湯　寶，馮小海，張　丹，許宗奇，姜永翔，李　莎，徐　虹

(南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，江蘇南京211800)

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通過透明顫菌血紅蛋白基因表達(dá)提高γ-聚谷氨酸的生物合成

湯寶，馮小海，張丹，許宗奇，姜永翔，李莎，徐虹

(南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，江蘇南京211800)

摘要：γ-聚谷氨酸(γ-PGA)的微生物合成是高消耗氧的生物過程，采取基因工程手段改造γ-PGA生產(chǎn)菌株Bacillus subtilis NX-2，以提高細(xì)胞利用氧的能力。利用重疊PCR方法將P43強(qiáng)啟動(dòng)子與透明顫菌血紅蛋白(VHb)基因vgb拼接，插入大腸桿菌-枯草芽胞桿菌穿梭質(zhì)粒pMA5上，得到重組質(zhì)粒pMA5-P43-vgb，并將其轉(zhuǎn)化至B. subtilis NX-2中，從而獲得重組菌B.subtilis NX-2(vgb+)。經(jīng)SDS-PAGE分析和CO差光譜法證明VHb能在γ-PGA生產(chǎn)菌株中成功表達(dá)，且具有生理活性，大小約為1.6×104。在7.5 L發(fā)酵罐上對(duì)重組菌B. subtilis NX-2(vgb+)進(jìn)行發(fā)酵性能考察，結(jié)果顯示：重組菌比出發(fā)菌的生物量提高了41.2%，γ-PGA的產(chǎn)量提高了7.5%，傳代多次表明重組菌具有良好的發(fā)酵穩(wěn)定性。該研究為γ-PGA的進(jìn)一步工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：Bacillus subtilis；透明顫菌血紅蛋白；γ-聚谷氨酸

γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是由微生物合成的細(xì)胞外氨基酸聚合物，由D型和L型谷氨酸通過γ-酰胺鍵連接而成[1]。具有保濕性和生物可降解性等理化和生物學(xué)特性，在環(huán)境、醫(yī)藥、食品和化妝品等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[2-3]，是不可降解的合成高分子材料(如塑料和水凝膠等)優(yōu)良的替代品。因此，開發(fā)該產(chǎn)品有利于加快我國(guó)高分子產(chǎn)業(yè)和產(chǎn)品結(jié)構(gòu)向綠色化、功能化方向發(fā)展。

透明顫菌血紅蛋白(VHb)是透明顫菌中的氧調(diào)節(jié)蛋白，能夠在極低的溶氧環(huán)境條件下大量合成，使得菌體在惡劣的貧氧環(huán)境中也能較好地生存?？茖W(xué)家們利用VHb的這一功能，首次將血紅蛋白基因(vgb)在大腸桿菌中進(jìn)行克隆表達(dá)，發(fā)現(xiàn)VHb的導(dǎo)入可以在細(xì)胞水平上改善O2的供應(yīng)，提高氧化磷酸化水平和ATP再生能力，從而加快細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝[4]。自從VHb在大腸桿菌中成功表達(dá)以來，該蛋白已被廣泛應(yīng)用于耗氧量大、溶氧易成為限制因素的工業(yè)微生物生產(chǎn)領(lǐng)域。Kallio等[5]將vgb基因在產(chǎn)α-淀粉酶的枯草芽胞桿菌中進(jìn)行表達(dá)，提高了菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶能力；郭曉軍等[6]將vgb基因成功導(dǎo)入黃單胞桿菌，極大地提高了黃原膠的產(chǎn)量；VHb還被用于抗生素工業(yè)，Demodena等[7]通過在枝頂青霉菌種中表達(dá)該蛋白提高了頭孢菌素C的產(chǎn)量，Brunker等[8]也應(yīng)用該蛋白的表達(dá)來促進(jìn)糖多孢紅霉素菌產(chǎn)紅霉素的含量。但VHb應(yīng)用于γ-PGA發(fā)酵生產(chǎn)的未見報(bào)道。因此，為了提高γ-PGA生產(chǎn)菌在低溶氧環(huán)境條件下對(duì)氧的利用能力，構(gòu)建VHb表達(dá)的基因工程菌是一種有效的策略。

本研究中，筆者以BacillussubtilisNX-2為研究對(duì)象，將強(qiáng)啟動(dòng)子P43與vgb基因連接，構(gòu)建到大腸桿菌-枯草芽胞桿菌穿梭質(zhì)粒pMA5上，并將構(gòu)建的血紅蛋白基因重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到B.subtilisNX-2，考察VHb表達(dá)對(duì)γ-PGA合成及菌體生長(zhǎng)的影響。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1菌株及質(zhì)粒

大腸桿菌E.coliJM109、枯草芽胞桿菌B.subtilis168、枯草芽胞桿菌B.subtilisNX-2、大腸桿菌-枯草芽胞桿菌穿梭質(zhì)粒pMA5均保存于筆者所在實(shí)驗(yàn)室，攜帶透明顫菌血紅蛋白基因vgb的質(zhì)粒pOK12為中國(guó)科學(xué)院上海生化研究所惠贈(zèng)。

1.1.2工具酶及試劑

限制性內(nèi)切酶、連接酶、Ex Taq等酶均為TaKaRa公司產(chǎn)品，引物合成、測(cè)序由南京金斯瑞公司完成，其余試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)市售分析純。

1.1.3培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

大腸桿菌和枯草芽胞桿菌分子實(shí)驗(yàn)中均采用LB培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 10，蛋白胨10，酵母粉5。大腸桿菌抗性培養(yǎng)基中各個(gè)抗生素的質(zhì)量濃度(μg/mL)：氨芐青霉素50，氯霉素25，卡那霉素 25，四環(huán)素40。枯草芽胞桿菌抗性培養(yǎng)基中各個(gè)抗生素的質(zhì)量濃度(μg/mL)：氯霉素10，卡那霉素25，四環(huán)素5。

B.subtilisNX-2發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖60，酵母膏5，谷氨酸鈉50，K2HPO4·3H2O 8，MgSO40.25；pH 7.0。

種子液培養(yǎng)：接一環(huán)菌于裝有80 mL種子培養(yǎng)液的500 mL三角瓶中，220 r/min、32.5 ℃培養(yǎng)16 h。

發(fā)酵罐培養(yǎng)：7.5 L發(fā)酵罐，裝液量4 L，配兩檔圓盤透平槳，罐徑與槳徑長(zhǎng)度比為2∶ 1，121 ℃滅菌15 min，接種量2%，發(fā)酵溫度32.5 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速400 r/min，通氣量1.2 L/min。

1.1.4引物

本實(shí)驗(yàn)所用引物如表1所示。

表1　本實(shí)驗(yàn)所用引物

1.2實(shí)驗(yàn)方法

基因組提取、質(zhì)粒提取、酶切、連接、SDS-PAGE分析以及大腸桿菌轉(zhuǎn)化等分子生物學(xué)技術(shù)均參照文獻(xiàn)[9]的方法。

1.2.1重疊PCR連接啟動(dòng)子P43和vgb基因

重疊PCR分兩步進(jìn)行。第一步反應(yīng)體系如下：含10×PCR buffer 2.5 μL、Mg2+2 μL、dNTP 2 μL、模板P43和vgb各2 μL、Ex Taq DNA聚合酶 0.5 μL，加重蒸水至反應(yīng)液總體積為25 μL。擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性55 s，65 ℃ 退火40 s，72 ℃ 延伸1 min，循環(huán)5次；72 ℃ 延長(zhǎng)2 min。第二步在第一步基礎(chǔ)上再加入25 μL反應(yīng)物質(zhì)，體系如下：10×PCR buffer 5 μL，Mg2+2 μL，dNTP 4 μL，待重疊片段模板P43上游引物和模板vgb下游引物各2 μL，Ex Taq DNA 聚合酶1 μL，加重蒸水至反應(yīng)液總體積為50 μL。擴(kuò)增程序如下：95 ℃ 退火4 min；94 ℃變性50 s，55～60 ℃退火 40 s，72 ℃ 延伸1 min，循環(huán)30次；72 ℃ 延長(zhǎng)10 min。

1.2.2重組表達(dá)質(zhì)粒pMA5-P43-vgb的構(gòu)建

質(zhì)粒構(gòu)建流程如圖1所示，將PCR得到的P43和vgb基因片段回收，經(jīng)過重疊PCR擴(kuò)增與穿梭質(zhì)粒pMA5經(jīng)過NdeI和BamH I雙酶切后過夜連接， 獲得重組表達(dá)載體pMA5-P43-vgb，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，挑選單克隆，經(jīng)菌體PCR、質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證。

圖1　　　重組表達(dá)質(zhì)粒pMA5-P43-vgb的構(gòu)建流程Fig.1　　　Construction of recombinant plasmid　　　pMA5-P43-vgb

1.2.3重組表達(dá)質(zhì)粒pMA5-P43-vgb轉(zhuǎn)化枯草芽胞桿菌

重組表達(dá)質(zhì)粒pMA5-P43-vgb轉(zhuǎn)化枯草芽胞桿菌參照電轉(zhuǎn)化方法[10]。

1.2.4檢測(cè)方法

CO差光光譜法檢測(cè)透明顫菌血紅蛋白VHb的表達(dá)活性，參照文獻(xiàn)[11]。

細(xì)胞生長(zhǎng)的測(cè)定：將發(fā)酵液稀釋25倍后通過分光光度計(jì)于660 nm處讀取吸光值。

γ-PGA含量的測(cè)定參照文獻(xiàn)[12]。

2結(jié)果與討論

2.1啟動(dòng)子P43和透明顫菌血紅蛋白基因vgb的擴(kuò)增以及重疊PCR連接

根據(jù)表1中引物，分別以B.subtilis168基因組、pOK12質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增得到P43啟動(dòng)子片段、含有自身啟動(dòng)子序列的vgb基因片段。所獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果如圖2和圖3所示。由圖2和圖3可知：大小約400、470 bp，與預(yù)期結(jié)果一致。將上述P43啟動(dòng)子片段及vgb基因切膠回收作為重疊模板，以P43-F及vgb-R作為引物進(jìn)行重疊PCR。重疊片段經(jīng)切膠回收后如圖4所示。由圖4可知：條帶大小約為850 bp，表明已將P43啟動(dòng)子與vgb基因連接。

M—DNA標(biāo)準(zhǔn)品；1～2—P43啟動(dòng)子片段圖2　　　P43啟動(dòng)子片段的PCR擴(kuò)增電泳Fig.2　　　PCR amplification of the promoter P43

M—DNA標(biāo)準(zhǔn)品；1～2—vgb基因片段圖3　　　vgb基因的PCR擴(kuò)增電泳Fig.3　　　PCR amplification of the vgb gene

M—DNA標(biāo)準(zhǔn)品;1～2—P43-vgb重疊片段圖4　　　重疊PCR擴(kuò)增的P43-vgb片段Fig.4　　　Over-lapping PCR amplification of the　　　 P43-vgb products

2.2重組表達(dá)質(zhì)粒pMA5-P43-vgb的構(gòu)建及驗(yàn)證

重疊片段測(cè)序結(jié)果表明P43啟動(dòng)子序列與vgb基因序列沒有發(fā)生堿基的缺失和改變。將該重疊片段與pMA5質(zhì)粒用NdeI和BamH I進(jìn)行雙酶切后連接，按照?qǐng)D1中流程構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pMA5-P43-vgb，轉(zhuǎn)化E.coliJM109，挑取陽性克隆進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，結(jié)果見圖5。再將 PCR 驗(yàn)證有正確條帶的轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果如圖6所示。圖5、圖6結(jié)果表明重組載體pMA5-P43-vgb構(gòu)建成功。

M—DNA標(biāo)準(zhǔn)品；1～4—菌液PCR驗(yàn)證P43-vgb片段圖5　　　重組質(zhì)粒pMA5-P43-vgb的PCR驗(yàn)證Fig.5　　　Colony PCR profile of recombinant　　　plasmid pMA5-P43-vgb

M—DNA標(biāo)準(zhǔn)品;1～2—Nde I和BamH I雙酶切pMA5-P43-vgb圖6　　　重組質(zhì)粒pMA5-P43-vgb的酶切驗(yàn)證Fig.6　　　Restriction analysis of recombinant　　　plasmid pMA5-P43-vgb

2.3VHb在B.subtilisNX-2中的表達(dá)及鑒定

2.3.1pMA5-P43-vgb轉(zhuǎn)化B.subtilisNX-2

采用電轉(zhuǎn)化方法將pMA5-P43-vgb重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化B.subtilisNX-2，在卡那霉素抗性平板上進(jìn)行篩選，挑取3個(gè)轉(zhuǎn)化子。將這3株重組菌全部挑取至含有卡那霉素抗性的液體培養(yǎng)基中，提取質(zhì)粒驗(yàn)證，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知：泳道1為出發(fā)菌B.subtilisNX-2提取質(zhì)粒結(jié)果，表示宿主菌中不存在質(zhì)粒；泳道 2、3、4分別是3株重組菌提取質(zhì)粒的結(jié)果，表明3株重組菌中均有質(zhì)粒轉(zhuǎn)入。為進(jìn)一步驗(yàn)證質(zhì)粒是否是重組載體pMA5-P43-vgb，分別用NdeI和BamH I 對(duì)這3個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，結(jié)果如圖7的泳道5、6和7所示，均有7 500 bp和850 bp的條帶，說明 pMA5-P43-vgb已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入B.subtilisNX-2，將重組菌命名為B.subtilisNX-2(vgb+)。

M—DNA標(biāo)準(zhǔn)品；1—B.subtilis NX-2質(zhì)粒提取結(jié)果；2～4—重組菌質(zhì)粒提取結(jié)果；5～7—Nde I和BamH I雙酶切重組菌質(zhì)粒pMA5-P43-vgb圖7　　　重組菌B. subtilis NX-2(vgb+)的驗(yàn)證Fig.7　　　Confirmation of recombinant B. subtilis NX-2(vgb+)

2.3.2SDS-PAGE檢測(cè)重組菌株的血紅蛋白VHb的表達(dá)

通過SDS-PAGE檢測(cè)重組菌B.subtilisNX-2(vgb+)中VHb的表達(dá)，結(jié)果如圖8所示。由圖8可知：與原始菌B.subtilisNX-2相比，重組菌B.subtilisNX-2(vgb+)成功表達(dá)了相對(duì)分子質(zhì)量約1.6×104的蛋白條帶，即血紅蛋白VHb，與文獻(xiàn)報(bào)道大小一致[13]。

M—蛋白標(biāo)準(zhǔn)品；1—B. subtilis NX-2(vgb+)總蛋白；2—B. subtilis NX-2總蛋白圖8　　　VHb在重組菌B. subtilis NX-2(vgb+)的表達(dá)Fig.8　　　VHb protein from recombinant B. subtilis　　　NX-2(vgb+) by SDS-PAGE analysis

2.3.3CO差光譜法檢測(cè)重組菌VHb的表達(dá)活性

透明顫菌血紅蛋白在不同的環(huán)境條件下可呈現(xiàn)3種不同的狀態(tài)，即氧化態(tài)、還原態(tài)、氧合態(tài)，并可以相互轉(zhuǎn)化，其中還原態(tài)是生理活性態(tài)，而氧合態(tài)則是富氧條件下的表現(xiàn)形式[14]。若向溶液中鼓入CO氣體，則可形成血紅蛋白-CO復(fù)合物，在419 nm處呈現(xiàn)特征吸收峰。通過CO差光譜法檢測(cè)，結(jié)果如圖9所示。由圖9可知：重組菌B.subtilisNX-2(vgb+)在419 nm處有明顯的特殊吸收峰，而原始菌B.subtilisNX-2沒有相應(yīng)的吸收峰，表明重組菌表達(dá)了有生理活性的血紅蛋白。

圖9　　　重組菌B. subtilis NX-2(vgb+)的CO差光光譜分析Fig.9　　　CO-difference spectra analysis of recombinant　　　B. subtilis NX-2(vgb+)

2.4VHb表達(dá)對(duì)B.subtilisNX-2發(fā)酵的影響

2.4.1VHb對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA的影響

在7.5 L 罐中考察B.subtilisNX-2與B.subtilisNX-2(vgb+)分批發(fā)酵合成γ-PGA的過程，結(jié)果如圖10所示。由圖10可知：VHb的表達(dá)極大地促進(jìn)了菌體生長(zhǎng)，并且比原始菌提早進(jìn)入對(duì)數(shù)期，最終生物量(DCW)達(dá)到(6.89±0.20) g/L，比原始菌增加了41.2%。VHb的表達(dá)也加快了底物葡萄糖和L-谷氨酸的消耗，但底物的消耗更多地用于菌體生長(zhǎng)，對(duì)γ-PGA的合成沒有明顯的促進(jìn)作用。B.subtilisNX-2(vgb+)發(fā)酵合成γ-PGA 產(chǎn)量的最高值為(34.4±0.38) g/L，較原始菌提高了7.5%?；蛟S因?yàn)閜MA5-P43-vgb作為外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)B.subtilisNX-2，表達(dá)效率不高。另外，在發(fā)酵過程中，重組菌株的發(fā)酵液顏色由微紅色逐漸加深，發(fā)酵結(jié)束時(shí)呈現(xiàn)為土黃色。在有氧發(fā)酵過程中，由于VHb的表達(dá)導(dǎo)致發(fā)酵液顏色改變的現(xiàn)象已有報(bào)道[12]，或許在長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)酵過程中，表達(dá)質(zhì)粒會(huì)有少量的丟失，并且血紅蛋白呈現(xiàn)的紅色與枯草芽胞桿菌的代謝產(chǎn)物長(zhǎng)時(shí)間混合在一起導(dǎo)致了發(fā)酵體系顏色的變化。Kallio等[15]研究發(fā)現(xiàn)VHb的表達(dá)可以增加細(xì)胞中氧的利用效率，使呼吸鏈末端氧化酶的活性發(fā)生改變，提高細(xì)菌中ATP的水平，從而提高細(xì)胞對(duì)氧的利用能力。

圖10　　　VHb的表達(dá)對(duì)γ-PGA分批發(fā)酵過程的影響Fig.10　　　Effect of VHb expression on the batch　　　fermentation of γ-PGA

2.4.2重組菌B.subtilisNX-2(vgb+)的發(fā)酵穩(wěn)定性

質(zhì)粒穩(wěn)定性是影響基因工程菌外源蛋白表達(dá)的重要因素，同時(shí)外源蛋白的表達(dá)又影響著質(zhì)粒的穩(wěn)定性。特別在組成型表達(dá)系統(tǒng)中，由于外源蛋白的持續(xù)表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞代謝負(fù)擔(dān)加重，質(zhì)粒穩(wěn)定性的控制比較困難。為考察重組菌B.subtilisNX-2(vgb+)的發(fā)酵穩(wěn)定性，分別將重組菌在含有卡那霉素抗性及無抗性選擇壓力情況下傳代多次，同時(shí)以原始菌B.subtilisNX-2在無抗性條件下傳代作為對(duì)照。隨機(jī)選取3種培養(yǎng)條件下的第2、4、6、8和10代進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，結(jié)果見表2。由表2可知： 含有卡那霉素抗性選擇壓力的重組菌傳代培養(yǎng)有較好的發(fā)酵穩(wěn)定性，γ-PGA 產(chǎn)量未有明顯下降，且均優(yōu)于原始菌的發(fā)酵結(jié)果。而不含有抗性選擇壓力的重組菌傳代培養(yǎng)在第6代之后已沒有明顯的發(fā)酵優(yōu)勢(shì)，甚至其γ-PGA 產(chǎn)量還低于原始菌，可能原因是多次無壓力的傳代培養(yǎng)造成了質(zhì)粒的丟失，對(duì)細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境造成了不利的影響。由于筆者在保存及活化重組菌過程中都是在含有卡那霉素抗性選擇壓力的條件下進(jìn)行的，因此，可以保證質(zhì)粒的穩(wěn)定性，不會(huì)明顯影響VHb表達(dá)對(duì)γ-PGA發(fā)酵的作用效果。

表2　B. subtilis NX-2(vgb+)的發(fā)酵穩(wěn)定性

3結(jié)論

通過在B.subtilisNX-2中外源表達(dá)透明顫菌血紅蛋白基因vgb，從分子水平上提高細(xì)胞自身對(duì)溶氧的利用能力，最終重組菌的細(xì)胞量達(dá)到(6.89±0.20) g/L、γ-PGA產(chǎn)量為(34.4±0.38) g/L，相比原始菌分別提高了41.2%、7.5%。因此，在保持現(xiàn)有設(shè)備和能耗壓力不變的情況下，該策略為解決工業(yè)微生物在發(fā)酵過程中的供氧不足問題提供了一條新的途徑。

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(責(zé)任編輯管珺)

Expression ofVitreoscillahemoglobin gene to enhance poly-γ-glutamicacid biosynthesis inBacillussubtilisNX-2

TANG Bao,FENG Xiaohai,ZHANG Dan,XU Zongqi,JIANG Yongxiang,LI Sha,XU Hong

(College of Food Science and Light Industry,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China)

Abstract：Biosynthesis of poly-γ-glutamic acid is an aerobic process. Therefore we tried to transform the strain by genetic engineering to improve its ability of using oxygen. First,the recombinant plasmid pMA5-P43-vgb was constructed with the overlapping PCR method connecting Bacillus subtilis P43 promoter to Vitreoscilla hemoglobin gene vgb,then transformed into Bacillus subtilis NX-2,to obtain a recombinant strain B.subtilis NX-2(vgb+).The molecular size of hemoglobin VHb in recombinant strain B. subtilis NX-2(vgb+)was 1.6×104 by SDS-PAGE.Further,the carbon monoxide difference spectra verified that the target protein had a physiological activity in B. subtilis NX-2(vgb+).The experiments in the 7.5-L fermentor showed that the recombinant strain increased the biomass 41.2% and the γ-PGA production 7.5% than the original strain. The research lay a foundation for the γ-PGA industrial production.

Keywords：Bacillus subtilis;Vitreoscilla hemoglobin;poly-γ-glutamic acid

中圖分類號(hào)：TB324

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1672-3678(2016)02-0001-06

作者簡(jiǎn)介：湯寶(1987—)，男，安徽桐城人，博士研究生，研究方向：發(fā)酵工程；徐虹(聯(lián)系人)，教授， E-mail：xuh@njtech.edu.cn

基金項(xiàng)目：國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)重大項(xiàng)目(2013AA020301)；普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(KYLX15_0811)

收稿日期：2015-03-10

doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2016.02.001