高　茜，朱麗英，周　偉，梁世中，江　凌，4

(1.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 210009；2.南京工業(yè)大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，江蘇 南京 210009；

3.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510641；4.南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京 210009)

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RAISE技術(shù)改組轉(zhuǎn)錄因子RpoD調(diào)控大腸桿菌的低pH值耐受性

高茜1，朱麗英2，周偉1，梁世中3，江凌1，4

(1.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 210009；2.南京工業(yè)大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，江蘇 南京 210009；

3.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510641；4.南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京 210009)

摘要：在生物煉制生產(chǎn)過程中，微生物由于自身對酸的抗逆性差，其代謝生產(chǎn)過程會受到嚴重的影響。為解決該問題，本實驗采用PCR方法從E.coli Dpα中擴增分離得到分子量為2 075 bp的RpoD完整序列(包含天然啟動子區(qū)域和終止子區(qū)域)，并利用RAISE方法，通過突變?nèi)终{(diào)控因子RpoD來提高大腸桿菌的耐酸能力。通過對104隨機突變文庫的多輪篩選，獲得最佳突變菌株Mutant Ⅶ。在pH值為3.0、3.5、4.0、5.0、6.0 和7.0的條件下，對Mutant Ⅶ和對照菌株的生長情況進行比較分析，結(jié)果表明，在酸性條件下Mutant Ⅶ較對照菌株具有明顯的生長優(yōu)勢，尤其在pH值為3.0時，相比對照菌株0.015 h(-1)的生長速率，Mutant Ⅶ的生長速率達到0.022 h(-1)，具有較高應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞：大腸桿菌；耐酸性；RpoD；RAISE方法

生物煉制推動了可再生生物質(zhì)資源轉(zhuǎn)化為生物能源和化工產(chǎn)品的生物催化過程的發(fā)展。但是，由于現(xiàn)代生物煉制技術(shù)體系的生物質(zhì)利用率低、產(chǎn)品定向合成能力差，嚴重制約了生物煉制生產(chǎn)過程的進一步發(fā)展。例如，谷氨酸生產(chǎn)中一般通過補加氨水控制pH值在7.0左右，待發(fā)酵結(jié)束后再加入濃硫酸使pH值降至3.2左右以利于有機酸提取。若將生產(chǎn)菌株的耐酸脅迫性從原始的pH值6.0提升至pH值4.6，則能顯著減少中和劑的使用，降低下游污染。同時由于生產(chǎn)菌株酸耐受性的增強，最終產(chǎn)量會進一步提高。因此，提高菌種的耐酸能力有助于提高生物煉制生產(chǎn)過程的經(jīng)濟性和綠色指數(shù)[1]。

大腸桿菌(Escherichia coli)因具有細胞生長周期短、遺傳背景清晰、培養(yǎng)操作簡單等優(yōu)點，已被用作丁二酸[2]、3-羥基丙酸[3]、乳酸[4]等有機酸生產(chǎn)的主要微生物。但是，在大規(guī)模有機酸發(fā)酵生產(chǎn)過程中，大腸桿菌的生長及其產(chǎn)品的產(chǎn)量都會受到酸根離子的影響[5]。因此，為了適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)的需求，需進一步提高菌株的生長率。在大腸桿菌的不同生長環(huán)境中，其RNA聚合酶通過轉(zhuǎn)錄特異基因的選擇性σ因子改變基因組的轉(zhuǎn)錄來調(diào)控整個生長過程。目前，大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的σ因子有7種，分別為：σD(σ70)、σN(σ54)、σS(σ38)、σH(σ32)、σF(σ28)、σE(σ24)和σfecI[6]。其中，σD是最主要的σ因子，負責與細胞生長相關(guān)的1 000多個基因的轉(zhuǎn)錄控制，是調(diào)控大腸桿菌耐酸性的最佳對象。

傳統(tǒng)提高大腸桿菌耐酸性能的菌株構(gòu)建方法(如物理/化學(xué)突變、適應(yīng)性進化等)耗時耗力[7]；而代謝工程突變方法，包括glpK、yqhD、gldA、pta、ldhA的敲除和cacKB、cscA、dhaB、dhaR、aldH的過表達都已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用[2-3]。但由于代謝途徑的復(fù)雜性和多樣性，在突變過程中很難獲得一個全局最適表型。隨機片段交換法(randominsertional/deletionalstrandexchangemutagenesis,RAISE)是一種新的突變文庫構(gòu)建方法，它匯集了多種DNA序列的突變形式，各種形式可以單獨發(fā)生，也可以同時發(fā)生。同傳統(tǒng)易錯PCR構(gòu)建突變文庫的方法相比，不僅豐富了突變文庫的突變形式，更提高了突變文庫的篩選效率[8]。Fujii等[9]利用此法對TEM-1型β-內(nèi)酰胺酶進行進化，經(jīng)過3輪突變，使其對頭孢他啶(ceftazidime)的最小抑制濃度提高了5 000倍。因此，以RAISE法替代易錯PCR構(gòu)建基因突變文庫，不僅可以簡化操作步驟，同時又能增強突變文庫的多樣性，大大提高工業(yè)微生物耐酸表型定向篩選的效率。

1實驗

1.1材料與試劑

菌株E.coliDH5α，自行保存；質(zhì)粒PMD18T-vector，TAKARA公司；pKSC[10]，新加坡南陽理工大學(xué)蔣蓉蓉教授贈予。

酵母粉、蛋白胨，英國OXOID公司；DNAmarker、DNA凝膠回收試劑盒，TAKARA公司；卡那霉素，南京生興生物有限公司；瓊脂糖，Promega分裝；其余試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1總DNA的提取[11]

取1～4mLE.coliDH5α的過夜活化菌液，于12 000r·min-1離心2min，棄上清液。菌體沉淀物中加入150μL的TEbuffer(含RNaseA1)，用移液槍吸打至菌體懸浮，提取總DNA。

1.2.2基因克隆和重組表達載體構(gòu)建

根據(jù)GenBank公布的序列設(shè)計引物，下劃線部分分別為EcoRI和HindⅢ的酶切位點：

上游引物F：CCGAATTCTGATTTAACGGCTTAAGTGCCGAAG。

下游引物R：TAAAGCTTGCCGGGTCGGCGGTAAC。

PCR條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

PCR擴增產(chǎn)物用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段，并與T載體連接，轉(zhuǎn)化E.coliDpα，菌落PCR，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒測序。

經(jīng)測序無誤后，小量抽提質(zhì)粒，并用EcoRI和HindⅢ對質(zhì)粒及表達載體pKSC進行雙酶切，分別回收目的片段，連接轉(zhuǎn)化E.coliDpα，挑取陽性克隆。

1.2.3突變文庫的構(gòu)建與篩選

采用RAISE方法構(gòu)建突變文庫。過夜活化菌株E.coliDpα-pKSC-rpoD，并小量抽提質(zhì)粒，用EcoRI和HindⅢ對載體pKSC-rpoD進行雙酶切。膠回收獲得目的片段(2 075 bp)，在含有Tris-HCl(pH=7.0)和MnCl2的緩沖體系中進行RNase-free DNase Ⅰ 酶切。為了避免在重疊PCR過程中產(chǎn)生過多的點突變，MnCl2作為DNase Ⅰ 的協(xié)同作用因子加入到整個體系中，以控制酶切文庫的大小。根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果，在100～300 bp之間的酶切片段中加入EDTA終止酶切反應(yīng)并進行膠回收。在含有膠回收產(chǎn)物、緩沖液和dNTPs的體系中，隨機將TdT添加到目的片段的3′末端。由于DNA聚合酶沒有校正能力，經(jīng)膠回收獲得的片段通過重疊PCR進行重新組裝[8]。完整的RpoD突變片段(RAISE產(chǎn)物)進行PCR擴增。純化后的產(chǎn)物用EcoRI和HindⅢ進行過夜酶切，連接、轉(zhuǎn)化E.coliDpα。轉(zhuǎn)化后的菌株涂布于含有30 μg·mL-1卡那霉素的LB平板上，并隨機挑選白色克隆，轉(zhuǎn)接入新鮮培養(yǎng)基中，即獲得突變文庫。

通過低pH值脈沖實驗對液體突變文庫進行表型篩選。過夜活化后的隨機突變文庫接種到50 mL的LB液體培養(yǎng)基中于37 ℃、200 r·min-1下培養(yǎng)。當菌株生長到對數(shù)生長期前期(OD600=0.3，下同)時，往培養(yǎng)基中加入36%的稀鹽酸將pH值從4.0調(diào)至3.0，連續(xù)轉(zhuǎn)接4次后，將菌株轉(zhuǎn)接入新鮮培養(yǎng)基中，在37 ℃、200 r·min-1下培養(yǎng)2 h。用新鮮培養(yǎng)基沖洗菌株3次，并涂布于含有卡那霉素的LB平板上進行培養(yǎng)。待平板有單菌落長出時，隨機挑選20個單菌落，提取質(zhì)粒測序。為保證實驗結(jié)果的準確性，經(jīng)測序確定突變位點的RpoD突變片段與pKSC空質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化E.coliDpα。具有最優(yōu)耐酸表型的突變菌株將作為第一輪突變篩選的初始菌株，并轉(zhuǎn)接入新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基pH值分別從7.0降到3.0，重復(fù)3輪，以篩選出最優(yōu)耐酸表型的突變菌株。具體方法見圖1。

圖1　突變文庫的篩選方法

1.2.4耐酸性能的初步研究

過夜活化的突變菌株和對照菌株分別轉(zhuǎn)接到LB新鮮培養(yǎng)基中，當菌株生長到對數(shù)生長期前期時，將培養(yǎng)基pH值分別調(diào)至3.0、3.5、4.0、5.0、6.0和7.0，用紫外分光光度計實時監(jiān)測菌株在600 nm下的生長情況。

2結(jié)果與討論

2.1RpoD表達載體的構(gòu)建

首先，以E.coliDpα總DNA為模板，F(xiàn)、R為引物進行PCR擴增，得到分子量為2 075 bp的RpoD完整序列(包含天然啟動子區(qū)域和終止子區(qū)域)。瓊脂糖凝膠電泳顯示，在2 000～3 000 bp之間有一條明顯的條帶，且無非特異性擴增(圖2)。

M.5 000 bp DNA marker　1～10.平板上隨機挑取的10處菌落

然后，將擴增所得目的片段回收，并與T載體連接，轉(zhuǎn)化E.coliDpα。根據(jù)藍白斑篩選方法隨機挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒測序。結(jié)果表明，得到的RpoD序列正確，和基因庫中序列同源性100%、蛋白質(zhì)同源性100%。

為了充分模擬自然條件下菌株的突變情況，本實驗采用低拷貝質(zhì)粒pKSC(拷貝數(shù)為1～5個，以pUC18質(zhì)粒為骨架，復(fù)制子區(qū)域被pSC101的復(fù)制子替換，氨芐青霉素抗性被卡那霉素抗性替換)作為表達載體[5](圖3)。利用EcoRI和HindⅢ對RpoD片段及表達載體pKSC進行酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收純化。通過T4DNA連接酶將目的片段和表達載體連接，轉(zhuǎn)化E.coliDpα，構(gòu)建帶有pKSC-rpoD重組載體的E.coliDpα-pKSC-rpoD初始工程菌株，即本實驗的對照菌株(圖4)。需要特別指出的是，由于pKSC質(zhì)粒拷貝數(shù)偏低，并且大腸桿菌菌株基因組本身即含有rpoD基因，因此在PCR構(gòu)建中容易產(chǎn)生假陽性菌株(對應(yīng)圖4的電泳槽1、2、7泳道)。

2.2突變文庫的構(gòu)建及篩選

以E.coliDpα-pKSC-rpoD為初始菌株，以低pH值為篩選指標，按1.2.3方法構(gòu)建104的突變文庫，重復(fù)3輪，分別以每輪獲得的最優(yōu)突變菌株為下一輪的初始菌株，并逐一進行突變文庫篩選及突變菌株的分離純化，測定每輪篩選出的突變菌株所能耐受的最低pH值，結(jié)果見圖5。

由圖5可看出，采用以上篩選方法，Mutant Ⅲ、Mutant Ⅵ和Mutant Ⅶ分別在第1、2和3輪突變文庫篩選中耐酸性提升最明顯，其中，Mutant Ⅶ在3輪突變文庫構(gòu)建及篩選過程中，因耐酸性能最優(yōu)而被篩選為實驗菌株，用于后續(xù)耐酸性能的進一步研究。

圖3　pKSC質(zhì)粒圖譜

M.10 000 bp DNA marker　3～6.平板上隨機挑取的4處單菌落

圖5RpoD突變耐酸菌株的分離

Fig.5Isolation of acid tolerance RpoD factor mutants

2.3突變菌株突變位點的確定

根據(jù)以上突變文庫的篩選結(jié)果，分別從3輪突變中獲得Mutant Ⅲ、Mutant Ⅵ和Mutant Ⅶ3株耐酸性能提升顯著的突變菌株，過夜活化，37 ℃、200 r·min-1下培養(yǎng)，提取質(zhì)粒測序，以確定每輪突變中最優(yōu)突變菌株的突變位點，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，最優(yōu)突變菌株的突變位點分別為：Mutant Ⅲ:P60S,D204G,S(603～607)deletion;Mutant Ⅵ:T95I,I287V,p18L,T(508～512)deletion；Mutant Ⅶ：F221L,I249F,I521V,E555V,D566N。

圖6　每輪突變中最優(yōu)突變菌株的突變位點

2.4突變菌株的耐酸性能

分別在pH值為3.0、3.5、4.0和7.0條件下，對實驗菌株Mutant Ⅶ的倍增時間進行初步研究，并在pH值為3.0、3.5、4.0、5.0、6.0 和7.0條件下，對Mutant Ⅶ和對照菌株的耐酸性能進行進一步的比較分析，結(jié)果見圖7、圖8。

由圖7可看出，菌株Mutant Ⅶ隨著pH值的降低，倍增時間逐步增加，以pH=7.0時的倍增時間為0進行計算，當pH=3.0時，菌株的倍增時間達到27，但是，相比之前耐酸突變菌株的倍增時間[8]，還有待進

圖7　RAISE突變對每輪菌株耐酸性能的影響

一步縮短。由圖7還可以看出，隨著外部低pH值壓

力的增加，菌株在酸性條件下的生長受到了明顯抑制。

由圖8可看出，在pH=7.0條件下，菌株Mutant Ⅶ與對照菌株的生長率沒有明顯差別，大約為0.900 h-1。同樣的結(jié)果也出現(xiàn)在CRP的低pH值耐受性研究中[5]；當菌株處于低pH值情況下時，突變菌株Mutant Ⅶ和對照菌株的生長都受到了明顯的抑制，但Mutant Ⅶ的生長情況明顯優(yōu)于對照菌株：在pH=3.0時，Mutant Ⅶ的生長率為0.022 h-1，而對照菌株為0.015 h-1。當pH=4.0時，Mutant Ⅶ的生長率為0.034 h-1，明顯高于之前研究中菌株的耐酸性能(0.012 h-1)[5]。表明，在低pH值條件下，Mutant Ⅶ比對照菌株具有非常明顯的生長優(yōu)勢。此外，再次證明突變的σD因子能讓菌株在低pH值條件下更穩(wěn)定地生長。Mutant Ⅶ在所有突變菌株中耐酸性能最佳，但其耐酸機制仍有待進一步研究。

圖8　Mutant Ⅶ和對照菌株在不同pH值條件下的生長情況

3結(jié)論

采用PCR方法，以E.coliDpα基因組DNA為模板，克隆出分子量為2 075 bp的σD編碼基因RpoD，將其與表達載體pKSC連接，并轉(zhuǎn)化E.coliDpα獲得陽性重組子。經(jīng)RAISE方法構(gòu)建104的突變文庫并以低pH值為壓力進行3輪篩選，獲得最優(yōu)耐酸突變菌株Mutant Ⅶ。該菌株比對照菌株在低pH值條件下具有明顯的生長優(yōu)勢，其優(yōu)越的耐酸性能暗示了RAISE方法是一種能構(gòu)建目的突變菌株的有效的突變方法，也進一步證明了突變后的全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子RpoD能讓菌株在低pH值壓力條件下更穩(wěn)定地生長。

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Tailoring of Transcription Factor RpoD by RAISE to Regulate Low pH Value Tolerance ofEscherichiaColi

GAO Xi1,ZHU Li-ying2,ZHOU Wei1,LIANG Shi-zhong3,JIANG Ling1，4

(1.CollegeofBiotechnologyandPharmaceuticalEngineering,NanjingTechUniversity,Nanjing210009,China;2.CollegeofChemistryandMolecularEngineering,NanjingTechUniversity,Nanjing210009,China;3.SchoolofBioscienceandBioengineering,SouthChinaUniversityofTechnology,Guangzhou510641,China；4.CollegeofFoodScienceandLightIndustry,NanjingTechUniversity,Nanjing210009,China)

Abstract：In biorefinery processes,microbial metabolism was seriously suffered by the acid resistance of microbes themselves.To solve this problem,2 075 bp DNA fragment encoding RpoD,including promoter regions and termination regions,was cloned from E.coli DH5α by PCR method.And RAISE method was adopted to engineer the components of global regulator RpoD of E.coli to improve its acid tolerance.The best strain Mutant Ⅶ was identified from 104 random mutagenesis libraries based on the growth performance.Results showed that,under the pH value of 3.0,3.5,4.0,5.0,6.0 and 7.0 conditions,Mutant Ⅶ grew much better than the control strain.It was found that Mutant Ⅶ exhibited a significantly improved growth rate through multiwheel of acid-shock screening,which was 0.022 h(-1) as compared to that of 0.015 h(-1) with the control strain at pH value of 3.0.

Keywords：Escherichia coli;acid tolerance;RpoD;RAISE method

中圖分類號：Q 754

文獻標識碼：A

文章編號：1672-5425(2016)03-0014-05

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.03.004

作者簡介：高茜(1991-)，女，江蘇常州人，碩士研究生，研究方向：微生物學(xué)；通訊作者：江凌，博士，副教授，E-mail：jiangling@njtech.edu.cn。

收稿日期：2015-11-30