張瑾成，魏　淼，許　琳，嚴(yán)　明

(南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇南京211800)

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一種新型醛酮還原酶的克隆表達(dá)、性質(zhì)研究以及在不對稱合成 (R)-CHBE中的應(yīng)用

張瑾成，魏淼，許琳，嚴(yán)明

(南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇南京211800)

摘要：為開發(fā)催化4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)制備(R)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯((R)-CHBE)的新型催化劑，挖掘到了來自白色念珠菌SC5314中的一種NADPH輔酶依賴型醛酮還原酶CAK基因(cak)，并將該基因在大腸桿菌中表達(dá)。將重組酶進(jìn)行純化后，測定其酶學(xué)性質(zhì)，并構(gòu)建了以葡萄糖為輔底物的雙酶偶聯(lián)輔酶再生系統(tǒng)，考察其不對稱轉(zhuǎn)化制備(R)-CHBE的能力。結(jié)果表明：CAK對多種醛酮類化合物有催化活性，其催化COBE的最適反應(yīng)溫度為40 ℃，最適pH為5。CAK在40 ℃下以及酸性條件中能保持較好的穩(wěn)定性。Mg(2+)、Na+、 K+對酶活有一定的激活作用，而Cu(2+)存在條件下酶會徹底失活。乙酸乙酯、鄰苯二甲酸二丁酯對酶活的抑制作用較小。利用雙酶偶聯(lián)輔酶再生系統(tǒng)不對稱轉(zhuǎn)化制備(R)-CHBE。在合適的條件下，轉(zhuǎn)化600 mmol/L的底物，產(chǎn)率達(dá)80.6%，產(chǎn)物對映體過量值(e.e.值)>99%。

關(guān)鍵詞：醛酮還原酶；NADPH再生；蛋白純化；酶學(xué)性質(zhì)；(R)-4-氯-3羥基丁酸乙酯

(R)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯((R)-CHBE)作為一種手性醇，是合成L-肉堿[1]、阿托伐他汀鈣[2]、(-)-大內(nèi)酰亞胺A[3]、(R)-γ-氨基-β-羥基丁酸(GABOB)[4]、負(fù)霉素[5]、(R)-4-氨基-3-羥丁酸[6]等手性藥物的重要中間體，全細(xì)胞催化還原4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)制備手性CHBE具有反應(yīng)條件溫和、操作工藝相對簡單、對環(huán)境污染小等優(yōu)勢，是目前首選的制備方法。早期的研究多采用野生細(xì)胞作為催化劑[7-8]，其缺點是產(chǎn)率及光學(xué)純度很低，且篩選野生型菌株非常困難。為了克服這些缺點，近年來的研究側(cè)重于將能夠不對稱還原COBE的酶在工程菌中過表達(dá)用于催化。目前，文獻(xiàn)報道的用于不對稱還原COBE制備(R)-CHBE的酶以醛酮還原酶[9](AKR)、短鏈脫氫酶[10](SDR)、羰基還原酶[11](CAR)為主，然而其中大多數(shù)酶在制備(R)-CHBE中仍然不能同時獲得較高的產(chǎn)率和光學(xué)純度。He等[12]將一種來自于鮭色鎖擲酵母的羰基還原酶SsCR用于不對稱還原制備(R)-CHBE，其產(chǎn)率和產(chǎn)品的光學(xué)純度均達(dá)到較高的水平(轉(zhuǎn)化600 mmol/L COBE，產(chǎn)率為100%，光學(xué)純度為大于99%)，但反應(yīng)需在有機-水兩相并添加輔酶的情況下進(jìn)行。

酶催化合成手性醇時需要輔酶NAD(P)H提供氫，額外添加會大大提高生產(chǎn)成本。引入另一種酶及輔底物構(gòu)建雙酶偶聯(lián)反應(yīng)，使NAD(P)+再生為NADPH，可以實現(xiàn)輔酶的循環(huán)，避免輔酶的持續(xù)添加。例如使用葡萄糖脫氫酶和葡萄糖就可以將NADP+再生為NADPH[13]。在全細(xì)胞催化中，為實現(xiàn)雙酶耦聯(lián)反應(yīng)，可以將用于不對稱還原COBE的酶與葡萄糖脫氫酶在大腸桿菌中共表達(dá)，相比于將兩種酶單獨表達(dá)，這種方式的效率通常會更高。

本研究利用基因數(shù)據(jù)挖掘的手段，發(fā)現(xiàn)一種白色念珠菌來源的醛酮還原酶CAK，將其在大腸桿菌中表達(dá)，研究其酶學(xué)性質(zhì)。同時構(gòu)建雙酶偶聯(lián)輔酶再生系統(tǒng)，將其應(yīng)用于不對稱轉(zhuǎn)化制備(R)-CHBE中，并對多個催化條件進(jìn)行優(yōu)化，以期實現(xiàn)經(jīng)濟高效催化制備(R)-CHBE的目的。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1菌株和試劑

E.coliDH5α、E.coliRosetta、質(zhì)粒pET-22b(+)及白色念珠菌(CandidaalbicansSC5314)基因組，保藏于筆者所在實驗室。

4-氯乙酰乙酸乙酯，F(xiàn)luka公司；(R)/(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma-Aldrich公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Prime STAR HS DNA 聚合酶，寶生物工程(大連)有限公司；蛋白質(zhì)marker，F(xiàn)ermentas公司；質(zhì)粒抽提試劑盒及DNA凝膠回收試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；抗生素及其余試劑，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.2培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基使用LB培養(yǎng)基[14]。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨25、酵母提取物15、 NaCl 10、乳糖3、 葡萄糖2。用于誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白的表達(dá)。

1.2方法

1.2.1醛酮還原酶CAK的克隆

根據(jù)來自白色念珠菌CandidaalbicansSC5314醛酮還原酶cDNA序列(GenBank:XM_714761)設(shè)計引物。上游、下游引物分別引入NdeI及NcoI酶切位點。上游引物為5′- G￣G￣A￣A￣T￣T￣C￣C￣A￣T￣A￣T￣G￣C￣C￣A￣G￣C￣T￣C￣A￣A￣T￣T￣G￣C￣A-3′，下游引物為5′-C￣A￣T￣G￣C￣C￣A￣T￣G￣G￣T￣T￣A￣A￣T￣C￣A￣T￣C￣A￣A￣A￣G￣T￣T￣G￣T￣T￣G￣A-3′(劃線處為酶切位點)以白色念珠菌基因組為模板，通過PCR獲得目的片段cak。cak片段和質(zhì)粒pET-22b(+)經(jīng)過NdeI和NcoI 37 ℃雙酶切、連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。在含有氨芐青霉素(100 μg/mL)和氯霉素(34 μg/mL)的抗性平板上挑取陽性克隆后抽提質(zhì)粒，送交南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

1.2.2醛酮還原酶CAK的表達(dá)

經(jīng)測序驗證后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主E.coliRosetta。接種于含氨芐青霉素(100 μg/mL )和氯霉素(34 μg/mL)的液體 LB 培養(yǎng)基中，于 37 ℃培養(yǎng),8 h后，將菌液按2%(體積分?jǐn)?shù))接種量轉(zhuǎn)接于 50 mL(500 mL三角燒瓶)含氨芐青霉素(100 μg/mL)和氯霉素(34 μg/mL)的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)3 h后，轉(zhuǎn) 30 ℃、220 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h。培養(yǎng)結(jié)束后，8 000 r/min離心20 min收集菌體。菌體用同體積 pH 7.0的Na3PO4緩沖懸浮后超聲破碎，8 000 r/min低溫離心20 min，收集到的上清液即為粗酶液。

1.2.3蛋白濃度測定及SDS-PAGE分析

蛋白濃度測定采用Bradford法[15]。SDS-PAGE采用分子克隆實驗指南[16]提供的方法，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%。粗酶液加入2× Loading Buffer后，95 ℃水浴5 min后上樣，上樣量為10 μL。

1.2.4酶活力測定

酶活力測定體系包括1 mmol/L NADPH、10 mmol/L底物COBE和pH 7.0 Na3PO4緩沖液，加入適當(dāng)粗酶液啟動反應(yīng)。于30 ℃下測定波長340 nm處吸光值的下降率。酶活定義:每分鐘內(nèi)氧化1 μmol NAD(P)H所需要的酶量為一個酶活單位U。其計算見式(1)。

(1)

式中：ΔA為340 nm處吸光值的變化值；ε為消光系數(shù)，取值為6 220；Vt為總反應(yīng)體積(mL)；Vs為酶液體積(mL)；L為光徑，取值為1 cm;t為反應(yīng)時間(min)。

1.2.5蛋白純化

將粗酶液進(jìn)行(NH4)2SO4沉淀以除去部分雜蛋白，再使用疏水層析柱進(jìn)行進(jìn)一步純化。層析柱首先用pH 7.4、含有1.5 mol/L (NH4)2SO4的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)預(yù)平衡。洗脫緩沖液為pH 7.4、20 mmol/L的磷酸鹽，采用0～100%緩沖液梯度洗脫。收集到的活性蛋白經(jīng)透析、離心處理后，最后得到的上清即為純化后的酶液。

1.2.6酶的底物譜測定

醛酮還原酶CAK的底物譜測定選用的底物主要包括醛類和酮類化合物：乙醛、戊二醛、正丁醛、正戊醛、辛醛、苯甲醛、甘油醛、丙酮醛、檸檬醛、乙酰乙酸乙酯、COBE、丙酮、丁酮、3-戊酮、2,3-戊二酮、2-辛酮、乙酰丙酮、甲基異丁基甲酮。分別將上述物質(zhì)以10 mmol/L的濃度加入酶活測定體系測定酶活。

1.2.7溫度對酶活及穩(wěn)定性的影響

將純化后的酶液分別在不同溫度的反應(yīng)條件下測定其酶活力，研究溫度對酶活的影響。將酶液置于20、25、30、35、40、45和50 ℃的水浴中，每隔10 min取樣，分別測定殘余酶活以研究酶的熱穩(wěn)定性。

1.2.8pH對酶活的影響及酶的pH穩(wěn)定性

使用不同pH的緩沖體系測定酶活，研究pH對酶活的影響，緩沖體系為pH 4.0～5.5醋酸鹽緩沖液、pH=5.5～7.5磷酸鹽緩沖液、pH 7.5～9.0 Tris緩沖液。將酶液分別置于pH=4.0～9.0的緩沖液中，4 ℃保存24 h后測定酶活力，研究酶的pH穩(wěn)定性。

1.2.9金屬離子對酶活的影響

向純化后的酶液中分別加入1 mmol/L的Mg2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Fe3+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Na+和K+，在4 ℃下孵育1 h后測定酶活，考察金屬離子對酶活的影響。

1.2.10有機溶劑對酶活的影響

向酶活測定體系中加入10%～50%(體積分?jǐn)?shù))的有機溶劑(乙酸乙酯、乙酸丁酯、辛酸乙酯、三氯甲烷、鄰苯二甲酸二丁酯、異丙醚)，分別測定酶活，考察金屬離子對酶活的影響。

1.2.11雙酶共表達(dá)菌株的構(gòu)建及表達(dá)

將葡萄糖脫氫酶gdh基因片段插入至重組質(zhì)粒pET-cak中cak片段下游實現(xiàn)雙酶共表達(dá)，具體方法：設(shè)計引物擴增gdh基因(來自巨大芽胞桿菌)并在gdh片段5′端引入SD-AS序列。上游引物為C￣A￣T￣G￣C￣C￣A￣T￣G￣G￣T￣A￣A￣G￣G￣A￣G￣G￣A￣T￣A￣T￣A￣C￣A￣T￣A￣T￣G￣T￣A￣T￣A￣C￣A￣G￣A￣T￣T￣T￣A￣A￣A￣A￣G(含NcoI酶切位點)，下游引物為A￣T￣A￣A￣G￣A￣A￣T￣G￣C￣G￣G￣C￣C￣G￣C￣T￣T￣A￣C￣T￣A￣G￣C￣C￣T￣C￣T￣T￣C￣C￣T￣G￣C(含NotI酶切位點)經(jīng)PCR擴增后，將重組質(zhì)粒pET-cak和片段分別用NcoI和NotI雙酶切，連接并經(jīng)測序驗證后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Rosetta中表達(dá)。制備粗酶液后用SDS-PAGE檢測。單獨測定粗酶液中2種酶的酶活：GDH酶活測定體系為1 mmol/L NADP+,10 mmol/L底物葡萄糖，pH 7.0 Na3PO4緩沖液，加入適量粗酶液啟動反應(yīng)。于30 ℃下測定波長340 nm處吸光值的上升率。酶活定義：每分鐘內(nèi)還原1μmol NADP+所需要的酶量為一個酶活單位U。

1.2.12生物轉(zhuǎn)化COBE至(R)-CHBE

低溫離心收集發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)的含重組質(zhì)粒pET-cak-gdh的雙酶共表達(dá)重組菌，以20 g/L的添加量添加入反應(yīng)體系中。反應(yīng)體系包括200～600 mmol/L的底物COBE、800 mmol/L的葡萄糖以及Na3PO4緩沖液。轉(zhuǎn)化反應(yīng)在恒溫?fù)u床200 r/min的條件下進(jìn)行，并定時調(diào)節(jié)pH至初始值。

1.2.13底物及產(chǎn)物的氣相檢測方法

COBE與CHBE濃度采用氣相色譜儀(Agilent 7820A)測定。PEG20M毛細(xì)管柱(20 m×0.32 mm×0.25 μm)；載氣為N2，分流比1∶ 20；氣化和檢測室的溫度220 ℃，梯度升溫(初始溫度130 ℃，保持3 min；以20 ℃/min程序升溫至135 ℃，保持7 min；再以40 ℃/min程序升溫至150 ℃，保持3 min；再以20 ℃/min程序升溫至160 ℃，保持1 min)；檢測器為FID。COBE和CHBE的出峰時間分別為9.713 min和13.838 min。

產(chǎn)物對映體過量值(e.e.)的測定也同樣使用氣相色譜儀，分析條件：色譜柱CP-Chirasil Dex CB(25 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為高純氮，分流比1∶ 50；進(jìn)樣室和檢測室溫度250 ℃。(R)-CHBE和(S)-CHBE出峰時間分別為16.813 min和17.413 min。

2結(jié)果與討論

2.1基因數(shù)據(jù)挖掘獲得醛酮還原酶CAK

以目前文獻(xiàn)報道的幾種可用于不對稱還原COBE合成(R)-CHBE的氧化還原酶(ARI、ByueD、gox2036、LEK、CmAR等)的氨基酸序列作為探針，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索，發(fā)現(xiàn)1種來自白色念珠菌Candidaalbican的假定蛋白，其氨基酸序列與氧化還原酶LEK的氨基酸序列相似度大于50%，據(jù)此認(rèn)為該假定蛋白具有不對稱還原制備(R)-CHBE的潛力。又經(jīng)BLAST工具搜索，發(fā)現(xiàn)該蛋白的氨基酸序列與多種醛酮還原酶的氨基酸序列具有顯著的相似性(超過40%相似性)，這說明此蛋白屬于醛酮還原酶超家族，將此酶命名為CAK。

2.2醛酮還原酶CAK的克隆、表達(dá)及純化

將PCR擴增后的cak基因片段和質(zhì)粒pET-22b(+)分別雙酶切后進(jìn)行連接，經(jīng)測序驗證完全正確。將得到的重組質(zhì)粒命名為pET-cak。將pET-cak轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主大腸桿菌Rosetta，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)，超聲破碎菌體得到了粗酶液。文獻(xiàn)報道的醛酮還原酶絕大多數(shù)為NADPH輔酶依賴型，本實驗酶活測定也選擇NADPH作為輔酶，使用NADH作為輔酶檢測不到任何活性。經(jīng)計算，粗酶液比酶活為4.3 U/mg。粗酶液經(jīng)純化后，用SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，目標(biāo)蛋白大小與預(yù)期一致(約3.3×104)，純化后的酶液比酶活達(dá)到9.3 U/mg。

1—重組菌粗酶液; 2—經(jīng)(NH4)2SO4初步純化;3—經(jīng)疏水層析純化; 4—標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)圖1　　　蛋白純化SDS-PAGE電泳圖Fig.1　　　SDS-PAGE analysis of purified CAK

2.3酶的底物譜測定

醛酮還原酶的底物譜主要由醛類和酮類化合物構(gòu)成，CAK的底物譜測定結(jié)果如表1所示。由表1可見，CAK對于醛類的底物譜較寬，對多種醛類有催化活力且活力較高。其對丙酮醛的催化活力最高，

表1　CAK的底物譜測定

酶活達(dá)到18.64 U/mg。相比較而言，CAK能夠催化的酮類化合物種類比較少，在所有測定的酮類化合物中，除乙酰乙酸乙酯、COBE、2,3-戊二酮這類帶有α酮基的化合物外，其他酮類均測不到活性。

2.4溫度對酶活的影響結(jié)果

考察溫度(20～50 ℃)對CAK酶活的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知：在40 ℃時，醛酮還原酶CAK的活力達(dá)到最高；低于40 ℃時，酶活力受到了抑制；而當(dāng)溫度超過40 ℃時，雖然較高的溫度可使酶促反應(yīng)速率加快，但是此時蛋白變性對酶活的抑制作用更加明顯，所以酶活力開始呈現(xiàn)下降趨勢。

圖2　　　溫度對CAK酶活的影響Fig.2　　　Effects of temperature on activity of CAK

2.5CAK的熱穩(wěn)定性

不同的溫度條件下研究CAK的熱穩(wěn)定性，結(jié)果見圖3。由圖3可知：其在40 ℃以下能保持較好的穩(wěn)定性；而當(dāng)在45 ℃條件下保溫0.5 h后，酶活幾乎完全喪失。這表明在超過45 ℃的條件下，酶的空間結(jié)構(gòu)很容易被破壞。Wang等[17]報道了一種Lodderomyceselongisporus來源的用于制備(R)-CHBE的醛酮還原酶，其在40 ℃下保溫0.5 h后僅有20%的殘余酶活，相比較而言，CAK的熱穩(wěn)定性要略高一些。

圖3　　　CAK的溫度穩(wěn)定性曲線Fig.3　　　Thermostability of CAK

2.6pH對酶活的影響

考察不同pH對醛酮還原酶的酶活影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知：在pH為5時酶活最高，在pH 4～7之間，酶活力保留了最大酶活的70%以上。在堿性條件下，酶活會受到較大程度的抑制。這可能是因為在偏酸性的環(huán)境中，CAK酶分子活性中心的空間構(gòu)象更有利于與底物的結(jié)合，表現(xiàn)出了更高的催化活性。

圖4　　　pH對CAK酶活的影響Fig.4　　　Effects of pH on activity of CAK

2.7CAK的pH穩(wěn)定性

圖5比較了酶在不同pH條件下保存24 h后的殘余酶活。由圖5可知：CAK在酸性條件下較為穩(wěn)定。而當(dāng)pH大于8時，酶活損失嚴(yán)重。其原因可能是在堿性環(huán)境下，OH-濃度的增加，使得酶活性中心的結(jié)構(gòu)更容易發(fā)生不可逆的改變，從而導(dǎo)致其催化活力急劇降低。因此，CAK不宜保存在堿性的緩沖液中。

圖5　　　CAK的pH穩(wěn)定性曲線Fig.5　　　pH stability of CAK

2.8金屬離子對CAK酶活的影響

考察多種金屬離子對CAK酶活的影響，結(jié)果見表2。由表2可知：其中Mg2+、Na+、K+對酶活有一定的激活作用，其余金屬離子均對酶活有抑制作用，其中添加Cu2+使酶完全失活。該結(jié)果表明，CAK對某些金屬離子尤其是Cu2+較為敏感，少量的Cu2+就可以使酶的空間結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致其完全喪失活性，因此，在催化體系中應(yīng)該避免Cu2+的引入。

表2　金屬離子對酶活的影響

2.9有機溶劑對CAK酶活的影響

催化轉(zhuǎn)化COBE的反應(yīng)中，為增加底物的溶解性，降低底物和產(chǎn)物對酶的毒害作用，通常會加入有機溶劑，但有機溶劑本身也可能會抑制酶活性[18]。COBE和CHBE在乙酸乙酯、乙酸丁酯、辛酸乙酯、三氯甲烷、鄰苯二甲酸二丁酯、異丙醚這幾種有機溶劑中的油水分配系數(shù)都較高，表明這些有機溶劑具備用于有機-水雙相催化制備CHBE的潛力。本實驗考察上述有機溶劑及其加入量對酶活的影響，以不加有機溶劑體系的相對酶活為100%，結(jié)果見圖6。由圖6可知：所有的有機溶劑均對酶活有抑制作用，其中乙酸乙酯、鄰苯二甲酸二丁酯的抑制作用相對較小，當(dāng)有機相體積分?jǐn)?shù)達(dá)到50%，時CAK尚有60%左右的殘余酶活。

圖6　　　有機溶劑對酶活的影響Fig.6　　　Effects of organic solvents on activity of CAK

2.10CAK和GDH的共表達(dá)及酶活測定

雙酶共表達(dá)重組菌粗酶液經(jīng)SDS-PAGE鑒定，結(jié)果見圖7。由圖7可見，目的條帶明顯，相對分子質(zhì)量與預(yù)期一致，2種酶在大腸桿菌中均得到了良好的可溶性表達(dá)。經(jīng)計算，粗酶液中CAK和GDH的酶活分別為2.5和6.2 U/mg(以1 mg蛋白計)。

1—雙酶共表達(dá)粗酶液; 2—細(xì)胞破碎液(沉淀); 3—細(xì)胞破碎液(全菌); 4—標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)圖7　　　雙酶共表達(dá)蛋白電泳Fig.7　　　SDS-PAGE analysis of co-expressing

2.11底物濃度對輔酶再生系統(tǒng)不對稱催化還原COBE的影響

圖8　　　底物濃度對輔酶再生體系催化　　　合成(R)-CHBE的影響Fig.8　　　Effects of COBE concentration on the　　　synthesis of (R)-CHBE by coenzyme　　　regeneration system

利用醛酮還原酶CAK和葡萄糖脫氫酶共表達(dá)的重組大腸桿菌細(xì)胞，以及在催化體系中添加的輔底物葡萄糖來實現(xiàn)輔酶再生。反應(yīng)體系的pH設(shè)定為6.0，溫度設(shè)定為35 ℃。圖8表示了不同底物濃度下，雙酶共表達(dá)重組菌全細(xì)胞催化還原COBE的產(chǎn)率隨時間變化的曲線。由圖8可知：在底物濃度為400 mmol/L以下時，經(jīng)過24 h的催化反應(yīng)，底物幾乎都能轉(zhuǎn)化完畢(產(chǎn)率大于99%)。當(dāng)?shù)孜餄舛瘸^500 mmol/L時，反應(yīng)24 h的產(chǎn)率降低至80%以下，這可能是因為體系中積累了高濃度的產(chǎn)物CHBE，抑制了醛酮還原酶CAK的活性，使反應(yīng)難以繼續(xù)進(jìn)行。測定最終產(chǎn)物的對映體過量值(e.e.值)，結(jié)果均在99%以上。

2.12反應(yīng)溫度對輔酶再生系統(tǒng)不對稱催化還原COBE的影響

考察溫度對催化體系的影響，采用較高的初始底物濃度(600 mmol/L)，pH設(shè)定為6.0，經(jīng)24 h反應(yīng)，測定并計算最終的產(chǎn)率，結(jié)果如圖9所示。由圖9可見，30 ℃的溫度條件下產(chǎn)率最高。較高和較低的反應(yīng)溫度均不利于轉(zhuǎn)化，這是因為低溫(低于30 ℃)的轉(zhuǎn)化條件降低了酶促反應(yīng)速率，必然會使最終產(chǎn)率降低。而較高的溫度則會使酶失活，另外，溫度越高，底物和產(chǎn)物也就越容易發(fā)生水解，這些原因都導(dǎo)致了最終產(chǎn)率的降低。

圖9　　　反應(yīng)溫度對輔酶再生體系催化　　　合成(R)-CHBE的影響Fig.9　　　Effects of temperature on the synthesis of (R)-　　　CHBE by coenzyme regeneration system

2.13pH對輔酶再生系統(tǒng)不對稱催化還原COBE的影響

考察不同pH的緩沖體系(pH 4～8)用于催化反應(yīng),轉(zhuǎn)化600 mmol/L底物，于30 ℃反應(yīng)24 h后，測定并計算產(chǎn)率，結(jié)果見圖10。由圖10可知：當(dāng)反應(yīng)體系的pH為7時可達(dá)到最高產(chǎn)率(80.6%)，這與CAK的最適pH(pH為5)有一定出入。這是因為GDH在pH大于7時才能表現(xiàn)出高活性，在酸性條件下其酶活力較低，使得輔酶再生的效率有所下降。

圖10　　　pH對輔酶再生體系催化合成　　　(R)-CHBE的影響Fig.10　　　Effects of pH on the synthesis of (R)-CHBE　　　by coenzyme regeneration system

3結(jié)論

從白色念珠菌中克隆了1種具有不對稱還原COBE的醛酮還原酶CAK，并在大腸桿菌中成功表達(dá)。對CAK進(jìn)行純化后，研究其酶學(xué)性質(zhì)：CAK對多種醛酮類化合物有催化活性；其催化COBE的最適反應(yīng)溫度為40 ℃，最適pH為5；酶在40 ℃以下能保持較好的熱穩(wěn)定性，在弱酸性條件下酶的性質(zhì)最穩(wěn)定，堿性環(huán)境中酶活損失較大；Mg2+、Na+、 K+的添加對酶有激活作用；多種有機溶劑均對酶活有抑制作用，而乙酸乙酯、鄰苯二甲酸二丁酯對CAK的酶活影響相對較小。通過CAK和葡萄糖脫氫酶在大腸桿菌中共表達(dá)，構(gòu)建輔酶再生體系，利用該體系催化不對稱合成(R)-CHBE，在最適的轉(zhuǎn)化條件下(30 ℃，pH=7)轉(zhuǎn)化600 mmol/L的底物，產(chǎn)率達(dá)80.6%，且產(chǎn)物的e.e.值超過99%，表明這種制備(R)-CHBE的方式具有良好的應(yīng)用前景。

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(責(zé)任編輯荀志金)

Overexpression,characterization of a novel aldo-keto reductase for asymmetric synthesis of (R)-CHBE

ZHANG Jincheng,WEI Miao,XU lin,YAN Ming

(College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China)

Abstract：An NADPH-dependent aldo-keto reductase(CAK)gene from Candida albicans SC5314 was discovered for reducing 4-chloroacetoacetate ethyl ester (COBE) to ethyl (R)-4-chloro-3-hydroxybutanoate ((R)-CHBE). The CAK gene was cloned and overexpressed in Escherichia coli Rosetta. The catalytic properties of purified CAK were studied. Furthermore,an enzyme-coupled coenzyme regeneration system with co-substrate glucose was constructed,and its capability of reducing COBE to (R)-CHBE was studied. The results showed that CAK had catalytic activity for a variety of aldehydes and ketones. CAK had a maximum activity at 40 ℃ and pH 5. The enzyme was stable below 40 ℃ and under acidic conditions. Mg(2+),Na+ and K+ could enhance the activity of CAK. When Cu(2+) was added, no enzyme activity was detected. The inhibit effect of ethyl acetate and dibutyl-O-phthalate was relatively light. When the coenzyme regeneration system for conversion reaction was applied,the molar conversion yield reached 80.6% with 600 mmol/L COBE,and the e.e. value was over 99%.

Keywords：aldo-keto reductase; NADPH regeneration;protein purifying; enzyme property;(R)-4-chloro-3-hydroxybutanoic acid ethyl ester

中圖分類號：Q815

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1672-3678(2016)02-0033-08

作者簡介：張瑾成(1989—)，男,江蘇無錫人，研究方向：生物催化；嚴(yán)明(聯(lián)系人)，副教授，E-mail ：yanming@njtech.edu.cn

基金項目：國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)(2011CBA00804)；國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)(2012AA022101)；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程

收稿日期：2015-03-17

doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2016.02.007