楊蘭蘭，張小里，封娟娟，朱南南，趙彬俠

(西北大學化工學院，陜西西安710069)

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磷脂酶D高產菌株的原生質體紫外誘變選育

楊蘭蘭，張小里，封娟娟，朱南南，趙彬俠

(西北大學化工學院，陜西西安710069)

摘要：為了獲得磷脂酶D高產菌株，由鏈霉菌野生菌株LD0501出發(fā)研究原生質體的制備和再生條件，建立原生質體紫外誘變篩選方案。采用酶解法制備原生質體，用紫外線對原生質體誘變，TLC檢測突變株產磷脂酶D活力。原生質體的適宜條件：種子培養(yǎng)基中甘氨酸質量濃度5 g/L，菌齡72 h，用3 mg/mL的溶菌酶在30 ℃下酶解75 min。通過原生質體誘變篩選，得到1株高產菌株，磷脂酶D水解活力達4.29 U/mL，提高幅度為180.4%。該方法有效改善了鏈霉菌野生菌株原生質體的制備效果，紫外誘變篩選顯著提高了磷脂酶D的活力，高產突變株具有較好的穩(wěn)定性。

關鍵詞：磷脂酶D；原生質體；紫外誘變；篩選

磷脂酶D(phospholipase D，PLD)普遍存在于生物界中，是重要的細胞磷脂代謝酶，通過磷酸二酯鍵，催化水解卵磷脂(PC)產生磷脂酸(PA)和游離膽堿。PLD亦能在醇類物質存在下催化磷脂?；D移反應制備(合成)磷脂或稀有磷脂[1-2]。磷脂在食品工業(yè)中起到乳化、濕潤和分散作用，在醫(yī)藥中是抗腫瘤藥物制劑的重要輔料。鏈霉菌屬微生物是常用磷脂酶D的生產菌株，但野生菌株酶活較低(<1.5 U/mL)，因此，通過篩選及改良獲得高產菌株是提高磷脂酶D活力的重要途徑。

目前，國外利用微生物發(fā)酵生產PLD的研究報道較多，研究者通過野生菌株篩選、基因重組等方法篩選高產菌株，已經取得了一定的效果[3]。與之相比，國內研究磷脂酶D菌株選育的報道較少，文獻報道的磷脂酶D高產菌株酶活為3～3.5 U/mL[4]。筆者所在團隊前期采用誘變劑處理孢子來選育磷脂酶D高產菌株，取得了一定效果[5]，但變異株穩(wěn)定性較差，酶活力亦有待進一步提高。由于去除細胞壁的原生質體對誘變劑更加敏感，較易發(fā)生突變，目前利用原生質體誘變技術選育竹紅菌甲素[6]、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶和檸檬酸[7]等高產菌株已有不少成功報道，但還沒有通過原生質體誘變選育PLD優(yōu)良菌株的報道。本文中，筆者研究產磷脂酶D鏈霉菌株的原生質體制備和再生，進而對其進行紫外誘變，改良菌株的產酶能力，以期篩選得到磷脂酶D的高產菌株，從而為磷脂酶D的工業(yè)化發(fā)酵生產奠定基礎。

1材料與方法

1.1出發(fā)菌株

磷脂酶 D 產生菌Streptomycessp. LD0501，保藏于筆者所在實驗室。

1.2培養(yǎng)基、溶液和試劑

PDA培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基配制參照文獻[5]；微量元素溶液、TES緩沖液、P溶液、再生培養(yǎng)基配制參照文獻[8]。溶菌酶，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3原生質體的制備與再生

1.3.1單孢子懸浮液的制備

從斜面刮取成熟的孢子到9 mL 無菌生理鹽水的試管中，用玻璃珠將其打碎，三層濾紙過濾，無菌生理鹽水調整孢子密度106～107個/mL。

1.3.2原生質體的制備

用移液管移取 0.5 mL 的孢子懸浮液接種到含有一定量甘氨酸的20 mL菌絲體培養(yǎng)液體中，28 ℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)48 h，4 000 r/min離心10 min，收集菌絲體，超聲30 min，菌絲體振蕩打碎，使其便于溶解。然后再用0.3 mol/L 的蔗糖溶液洗1次,P 溶液復洗2次。加入適量的溶菌酶，放入 30 ℃的水浴鍋中，每隔 7～8 min拿出來輕輕搖晃一下，60 min后，3 500 r/min離心10 min去除上層清液，最后500 r/min離心5 min保留上層清液，即得到原生質體懸浮液。用 P 緩沖液調整原生質體懸浮液到合適的濃度，接種到再生培養(yǎng)基；用無菌蒸餾水調整原生質體懸浮液到合適濃度，接種到 PDA 培養(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng)7 d，計數(shù)菌落。

1.4原生質體的計數(shù)方法

原生質體的計數(shù)按上述方法進行，再按式(1)～(2)計算原生質體的形成率與再生率。

(1)

(2)

式中：A為原生質用 P 溶液稀釋后涂布于再生平板上存活的菌落數(shù)；B為原生質體用無菌水稀釋后涂布于 PDA 平板上存活的菌落數(shù)；C為酶解前菌絲體涂布于PDA上長出的菌落數(shù)。

1.5單孢子及原生質體紫外誘變選育

將制備好的單孢子和原生質體懸浮液各用無菌移液管吸約4 mL，分別滴到含有大頭針、直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中，置于15 W紫外燈下距離30 cm處均勻照射一定時間(0、15、30、45、60、90、120和150 s)，然后把照射過的菌懸液稀釋于無菌生理鹽水中，取合適濃度的0.1 mL 單孢子和原生質體誘變菌分別滴到PDA培養(yǎng)基和再生培養(yǎng)基上并涂勻，每個濃度涂3套平板。將平板用黑塑料袋包嚴置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，然后再正常培養(yǎng) 3～7 d后計菌落數(shù)，統(tǒng)計其致死率。

1.6搖瓶初篩

挑選再生平板上生長飽滿且水解圈較大的誘變菌落60株，每個菌落接種于100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，28 ℃、200 r/min條件下發(fā)酵7 d，離心收集發(fā)酵液，對發(fā)酵液進行酶活力測定，每樣做3個平行，取均值。

1.7分析方法

磷脂酶D水解活力測定采用TLC方法，參照文獻[5]， 菌絲干質量是用10 mL 發(fā)酵液，離心收集沉淀，110 ℃烘至恒質量，稱量計算，每樣做3個平行，取均值。

2結果與討論

2.1原生質體的制備與再生

2.1.1甘氨酸濃度對原生質體形成量的影響

甘氨酸分子結構與D-丙氨酸的結構相似，因此在菌絲體培養(yǎng)液中加入甘氨酸可代替D-丙氨酸摻入到細胞壁，干擾細胞壁肽聚糖之間的交聯(lián)，引起新合成的細胞壁的不完整，有利于提高溶菌酶對鏈霉菌菌絲體細胞壁的敏感度。然而，甘氨酸濃度過高不僅會影響溶解菌絲體所需的數(shù)量，還會影響細胞壁的形成，使得原生質體的再生細胞壁的條件受到一定程度的阻礙。為此，筆者在菌絲體培養(yǎng)基中分別加入不同質量濃度的甘氨酸，測定原生質體的密度和菌絲體生長情況，結果如表1所示。

表1　甘氨酸添加量對原生質體形成的影響

注：菌絲體的濕質量以20 mL發(fā)酵液中的菌體質量計。

圖1　　　菌齡、溶菌酶濃度、酶解時間、酶解溫度對原生質體形成率和再生率的影響Fig.1　　　Effects of mycelium age,lysozyme concentration,enzymolysis time,enzymolysis temperature　　　on protoplast formation and regeneration

由表1可知：在甘氨酸質量濃度低于5 g/L時，原生質體的形成量隨著甘氨酸質量濃度的增加不斷增加，但高于5 g/L時，原生質體的形成量開始呈現(xiàn)下降趨勢。甘氨酸濃度的持續(xù)增加，表現(xiàn)出對菌絲體生長情況的抑制程度不斷加強。甘氨酸質量濃度在5 g/L時，原生質體的形成最佳。

2.1.2菌齡、溶菌酶解濃度、酶解溫度、酶解時間原生質體形成率和再生率的影響

鏈霉菌原生質體是通過溶菌酶水解菌絲體細胞壁形成的，不同的鏈霉菌種屬性也不盡相同，還有溶菌酶自身的性質也有差異，所以合適的菌齡和溶菌酶濃度對原生質體的形成有至關重要的作用。不同種齡的菌絲生理活性不同，對溶菌酶的敏感度也有差異，一般處于對數(shù)生長期的菌體利于原生質體的制備和再生。研究了菌齡、溶菌酶濃度、酶解溫度、酶解時間原生質體形成率和再生率的影響，結果如圖1所示。由圖1(a)可以看出：菌齡為72 h時，原生質體的形成率和再生率達到最高。溶菌酶濃度太低，水解緩慢，會影響原生質體的形成和再生，但溶菌酶濃度過高，酶解時間過長，就會導致脫壁現(xiàn)象太徹底，破壞了原生質體再細胞壁所需的引物，雖然原生質體的形成率會不斷增加，但嚴重影響了原生質體的再生率。由圖1(b)和圖1(c)可以看出：溶菌酶濃度越大，酶解時間越長，原生質體形成率越大。兼顧原生質體形成率和再生率，溶菌酶最佳質量濃度為3 mg/mL，最適酶解時間為75 min。溫度對酶的活性有很大影響，在一定范圍內，溫度升高，溶菌酶活性越好，原生質體形成量也會增加，但溫度達到一定程度，會使溶菌酶的活性鈍化，原生質體的形成量也會減少。由圖1(d)可以看出酶解溫度為30 ℃時，原生質體的形成率和再生率效果最好，即30 ℃為最佳酶解溫度。

2.2單孢子和原生質體的紫外劑量的確定

原生質體沒有細胞壁的保護，應該能更敏感接受紫外線的照射，但是實驗結果表明，同一紫外誘變下，原生質體較單孢子有更強的紫外線耐受能力。 可能是由于原生質體懸于含有黏性很大的P緩沖液中，原生質體聚集成團，所以致死需要更長的誘變時間。研究了單孢子和原生質體的紫外劑量，結果如圖2所示。

圖2　　　紫外線處理的誘變致死率Fig.2　　　Death rate of UV mutation

由圖2可知：單孢子懸液和原生質體經紫外照射后，隨照射時間的增加，致死率上升;0～30 s范圍內，曲線急劇上升，致死率變化顯著，30 s以后，曲線上升趨于平緩。但原生質體較單孢子紫外線耐受能力更強，單孢子隨誘變劑量的增加，致死率上升更迅速，單孢子在90 s時，致死率為100%，而原生質體在120 s為100%。大量實驗研究表明[9-10]，致死率為80%左右的正突變率相對較高，因此，采用45 s為最合適的誘變劑量。

2.3初篩和搖瓶復篩

經過初篩得到6株高產突變株，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基進行搖瓶復篩，設置3個搖瓶平行實驗，在28 ℃、200 r/min條件下發(fā)酵7 d，測定其產酶能力，結果見圖3。

圖3　　　突變株紫外誘變結果Fig.3　　　Enzyme activity of mutant strains　　　during fermentation

由圖3可知，經過初篩選出的6株高產菌株有較高的酶活，其中編號32號仍是酶活最高的突變菌株，酶活力為4.29 U/mL。

2.4突變株的遺傳穩(wěn)定性測定結果

將編號32突變株連續(xù)搖瓶傳代5代，每代培養(yǎng)時間為7 d,測定每代的發(fā)酵液，結果見表2。由表2可知，該菌株傳代5代后，其相對酶活力為原菌株的97.2%，說明該菌株有穩(wěn)定的遺傳特征。

表2　編號32菌株的遺傳穩(wěn)定性

2.5鏈霉菌PLD0501形態(tài)學特征

觀察原生質體誘變后再生平板上的成熟菌落，同時觀察搖瓶發(fā)酵對數(shù)生長期時菌絲體的生長狀況，如表3所示。

表3　出發(fā)菌株和高產菌株菌落的形態(tài)

2.6高產菌株磷脂酶D的發(fā)酵特性

突變菌株和出發(fā)菌株隨時間變化的發(fā)酵性能如圖4所示。由圖4可知：鏈霉菌在發(fā)酵的進程中，基本在對數(shù)生長期才開始有磷脂酶D出現(xiàn)，在穩(wěn)定期(第6天)時，磷脂酶D的水解活力達到最高，突變菌株的磷脂酶D水解活力(4.29 U/mL)大約是出發(fā)菌株水解活力(1.53 U/mL)的3倍，除此之外，突變菌株磷脂酶D水解活力的增長速率(0.086 U/(mL·h))(在對數(shù)期初期，第3天)是出發(fā)菌株的(0.035 U/(mL·h))2.5倍。但在穩(wěn)定期之后磷脂酶D水解活力有下降的趨勢，可能是由于發(fā)酵液的酸堿度對酶蛋白質活性的影響。

圖4　　　突變菌株及出發(fā)菌株磷脂酶D水解活力、　　　干菌體質量隨時間變化關系Fig.4　　　Time courses of enzyme activity of phospholipase D　　　and dry cell weight of mutant strain　　　and the initial strain

在磷脂酶D發(fā)酵過程中，突變菌株較出發(fā)菌株的代謝速度快，由圖4可知，在前2 天，突變菌株菌絲干質量的增加比出發(fā)菌株稍快，但在對數(shù)生長初期(第3天)，突變菌株的菌絲干質量的增加速率(0.018 g/h)是出發(fā)菌株0.008 g/h)2.25倍，3～6 d是鏈霉菌的對數(shù)生長期，鏈霉菌菌絲干質量在前6 d迅速積累,達到最大，突變菌株(0.835 g)是出發(fā)菌株(0.574 g)的1.45倍。生長至6 d以后是穩(wěn)定期和衰亡期，并且菌絲體生長基本處于停滯狀態(tài)。

3結論

原生質體的制備的影響因素很多，本文選取了鏈霉菌原生質體的制備和再生過程中幾個主要的影響因素：甘氨酸濃度、菌齡、酶解溫度、酶解時間、溶菌酶濃度進行研究，發(fā)現(xiàn)甘氨酸濃度 5 g/L，菌齡為72 h，酶解溫度30 ℃，酶解75 min，溶菌酶質量濃度3 mg/mL時，原生質體的形成率和再生率都比較合適，因此，以此條件為基礎進行后續(xù)原生質體的紫外誘變。

原生質體沒有細胞壁的保護較單孢子懸液，對紫外線更敏感，能較好的改變菌株的遺傳性能。本文中，筆者利用原生質體紫外誘變選育技術，得到一株磷脂酶D的水解活力為4.29 U/mL高產菌株，(較出發(fā)菌株(1.53 U/mL)提高大約3倍)。

原生質體誘變技術大大提升了磷脂酶D的水解活力，但誘變后菌株遺傳性狀的改變是隨機性的，同時液體發(fā)酵篩選高產菌工作量很大，周期很長。為了進一步提高該菌的生產經濟效益，今后的研究中可以通過基因重組改良菌株的代謝途徑，加快生長速度，也可以構建高通量篩選方法縮短優(yōu)良菌株產磷脂酶D的發(fā)酵周期。

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(責任編輯荀志金)

Breeding of high phospholipase D-producing strain through mutation ofprotoplasts induced by UV radiation

YANG Lanlan,ZHANG Xiaoli,FENG Juanjuan,ZHU Nannan,ZHAO Binxia

(School of Chemical Engineering,Northwest University,Xi′an 710069,China)

Abstract：In order to screen a high-yielding phospholipase D strain from Streptomyces sp. LD0501,we studied the conditions for its protoplasts′ preparation and regeneration, and mutagenized its protoplasts by UV radiation as well. The protoplasts were prepared by enzyme and mutagenized with UV irradiation. The mutation result was determined by TLC. The optimum conditions for the preparation of the protoplasts were as follows：the Streptomyces LD0501 was inoculated into mycelia medium with 0.5% glycine and cultured for 72 h.The mycelia were processed with 3 mg/mL lysozyme at 30 ℃ for 75 min. Protoplasts of Streptomyces sp. LD0501 were induced by UV radiation to obtain a high phospholipase D-producing strain,whose phospholipase D′s enzyme activity reached 4.29 U/mL, increased by 180.4% compared with the initial strain. The method improved the preparation effect of protoplasts from Streptomyces LD 0501 effectively and enhanced phospholipase D strain′s vitality greatly by UV irradiation of the protoplasts,the production of the high-yielding mutant strain was verified to be genetically stable.

Keywords：phospholipase D;protoplast;UV mutagenesis;screening

中圖分類號：Q93

文獻標志碼：A

文章編號：1672-3678(2016)02-0022-05

作者簡介：楊蘭蘭(1990—)，女，陜西榆林人，研究方向：微生物發(fā)酵；張小里(聯(lián)系人)，教授，E-mail:xlzhang@nwu.edu.cn

基金項目：陜西省自然科學基礎研究計劃(2014JM2057)

收稿日期：2015-12-07

doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2016.02.005