王　燕，高　潔，崔建強，王飛娟，張　爽，楊亞婷

(陜西國際商貿學院，陜西 咸陽 712046)

?

陜產貫葉連翹揮發(fā)油的提取工藝優(yōu)化及GC-MS分析

王燕，高潔，崔建強，王飛娟，張爽，楊亞婷

(陜西國際商貿學院，陜西 咸陽 712046)

摘要：以陜產中藥貫葉連翹為原料，采用水蒸氣蒸餾法對其揮發(fā)油進行提取和成分分析。以揮發(fā)油提取率為考核指標，采用單因素實驗與響應曲面法相結合對揮發(fā)油的提取工藝進行優(yōu)化，采用GC-MS對揮發(fā)油成分進行分析鑒定，并通過面積歸一化法比較各組分的相對含量。確定了貫葉連翹揮發(fā)油的最佳提取工藝條件為：浸泡時間21 h、提取時間11 h、液固比5∶1(mL∶g)，在此條件下?lián)]發(fā)油提取率為0.342 mL·(100 g)(-1)；經(jīng)GC-MS分析鑒定出34種化合物，占總成分的94.01%。響應曲面法優(yōu)化得到的貫葉連翹揮發(fā)油提取工藝穩(wěn)定可靠，適用于陜產貫葉連翹揮發(fā)油的提取。

關鍵詞：貫葉連翹；揮發(fā)油；響應曲面法；成分分析；GC-MS

貫葉連翹(Hypericum perforatumL.)，又名貫葉金絲桃，為藤黃科、金絲桃屬多年生草本植物，是傳統(tǒng)的藥用植物，主要分布于陜西、甘肅、河北等地[1]。其藥用歷史達兩千年之久，具有清熱利濕、抑菌止血、疏肝解郁[2-3]、鎮(zhèn)痛和治療皮膚創(chuàng)傷等功效[4]。

貫葉連翹富含多種有效成分，關于其揮發(fā)油的提取、成分分析及應用已成為研究熱點，其方法和藥源的不同也影響揮發(fā)油的提取效率、化學組成及含量[5]。目前已有關于不同產地貫葉連翹中揮發(fā)油的研究[6]，然而對陜產貫葉連翹揮發(fā)油的提取工藝優(yōu)化和化學組成分析的研究尚未見報道。

水蒸氣蒸餾法具有得率較高、能耗較低、操作簡單、無有機溶劑殘留等優(yōu)點[7]。目前，關于陜產貫葉連翹揮發(fā)油的水蒸氣蒸餾提取研究較少，尤其是結合響應曲面法在連續(xù)范圍內進行優(yōu)化分析的研究還未見報道。作者在此采用水蒸氣蒸餾法結合響應曲面法對陜產貫葉連翹揮發(fā)油的提取工藝進行優(yōu)化，并運用氣相色譜-質譜聯(lián)用技術(GC-MS)對揮發(fā)油成分進行分析和鑒定，擬為貫葉連翹的進一步開發(fā)利用提供參考。

1實驗

1.1材料、試劑與儀器

貫葉連翹全草藥材，陜西漢中，購自西安藥材市場，粉碎備用。

無水乙醚、無水硫酸鈉等，均為分析純。

R-201型旋轉蒸發(fā)儀；恒溫水浴鍋；QP2010型氣質聯(lián)用儀，日本島津。

1．2方法

1．2.1揮發(fā)油的提取

準確稱量80g貫葉連翹藥材于揮發(fā)油提取器的圓底燒瓶中，再加入一定量的蒸餾水浸泡一定時間，用水蒸氣蒸餾法加熱回流提取揮發(fā)油，收集餾出液。用乙醚將餾出液反復溶出萃取3次，并用無水硫酸鈉脫水干燥，按下式計算揮發(fā)油提取率Y[mL·(100g)-1]：

Y=V/m

式中：V為揮發(fā)油體積，mL；m為藥材質量，g。

1.2.2揮發(fā)油提取工藝優(yōu)化

1)單因素實驗

按照1.2.1的方法，以揮發(fā)油提取率為考核指標，考察浸泡時間(8h、12h、16h、20h、24h)、提取時間(8h、11h、14h、17h、20h)、液固比(mL∶g，下同，4∶1、5.5∶1、7∶1、8.5∶1、10∶1)等3個因素對揮發(fā)油提取率的影響。

2)響應曲面實驗

在單因素實驗的基礎上，采用Box-Behnken響應曲面法對貫葉連翹揮發(fā)油的提取工藝進行優(yōu)化，以揮發(fā)油提取率為響應值，對影響揮發(fā)油提取率的因素浸泡時間(A)、提取時間(B)和液固比(C)進行3水平實驗設計，Box-Behnken設計的因素與水平見表1。

表1

Box-Behnken設計的因素與水平

Tab.1

Factors and levels of Box-Behnken design

按5個中心點設計安排實驗，共進行17組實驗。

1.2.3揮發(fā)油的GC-MS分析

氣相色譜條件：載氣為高純氦氣(純度≥99.999%)；進樣量1.0 μL；柱流量1.00 mL·min-1；柱前壓57.4 kPa；分流比1∶50；WDB-5彈性石英毛細管色譜柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm)，極性弱。

質譜條件：EI離子源，離子源溫度200 ℃；GC-MS接口溫度230 ℃；質量掃描范圍(m/z)29～450；質譜檢測起測時間2.5 min。應用SHIMADZU GC/MS Solution Release 2.10軟件分析，NIST 147數(shù)據(jù)庫進行檢索，確定每一個組分的化學結構。

2結果與討論

2.1單因素實驗結果

2.1.1浸泡時間對揮發(fā)油提取率的影響

在提取時間14 h、液固比7∶1的條件下，考察浸泡時間對貫葉連翹揮發(fā)油提取率的影響，結果見圖1。

圖1　浸泡時間對揮發(fā)油提取率的影響

由圖1可知，隨著浸泡時間的延長，揮發(fā)油提取率逐漸上升；當浸泡時間為16 h時揮發(fā)油提取率最高，原因是浸泡可使藥材組織細胞充分膨脹，細胞間隙變大，會加速細胞內外的物質交換，促進揮發(fā)油的提取；但當浸泡時間超過16 h后，揮發(fā)油提取率變化不大，可能與實驗季節(jié)環(huán)境溫度偏高、藥材質量變異有關。因此，初步選擇浸泡時間為16 h。

2.1.2提取時間對揮發(fā)油提取率的影響

在浸泡時間16 h、液固比7∶1的條件下，考察提取時間對貫葉連翹揮發(fā)油提取率的影響，結果見圖2。

由圖2可知，隨著提取時間的延長，揮發(fā)油提取率明顯升高；當提取時間為14 h時，揮發(fā)油提取率達到最高，之后隨著提取時間的延長呈下降趨勢，即油類組分減少。表明提取14 h時，揮發(fā)油基本提取完全。因此，初步選擇提取時間為14 h。

2.1.3液固比對揮發(fā)油提取率的影響

在提取時間14 h、浸泡時間16 h的條件下，考察液固比對貫葉連翹揮發(fā)油提取率的影響，結果見圖3。

圖2　提取時間對揮發(fā)油提取率的影響

圖3　液固比對揮發(fā)油提取率的影響

由圖3可知，當液固比小于5.5∶1時，揮發(fā)油提取率變化不明顯；當液固比大于5.5∶1時，揮發(fā)油提取率明顯上升；當液固比為7∶1時，揮發(fā)油提取率達到最高；隨后揮發(fā)油提取率變化相對穩(wěn)定。原因可能為液固比小時不能充分浸泡藥材原料；液固比過大，加熱時溶液沸騰導致原料和揮發(fā)油沾壁，影響提取效果。綜合考慮，初步選擇液固比為7∶1。

2.2響應曲面實驗結果(表2)

2.2.1回歸模型方程的建立及其顯著性檢驗

采用Design-Expert 8.0軟件分析數(shù)據(jù)，得到的二元二次回歸方程為：

Y=-0.054069+0.013245A+0.027903B+0.034875C+1.34896×10-3AB-4.58333×10-4AC+2.12500×10-3BC-8.98437×10-4A2-2.17361×10-3B2-4.66667×10-3C2。

表2

Box-Behnken設計揮發(fā)油提取率的預測值和實測值

Tab.2

Predicted and measured values of extraction

表3

方差分析

Tab.3

Variance analysis

2.2.2揮發(fā)油的響應曲面分析

水蒸氣蒸餾法提取貫葉連翹揮發(fā)油的各個因素之間的響應曲面圖見圖4。

圖4　各因素交互作用對揮發(fā)油提取率的影響

由圖4a可知，保持液固比不變，隨著浸泡時間和提取時間的延長，揮發(fā)油提取率先升高后降低，與擬合方程中浸泡時間的二次項和提取時間的二次項對響應值的影響程度一致，因此，浸泡時間的最佳水平范圍為16～22 h，提取時間的最佳水平范圍為10～16 h。

由圖4b可知，揮發(fā)油提取率隨浸泡時間的延長和液固比的增大出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，浸泡時間和液固比之間的交互作用對響應值有顯著的影響，因此，浸泡時間的最佳水平范圍為16～22 h，液固比的最佳水平范圍為(5～9)∶1。

由圖4c可知，提取時間和液固比之間的交互作用顯著，可以確定提取時間的最佳水平范圍為10～16 h，液固比的最佳水平范圍為(5～9)∶1。

通過模型計算獲得貫葉連翹揮發(fā)油的最佳提取工藝條件為：浸泡時間21.02 h，提取時間11.45 h，液固比5.45∶1。根據(jù)實際操作的需求，修正工藝條件為：浸泡時間21 h，提取時間11 h，液固比5∶1，該條件下平行實驗3次得到貫葉連翹揮發(fā)油的提取率為0.342 mL·(100 g)-1，與揮發(fā)油提取率的預測值0.368 mL·(100 g)-1比較接近，表明該工藝是最優(yōu)的。

2.3揮發(fā)油GC-MS分析

對揮發(fā)油進行GC-MS分析，按峰面積歸一化法得到各成分相對含量，共分離出貫葉連翹揮發(fā)油的36種成分，鑒定出34種化合物(94.01%)，結果見表4。

由表4可知，貫葉連翹揮發(fā)油成分中正十六碳酸(16.39%)、4(14),11-桉葉二烯(9.20%)、十九醇(6.20%)、植醇(5.22%)、十二醇(5.14%)、二十一烷(3.79%)、α-柏木烯(3.72%)等成分相對含量較高。實驗所得的陜產貫葉連翹揮發(fā)油成分與文獻報道的湖南產和國產的貫葉連翹原藥材粗粉的揮發(fā)油成分差異較大，與山東產的貫葉連翹揮發(fā)油成分較為接近[8-9]。原因可能與貫葉連翹揮發(fā)油的提取方法、部位、色譜條件和產地等不同有關[10-12]。

3結論

采用水蒸氣蒸餾法對陜產貫葉連翹揮發(fā)油進行提取，在單因素實驗基礎上采用響應曲面法對提取工藝進行優(yōu)化，獲取的最佳工藝條件下貫葉連翹揮發(fā)油提取率為0.342 mL·(100 g)-1。通過GC-MS對貫葉連翹揮發(fā)油成分進行分析，共鑒定出34種化合物，可為陜產貫葉連翹的進一步開發(fā)利用提供參考。

參考文獻：

[1]郭賀,王興涌.貫葉連翹的研究進展[J].化學工程與裝備,2007,(6):66-68.

[2]蔣尊成,花純宏.貫葉連翹研究新進展[J].中醫(yī)研究,2006,(6):63-64.

[3]吳敏,王霞,許平.貫葉連翹的研究進展[J].中成藥,2004,26(9):74-77.

[4]毛淑才,劉展眉,鄭康成.貫葉連翹提取物的研究新進展[J].時珍國醫(yī)國藥,2006,17(7):1303-1305.

[5]吳晶晶,何宇新,李玲.貫葉連翹的研究進展[J].時珍國醫(yī)國藥,2009,20(2):404-405.

[6]蔣聲海.貫葉連翹的化學成分及其提取方法研究進展[J].中國實用醫(yī)藥,2010,5(32):231-233.表4

貫葉連翹揮發(fā)油的GC-MS分析結果

Tab.4

GC-MS Analysis results of volatile oil from Hypericum perforatum L.

[7]李宏,姜懷春,鄒國林.貫葉連翹活性成分研究新進展[J].中草藥,2001,32(7):83-86.

[8]曾虹燕,周樸華.貫葉連翹揮發(fā)性成分分析[J].中藥材,2000,23(12):752-754.

[9]孟祥穎,郭良,楊明,等.貫葉連翹揮發(fā)油成分的分析[J].分析化學,2003,31(6):689-693.

[10]孫建勛,楊飛,王金梅,等.固相微萃取-氣質聯(lián)用法分析貴州產貫葉連翹葉揮發(fā)性成分[J].中國實驗方劑學雜志,2011,17(11):96-99.

[11]呂英剛,劉世安,吳敏菊,等.山東貫葉連翹揮發(fā)油成分分析[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2007,14(8):42-43.

[12]王小芳,董曉寧,閆世才.貫葉連翹揮發(fā)性化學成分研究[J].西北植物學報,2006,26(6):1259-1262.doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.03.009

Optimization of Extraction Process of Volatile Oil from ShaanxiHypericumPerforatumL. and GC-MS Analysis of Its Chemical Compositions

WANG Yan,GAO Jie,CUI Jian-qiang,WANG Fei-juan,ZHANG Shuang,YANG Ya-ting

(ShaanxiInstituteofInternationalTrade&Commerce,Xianyang712046,China)

Abstract：The volatile oil from Shaanxi Hypericum perforatum L. was extracted by steam distillation,and its chemical compositions were analyzed by GC-MS.The extraction process was optimized by single factor experiment combined with response surface methodology.The contents of each component were compared based on peak area normalization.Results showed that the optimum extraction conditions were soaking time 21 h,extraction time 11 h and liquid-solid ratio 5∶1(mL∶g),respectively.Under optimized conditions,the extraction rate of volatile oil was 0.342 mL·(100 g)(-1),and 34 compounds were identified by GC-MS,accounting for 94.01% of the total amount of extracted compounds.This extraction process obtained by response surface methodology is stable and reliable.It is a feasible method to extract volatile oil from Shaanxi Hypericum perforatum L..

Keywords：Hypericum perforatum L.;volatile oil;response surface methodology;composition analysis;GC-MS

中圖分類號：R 284.2

文獻標識碼：A

文章編號：1672-5425(2016)03-0028-05

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.03.008

作者簡介：王燕(1982-)，女，陜西西安人，講師，主要從事天然藥物有效成分研究，E-mail：370749824@qq.com。

收稿日期：2015-12-03

基金項目：陜西省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科學技術研究項目(15ZY034)，陜西省教育廳專項科研計劃項目(12JK1044)，咸陽市科技成果推廣計劃項目(2015KT-26)