高堂杰，張震宇

(江南大學(xué)糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫，214122)

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Leu1p參與調(diào)節(jié)V-ATP酶的活性

高堂杰，張震宇

(江南大學(xué)糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫，214122)

摘要：RAVE(regulator of the H+-ATPase of the vacuolar and endosomal membrane)由Rav1p、Rav2p和Skp1p3個(gè)亞基組成，是V-ATP酶活性調(diào)節(jié)機(jī)制中一個(gè)關(guān)鍵的多亞基復(fù)合物調(diào)節(jié)因子； Leu1p能夠與RAVE相互作用。通過融合PCR、同源重組分別構(gòu)建了釀酒酵母BY4742的Rav1、Rav2、Leu1和Vma2缺陷型菌株。進(jìn)一步研究重組菌株對pH及CaCl2的耐受能力發(fā)現(xiàn)：Leu1缺陷型菌株(3-異丙基蘋果酸異構(gòu)酶(Leu1p)缺失)的生長狀況與Rav1、Rav2 缺陷型菌株的生長狀況基本一致，表明RAVE對V-ATP酶的活性調(diào)節(jié)極有可能需要通過與Leu1p結(jié)合才能實(shí)現(xiàn)。筆者所在實(shí)驗(yàn)室為進(jìn)一步研究RAVE與Leu1p的相互關(guān)系及其對V-ATP酶的活性調(diào)節(jié)提供了重要依據(jù)。

關(guān)鍵詞：V-ATP 酶；RAVE；Leu1p；同源重組；融合PCR

V-ATP酶(vacuolar ATPase)又稱液泡ATP酶，廣泛存在于生物的細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜中。它能夠通過水解ATP產(chǎn)生的能量來轉(zhuǎn)移質(zhì)子，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外的pH，使細(xì)胞處于一個(gè)相對穩(wěn)定的pH環(huán)境[1]；同時(shí)，V-ATP酶擔(dān)負(fù)著調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)部分離子濃度的功能，如Ca2+、Zn2+等[2-3]。V-ATP酶的質(zhì)子泵效應(yīng)與生物體內(nèi)的許多生化反應(yīng)及代謝活動息息相關(guān)，同時(shí)也與一系列疾病(如癌癥、艾滋等)的產(chǎn)生與治療有關(guān)[4-6]。目前，醫(yī)學(xué)人員已越來越多地以V-ATP酶為目標(biāo)來研發(fā)靶向性藥物。V-ATP酶由V1和V0兩部分組成。V1位于細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中，其主要功能是水解ATP；V0鑲嵌于細(xì)胞膜當(dāng)中，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)移質(zhì)子。單獨(dú)的V1、V0是沒有活性的，只有當(dāng)二者結(jié)合形成完整的V-ATP酶，才能發(fā)揮各自的功能，共同起到調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用[7-9]。V-ATP酶的活性調(diào)節(jié)受諸多因素的影響，其調(diào)節(jié)機(jī)制目前尚未研究透徹，但文獻(xiàn)[10-11]的研究表明，RAVE(regulator of the H+-ATPase of the vacuolar and endosomal membrane)在V-ATP酶的活性調(diào)節(jié)當(dāng)中具有重要作用。RAVE由Ravlp、Rav2p和Skplp 3個(gè)亞基組成。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，RAVE可以通過與V1的結(jié)合或分離來調(diào)節(jié)V1與V0的分離與結(jié)合，從而起到調(diào)節(jié)V-ATP酶活性的作用，RAVE的缺失會導(dǎo)致V-ATP酶的形成嚴(yán)重受阻，且形成的V-ATP酶活性也嚴(yán)重受到影響。

目前，關(guān)于RAVE研究最多的是Skplp，且已經(jīng)得到其晶體結(jié)構(gòu)[11]。但是對Ravlp、Rav2p的研究還相對較少。筆者所在實(shí)驗(yàn)室致力于RAVE復(fù)合物的研究，目前通過親和純化及質(zhì)譜鑒定，確定了一系列能與RAVE產(chǎn)生相互作用的蛋白，其中3-異丙基蘋果酸異構(gòu)酶(Leu1p)與RAVE具有相互作用關(guān)系的發(fā)現(xiàn)尚屬首次[12]。Leu1p在亮氨酸合成途徑第一步反應(yīng)中將α-異丙基蘋果酸異構(gòu)為β-異丙基蘋果酸，為亮氨酸的合成提供前體[13]。為了進(jìn)一步研究Leu1p與RAVE及V-ATP酶之間的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建重組菌株來研究Leu1p是否影響V-ATP酶的功能活性。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌JM109、質(zhì)粒pRS425(帶有Leu2基因序列)及pUCm-T載體，保存于筆者所在實(shí)驗(yàn)室。用到的酵母菌株如表1所示。

表1　本實(shí)驗(yàn)用到的酵母菌株

1.1.2試劑

PfuDNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、十二烷基磺酸鈉(SDS)、Tris、溴化乙錠(EB)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、瓊脂糖M、小量質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、氨芐青霉素、卡那霉素(G418 硫酸鹽)、1 kb DNA Marker，BBI公司；限制性內(nèi)切酶BamH I、NdeI、XhoI，1 kb DNA Ladder Marker，λ-Hind III digest DNA Marker，TaKaRa公司；T4 DNA ligase，F(xiàn)ermentas公司；Lyticase酵母破壁酶，Sigma-Aldrich公司；其余試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2方法

1.2.1釀酒酵母基因組DNA提取

挑取釀酒酵母BY4742Flag-R2單菌落于YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)18～20 h。參照文獻(xiàn)[14]的方法提取基因組DNA。

1.2.2目的基因的融合與克隆

釀酒酵母BY4742是Leu2缺陷型菌株，通過融合PCR(圖1)在Rav1、Rav2和Vma2片段中插入Leu2基因的同時(shí)敲除原基因的部分片段，得到與基因組DNA具有同源互補(bǔ)序列的重組基因片段：R1F-R1LEU2-R1D、R2F-R2LEU2-R2D、V2F-V2LEU2-V2D(其中R1F、R2F和V2F分別為Rav1、Rav2和Vma2的上游同源序列；R1D、R2D和V2D分別為Rav1、Rav2和Vma2的下游同源序列)。融合后的目的片段轉(zhuǎn)化酵母BY4742，經(jīng)同源重組整合到其基因組當(dāng)中，通過SD-Leu培養(yǎng)基篩選到重組菌株。

圖1　　　融合PCR示意圖Fig.1　　　Schematic diagram of fusion PCR

由于Leu1p與Leu2p同為亮氨酸合成途徑當(dāng)中的酶，因此在構(gòu)建Leu1缺陷型菌株時(shí)不能以SD-Leu培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，故選取KanMX6作為抗性標(biāo)記，以含G418的YPD固體培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。通過融合PCR及酶切連接等方法，在Leu1基因片段當(dāng)中插入Leu2及KanMX6基因，同時(shí)敲除Leu1的部分核苷酸序列，得到與基因組DNA具有同源互補(bǔ)序列的重組片段：LEU1F-LEU2-KanMX6-LEU1D(其中LEU1F、LEU1D分別為Leu1的上游同源序列及下游同源序列)。重組片段轉(zhuǎn)化酵母BY4742經(jīng)同源重組整合到基因組當(dāng)中，通過選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選得到重組菌株。

以釀酒酵母BY4742F-R2基因組為模板，通過PCR擴(kuò)增R1F、R1D、R2F、R2D、V2F、V2D、LEU1F、LEU1D及KanMX6，PCR引物對分別為R1p1/R1p2、R1p5/R1p6、R2p1/R2p2、R2p5/R2p6、Vp1/Vp2、Vp5/Vp6、Lp1/Lp2、Lp5/Lp6、Lp7/Lp8(表2)。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min；然后98 ℃變性1 min，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物通過PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化回收。

以質(zhì)粒pRS425為模板，R1p3/R1p4、R2p3/R2p4、Vp3/Vp4、Lp3/Lp4為引物，分別擴(kuò)增Leu2。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min；然后98 ℃變性1 min，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 20 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物通過PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化回收。

以上述PCR產(chǎn)物為模板，R1p1/R1p6、R2p1/R2p6、Vp1/Vp6為引物，先采用KOD Plus Neo通過融合PCR分別擴(kuò)增R1F-LEU2-R1D、R2F-LEU2-R2D及V2F-V2LEU2-V2D；然后通過Taq DNA Polymerase在3′末端加A。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min10 s，30個(gè)循環(huán)。最后加入1 μL Taq DNA Polymerase，72 ℃延伸30 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳割膠后，用膠回收試劑盒回收。

純化后的融合PCR產(chǎn)物，經(jīng)T4 DNA Ligase作用連接到pUCm-T載體，通過藍(lán)白斑進(jìn)行篩選。挑選白色單菌落培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切及PCR驗(yàn)證重組載體，并選取二者驗(yàn)證皆正確的重組載體進(jìn)行測序驗(yàn)證。

LEU1F-LEU2-KanMX6-LEU1D由于片段較長，很難通過融合PCR進(jìn)行連接，故先通過融合PCR分別連接LEU1F/LEU2、KanMX6/LEU2D。然后通過酶切連接的方式依次將二者連接到載體pET28a上，再通過PCR擴(kuò)增，得到全長的目的片段。

呂凌子極具耐心地聽她發(fā)完牢騷，說，發(fā)票復(fù)印件我會催物業(yè)公司的陳主任明天給送過去，這會1402號業(yè)主也不知道在不在家，我馬上去看看，要是在的話，麻煩你再派人來一趟。

表2　所使用的核苷酸序

注：1、2、3分別為NdeI、BamH I、XhoI酶切位點(diǎn)。

1.2.3釀酒酵母BY4742感受態(tài)細(xì)胞的制備

釀酒酵母BY4742感受態(tài)細(xì)胞的制備參照文獻(xiàn)[12]。

1.2.4目的基因的轉(zhuǎn)化及其篩選

參照文獻(xiàn)[15]的方法將目的基因分別轉(zhuǎn)化釀酒酵母BY4742，重組菌株通過SD-Leu培養(yǎng)基或含200 μg/mL G418的YPD培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。

挑取上述轉(zhuǎn)化后長出的單菌落于10 mL SD-Leu培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)18～20 h，提取基因組DNA，以其為模板進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

1.2.5釀酒酵母BY4742重組菌不同pH培養(yǎng)基中生長差異的研究

分別挑取釀酒酵母BY4742及各重組菌株單菌落接種于50 mL的YPD液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)16～18 h，用分光光度計(jì)測其吸光度OD600，取少量菌液稀釋至相同OD值，按1%的接種量接種至100 mL的YPD液體培養(yǎng)基中(3個(gè)平行樣)，于30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)，每隔2 h取樣測其OD600，直至36 h，并測培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的菌液pH，繪制生長曲線。

1.2.6重組菌株對CaCl2的耐受性研究

分別挑取釀酒酵母BY4742及各重組釀酒酵母單菌落接種于50 mL的YPD液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)16～18 h，用分光光度計(jì)測其OD600，取少量菌液稀釋至相同OD后，按梯度1、10-1和10-2取相同量的菌液分別涂布于pH為5.5、7.5含100 mmol/L CaCl2的YPD固體培養(yǎng)基上(各3個(gè)平行)，同時(shí)接種相同菌液至不含CaCl2的培養(yǎng)基作為對照，30 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d。

2結(jié)果與討論

2.1通過融合PCR獲取重組基因

按照1.2.2節(jié)的方法分別擴(kuò)增各待融合的DNA片段。各片段的理論大小如表3所示；PCR產(chǎn)物的電泳檢測如圖2所示。

表3　各基因片段的理論大小

M均為1kb DNA Marker；(a)：1～6分別為R2F、R2LEU2、R2D、R1F、R1LEU2、R1D；(b)：1～4分別為LEU1F、LEU2、KanMX6、LEU1D；(c)：1～3分別為V2F、LEU2、V2D圖2　　　各待融合DNA片段PCR產(chǎn)物Fig.2　　　PCR products of the DNA fragment to be fused

M均為1 kb DNA Marker；(a)1—R1F、R1LEU，2—R1D融合PCR產(chǎn)物R1F-R1LEU2-R1D；(b)1—R2F、R2LEU2、R2D融合PCR產(chǎn)物R2F-R2LEU2-R2D；(c)1—V2F、 LEU2、V2D融合PCR產(chǎn)物V2F-V2LEU2-V2D；(d)1、2分別為LEU1F與LEU2、KanMX6與LEU1D的融合PCR產(chǎn)物L(fēng)EU1F-LEU2及KanMX6-LEU1D 圖3　　　經(jīng)融合PCR所得到的目的基因Fig.3　　　The target gene obtained by fusinon PCR

經(jīng)融合PCR所得到的目的基因經(jīng)純化后連接到克隆載體進(jìn)行克隆。其中R1F-R1LEU2-R1D、R2F-R2LEU2-R2D及V2F-V2LEU2-V2D經(jīng)TA克隆連接到pUCm-T載體上，分別命名為pUCm-T-R1、pUCm-T-R2、pUCm-T-V2；LEU1F-LEU2及KanMX6-LEU1D，通過酶切連接的方式依次連接到pET 28a載體上，命名重組載體為pET28a-LEU1，從而可以通過PCR得到完整的目的片段：LEU1F-LEU2-KanMX6-LEU1D。連接好的重組載體分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)進(jìn)行克隆。重組克隆載體經(jīng)雙酶切、PCR及測序驗(yàn)證均正確。

2.2目的基因轉(zhuǎn)化酵母BY4742及其驗(yàn)證

以上述構(gòu)建的重組載體為模板，通過PCR分別擴(kuò)增各目的片段，經(jīng)割膠回收純化后，按1.2.4節(jié)的方法轉(zhuǎn)化酵母BY4742 感受態(tài)細(xì)胞，篩選出目的菌株，提取基因組DNA進(jìn)行PCR驗(yàn)證，同時(shí)以酵母BY4742的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR對照，驗(yàn)證結(jié)果分別如圖4所示。

M均為1 kb DNA Marker；箭頭所指條帶分別為以各篩選到的重組菌株基因組為模板進(jìn)行PCR所得片段；非箭頭所指條帶為采用相對應(yīng)的引物并以BY4742基因組DNA為模板進(jìn)行PCR所得片段圖4　　　各重組菌株P(guān)CR驗(yàn)證Fig.4　　　PCR results of recombinant strain

2.3重組酵母菌株在不同pH條件下的生長狀況

圖5為重組酵母菌株在pH 5.5條件下的生長曲線。由圖5可知：在pH為5.5的YPD液體培養(yǎng)基中，原始菌株及4株缺陷型重組菌(rav1Δ、rav2Δ、vma2Δ和leu1Δ)的生長曲線基本一致，在10 h左右進(jìn)入對數(shù)生長期，15 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期，且菌密度也基本一致。這是因?yàn)獒劸平湍傅淖钸m生長pH為5.5左右，所以五者的生長趨勢基本一致。

圖5　　　酵母BY4742及其各重組菌在pH為5.5的　　　YPD液體培養(yǎng)基中的生長曲線 Fig.5　　　Growth curves of the yeast BY4742 and the　　　recombinant strain cultured in YPD　　　mediu(pH=5.5)

圖6為重組酵母菌株在pH 7.5條件下的生長曲線。由圖6可知：在pH為7.5的培養(yǎng)基中，原始菌株及4株缺陷型重組菌(rav1Δ、rav2Δ、vma2Δ 和leu1Δ)均在13 h左右開始進(jìn)入對數(shù)生長期，但是原菌BY4742生長迅速，較快達(dá)到穩(wěn)定期，而缺陷型重組菌生長緩慢，直到25 h左右才達(dá)到穩(wěn)定生長期，且菌密度相較于原始菌要低，尤以Vma2缺陷型菌株生長最為緩慢，其穩(wěn)定期的菌密度最低，OD600只達(dá)到3.8左右。

圖6　　　酵母BY4742及其各重組菌在pH為7.5的　　　YPD液體培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.6　　　Growth curves of the yeast BY4742 and the　　　recombinant strain cultured in YPD　　　mediu(pH=7.5)

同時(shí)，在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)測得的pH顯示，在pH 5.5的培養(yǎng)基中，最終的pH變化不大，均在5.3左右；在pH 7.5的培養(yǎng)基中，原始菌株及4株缺陷型重組菌(rav1Δ、rav2Δ、vma2Δ和leu1Δ)的pH分別為5.6、6.4、6.2、6.9和6.5。由此可見，Rav1、Rav2、Vma2、Leu1的敲除使得酵母菌對pH的調(diào)節(jié)受到了嚴(yán)重阻礙，從而影響其生長。同時(shí)，菌株生長及培養(yǎng)基pH的結(jié)果顯示Leu1的敲除所產(chǎn)生的影響與Rav1、Rav2的敲除所產(chǎn)生的影響基本一致，而與Vma2的敲除有較大差別，這從一定程度上說明Leu1p通過與RAVE結(jié)合，參與對V-ATP酶的活性調(diào)節(jié)，因?yàn)閂ma2的缺失導(dǎo)致V-ATP酶完全不能形成；而RAVE的缺失則只是使其組裝嚴(yán)重受阻，且活性下降。

2.4重組酵母菌株對CaCl2的耐受性

圖7　　　各重組菌株對CaCl2及pH的耐受性Fig.7　　　Tolerance of recombinant strains to CaCl2 and pH

按照1.2.6節(jié)的方法將各菌液分別涂布于含100 mmol/L CaCl2、pH 5.5及7.5的YPD培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，其結(jié)果如圖7所示。由圖7可知：在含100 mmol/L CaCl2、pH為5.5的YPD固體培養(yǎng)基中，釀酒酵母BY4742 的Rav1、Rav2、Vma2及Leu1的缺陷型菌株的生長受到了極大抑制，相同菌量的涂布，其菌落數(shù)目要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于釀酒酵母BY4742，而四者之中，又以Vma2缺陷型菌株的生長狀況最差，這可能是由于缺少Vma2p，導(dǎo)致V-ATP酶的V1部分無法形成，不能組裝成為完整的V-ATP酶，從而失去了對CaCl2及pH的調(diào)控作用。由圖2可知，Leu1缺陷型菌株的生長狀況與Rav1、Rav2 缺陷型菌株的生長狀況基本一致，這從一個(gè)方面說明，Leu1p通過與RAVE結(jié)合，共同調(diào)節(jié)V-ATP酶的分離與集裝，從而起到調(diào)控其活性的作用，不過Leu1p也有可能通過其他途徑影響菌株對CaCl2及pH的耐受性，有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。V-ATP酶的活性調(diào)節(jié)機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜。普遍認(rèn)為RAVE復(fù)合物在其調(diào)節(jié)機(jī)制中扮演重要角色，但具體的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。RAVE復(fù)合物主要由Rav1p、Rav2p和Skp1p構(gòu)成，與V-ATP酶的眾多亞基具有相互作用關(guān)系；同時(shí)由于Skplp是組成SCF復(fù)合物的一個(gè)關(guān)鍵骨架蛋白，還能與其他眾多蛋白產(chǎn)生作用關(guān)系，故其調(diào)節(jié)機(jī)制可能還要受到其他蛋白的影響。

3結(jié)論

Leu1p是筆者所在實(shí)驗(yàn)室最新發(fā)現(xiàn)的能與RAVE相互結(jié)合的蛋白。筆者通過融合PCR及同源重組的方法分別構(gòu)建了釀酒酵母BY4742的Rav1、Rav2、Vma2和Leu1的缺陷型菌株，研究Leu1p與RAVE之間的相互功能關(guān)系。上述結(jié)論表明Leu1p對釀酒酵母BY4742的pH及CaCl2耐受性產(chǎn)生極大影響，且通過與重組菌株(rav1Δ、rav2Δ、vma2Δ)的對照實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RAVE對V-ATP酶活性的調(diào)節(jié)極有可能需要通過與Leu1p結(jié)合才能得以實(shí)現(xiàn)。

V-ATP酶在生物體內(nèi)的重要作用正越來越多地受到人們的關(guān)注，隨著研究的深入，解開V-ATP酶的活性調(diào)節(jié)機(jī)制，使其服務(wù)于醫(yī)療衛(wèi)生已是新的方向和熱點(diǎn)。本研究的發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究RAVE與Leu1p的相互關(guān)系及其對V-ATP酶的活性調(diào)節(jié)提供了重要依據(jù)。

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(責(zé)任編輯荀志金)

Leu1p involved in regulating V-ATPase activity

GAO Tangjie，ZHANG Zhenyu

(Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry & Biotechnology of the Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

Abstract：RAVE(regulator of the H+-ATPase of the vacuolar and endosomal membrane)complex containing Rav1p,Rav2p and Skp1p,is a key regulatory factor of V-ATPase activity regulating mechanism. Latest news showed Leu1p capable of interacting with RAVE. This study,we constructed 4 Saccharomyces cerevisiae BY4742 recombinant strains that were lack of Rav1，Rav2，Vma2 and Leu1 respectively by fusion PCR and homologous recombination. RAVE for V-ATPase activity regulation is likely to be achieved by conjunction with Leu1p. Our study provided an important basis for studying the relationship between RAVE and Leu1p,also the study of regulation mechanism of the V-ATPase.

Keywords：V-ATPase;RAVE;Leu1p;homologous recombination;fusion PCR

中圖分類號：Q936

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1672-3678(2016)02-0051-07

作者簡介：高堂杰(1987—)，男，湖南瀏陽人，研究方向：生物化學(xué)、發(fā)酵工程，；張震宇(聯(lián)系人)，教授，E-mail：zhangzy@jiangnan.edu.cn

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(30800018、30970058)

收稿日期：2014-01-02

doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2016.02.010