1日100 mg/kg，灌服枸杞多糖水溶液20 mg/100 g·d；用藥高劑量組小鼠皮下注射D-半乳糖1日100 mg/kg·d，灌服枸杞多糖水溶液40 mg/100 g·d；模型維生素E組小鼠皮下注射D-半乳糖100 mg/kg·d，灌服枸維生素E溶液5 mg/100 g·d，連續(xù)30 d，灌胃和皮下注射均按照無菌操作進行的。

表1　超聲水提工藝各影響因素分析

2.4指標(biāo)檢測

眼眶取血，分離血清備用，并處死動物，將脫毛背部皮膚取下，除去脂肪和結(jié)締組織，稱質(zhì)量，以冰冷的0.9%氯化鈉注射液沖洗，置于勻漿器中，用9倍的0.9%氯化鈉注射液勻漿10 min，制備成10%的勻漿，然后4 000 r/min離心10 min，取上清液，備用。分別按照說明書的要求測試血清中的MDA含量、過氧化氫酶(CAT)、GSH-px的活性和紅細胞中SOD活力，以及皮膚中MDA、SOD、Hyp的水平。

2.5統(tǒng)計學(xué)方法

3結(jié)果

3.1多糖提取及含量測定

直觀分析和方差分析中可知各因素對枸杞多糖的提取工藝影響的主次順序為料液比>提取時間>超聲功率>提取次數(shù)。其中，料液比對提取工藝有顯著性影響，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，根據(jù)實驗結(jié)果可以確定枸杞多糖的最佳提取工藝為A3B3C3D2，即料液比為1∶30,提取2次，1次90 min，功率為100 kHz，正交試驗結(jié)果見表2，方差分析見表3。

3.2指標(biāo)檢測結(jié)果

3.2.1枸杞多糖對衰老模型小鼠血液中SOD、MDA、CAT、GSH-px活力的影響：與正常對照組比較，衰老模型組小鼠血液中SOD、CAT、GSH-px活力降低；用藥組(包括用藥低劑量組、用藥中劑量組和用藥高劑量組)和維生素E組可明顯提高SOD、CAT及GSH-px的活力，且隨著用藥濃度的增加提高的活力增加的越明顯。與正常對照組組比較，衰老模型組小鼠血液中MDA含量增高，用藥組和維生素E組均可降低衰老組MDA的值，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表4。

表2　枸杞多糖的正交試驗結(jié)果

表3　方差分析結(jié)果

3.2.2枸杞多糖對衰老模型小鼠皮膚SOD活力和MDA含量的影響：與正常對照組比較，衰老模型組小鼠皮膚SOD活力明顯降低，用藥組和維生素E組可明顯提高皮膚SOD的活力。以正常對照組比較，衰老模型組小鼠皮膚MDA含量升高，用藥組和維生素E均可降低MDA含量。與正常對照組比較，衰老模型組小鼠皮膚Hyp的含量顯著較少，用藥組和維生素E組均使含量提高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表5。

表4枸杞多糖對小鼠血液中SOD、MDA、CAT、GSH-px的

Tab 4Effects of lycium barbarum polysaccharide on SOD,

組別SOD/(U/mg)MDA/(nmol/mg)CAT/(U/mg)GSH-px/(mg/g)正常組(n=10)175.74±10.234.58±0.3525.18±1.62190.74±9.87模型衰老組(n=10)142.55±8.436.41±0.6218.64±1.34143.68±11.45模型維生素E(n=10)169.80±9.844.87±0.5122.37±1.48182.43±10.30用藥低劑量組(n=10)151.36±11.275.74±0.4719.21±1.26150.72±8.62用藥中劑量組(n=10)160.22±8.625.23±0.5321.59±1.07169.58±9.58用藥高劑量組(n=10)168.93±7.204.98±0.4922.09±1.17175.87±8.63

Tab 5Effects of lycium barbarum polysaccharide on SOD,

組別SOD/(U/mg)MDA/(nmol/mg)Hyp/(mg/g)正常組(n=10)253.57±7.503.62±0.286.75±1.78模型衰老組(n=10)138.93±6.897.33±0.543.17±0.29模型維生素E(n=10)192.74±7.424.13±0.266.08±0.32用藥低劑量組(n=10)145.62±6.276.03±0.374.57±0.47用藥中劑量組(n=10)170.85±5.985.27±0.425.22±0.53用藥高劑量組(n=10)190.23±6.034.58±0.355.92±0.44

4討論

超聲波提取法是利用超聲波增大物質(zhì)分子運動的頻率和速度，增加溶劑的穿透力，提高物質(zhì)溶出的速度，縮短提取時間，增大提取率。所以本實驗就選擇超聲波提取，簡單、快速、提出率高。

機體衰老后會出現(xiàn)SOD、CAT、GSH-PX的含量下降，體內(nèi)自由基清除劑減少，體內(nèi)的自由基增多，富集，引起不飽和脂肪酸氧化，形成大量的脂質(zhì)過氧化物。SOD是體內(nèi)清除自由基的中藥物質(zhì)，既能清除超氧陰離子自由基又能保護細胞免受損傷。GSH-px既能清除細胞內(nèi)有害的過氧化 產(chǎn)物又能切斷脂質(zhì)過氧化連鎖反應(yīng)。Hyp是構(gòu)成膠原蛋白和膠原纖維的主要成分，又是比較穩(wěn)定的氨基酸，可穩(wěn)定膠原蛋白的結(jié)構(gòu)，從而修復(fù)受損皮膚組織。過氧化脂質(zhì)是自由基損害作用的產(chǎn)物，可作為機體器官衰老的一個定量指標(biāo)，而MDA是脂質(zhì)過氧化物的終產(chǎn)物之一。本研究結(jié)果顯示，衰老模型組小鼠細胞代謝紊亂，皮膚的SOD活性減低，MDA含量增多，Hyp含量減少，說明皮膚膠原蛋白減少，成纖維細胞排列疏松，皮膚彈性減弱，說明皮膚處于衰老狀態(tài)。枸杞多糖可以使衰老模型組SOD、GSH-px、Hyp、CAT的含量提高，能降低MDA的含量，說明其通過提高機體自由基清除劑的活性，抑制自由基的長生，減少脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，保護組織免受氧化劑和自由基的攻擊，從而發(fā)揮抗衰老的作用[13]，具體機制有待研究。

參考文獻

[1]蕭閔，楊陽，劉洋洋，等.番茄紅素與枸杞協(xié)同增強小鼠免疫力的實驗研究[J].湖北中醫(yī)雜志，2010，32(7):8-9.

[2]董淑楠，朱柯蕙，印虹，等.枸杞多糖的理化性質(zhì)及其免疫調(diào)節(jié)研究進展[J].中國醫(yī)藥生物技術(shù)，2013，8(1):66-68.

[3]Raymond Chuen-Chung Chang and Kwok-Fai So.Use of Anti-aging Herbal Medicine ,Lycium barbarum,Againdst Aging-associated Diseases.What Do We Know So Far[J].Cell Mol Neurobiol，2008(28):643-652

[4]譚淑敏.枸杞降血糖作用的藥效學(xué)研究[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2008，28(11):2103-2104.

[5]丁園.枸杞多糖對2型糖尿病大鼠血糖、血脂的影響[J].遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2015,36(5):12-14.

[6]李曉冰，陳玉龍，展俊平，等.枸杞多糖對糖尿病大鼠血糖水平及機體免疫功能的影響[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2013，16(27):3208-3210.

[7]李卓能，張靖，周敦金，等.枸杞多糖對人前列腺癌DU-145細胞株體外抗腫瘤作用[J].公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué)，2013，24(5):3-6.

[8]徐月紅，徐蓮英，安文婷，等.枸杞抗腫瘤藥理作用研究概況[J].時珍國醫(yī)國藥，2000，11(10):946-947.

[9]Fang Mao,Bingxiu Xiao.Anticancer effect of Lycium barbarum polysaccharide on colon cancer cells involves G0/G1 phase arrest[J].Med Oncol，2011，28(1):121-126.

[10]張雅莉,黃曉旭,蔡美琴.枸杞多糖的抗氧化及緩解體力疲勞作用研究進展[J].上海交通大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版, 2015，35(6):911-914.

[11]龔濤，任大明，王楠，等.枸杞多糖提取工藝的研究[J].生物技術(shù)，2005，15(6):78-80.

[12]植飛，鄭衛(wèi)平，陳平，等.枸杞多糖水提工藝的優(yōu)選[J].中藥材，2004，27(12):948-950.

[13]梁杰，李響.枸杞多糖與丹參酮延緩小鼠皮膚衰老的實驗研究[J].中國實用醫(yī)藥，2009，4(9):5-6.

(收稿日期：2015-11-12)

中圖分類號R93

文獻標(biāo)志碼A

文章編號1672-2124(2016)03-0357-03

*主管藥師。研究方向：臨床藥學(xué)。E-mail:wpf133@sohu.com