鐘　陽，馮雪松，劉雅茹

(1.中國醫(yī)科大學(xué)公共基礎(chǔ)學(xué)院化學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110122；

2.中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室，遼寧 沈陽 110122)

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黑沙蒿的化學(xué)成分及其生物活性研究

鐘陽1，馮雪松2，劉雅茹1

(1.中國醫(yī)科大學(xué)公共基礎(chǔ)學(xué)院化學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110122；

2.中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室，遼寧 沈陽 110122)

摘要：采用硅膠柱色譜法和高效液相色譜法從黑沙蒿中提取分離出6種黃酮類化合物，通過EIMS、1HNMR、(13)CNMR對化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定，并測定了6種化合物體外抑制大鼠巨噬細(xì)胞生成NO的活性。結(jié)果表明，6種化合物分別為：3，5，3′，4′-四羥基-6，7-二甲氧基黃酮(Ⅰ)、5，3′，4′-三羥基-7-甲氧基二氫黃酮(Ⅱ)、5，7，4′-三羥基-6-甲氧基黃酮(Ⅲ)、5，7，4′-三羥基二氫黃酮(Ⅳ)、3，5，4′-三羥基-7-甲氧基二氫黃酮(Ⅴ)、3，5，7 -三羥基-4′-甲氧基二氫黃酮(Ⅵ)；其中，化合物Ⅲ～Ⅵ為首次從黑沙蒿中分離得到，化合物Ⅰ～Ⅲ對大鼠巨噬細(xì)胞生成NO具有較強(qiáng)的抑制活性。

關(guān)鍵詞：黑沙蒿；黃酮；生物活性；大鼠巨噬細(xì)胞

黑沙蒿(Artemisia ordosicaKrasch)是菊科植物，又名沙蒿、油蒿、鄂爾多斯蒿、籽蒿。黑沙蒿性味辛苦微溫，具有祛風(fēng)濕的功效，可以治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、感冒、咽痛、瘡癤癰腫[1]。文獻(xiàn)報(bào)道，黑沙蒿中含有微量元素[2]、揮發(fā)性成分及黃酮類化學(xué)成分[3]。

NO是由一氧化氮合成酶(NOS)催化L-精氨酸產(chǎn)生的，是一種結(jié)構(gòu)簡單、性質(zhì)活潑且半衰期極短的自由基。NO因參與介導(dǎo)免疫、消滅微生物等眾多生理及病理過程而備受矚目。如：在IL-1、IL-2、TNF、IFN等細(xì)胞因子和LPS等內(nèi)毒素的刺激下巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生大量NO，而NO含量的上調(diào)又可使巨噬細(xì)胞釋放TNF-α、IL-1α和γ-IFN等炎癥性細(xì)胞因子，這些因子對機(jī)體既起到介導(dǎo)炎癥的作用，又起到調(diào)節(jié)細(xì)胞生長分化的作用。所以，在免疫系統(tǒng)中，巨噬細(xì)胞在細(xì)胞內(nèi)、外環(huán)境變化時(shí)可通過與NO間的作用與反作用產(chǎn)生免疫保護(hù)、免疫損傷和免疫調(diào)節(jié)效果[9]，有調(diào)節(jié)并維持機(jī)體穩(wěn)定的作用。

作者提取分離了黑沙蒿所含的6種主要化學(xué)成分，并對其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征，通過活性篩選法，即體外測定NO在大鼠巨噬細(xì)胞中的生成量，測定6種化合物的生物活性，確定黑沙蒿中抑制NO生成的活性成分，擬為黑沙蒿的合理開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1實(shí)驗(yàn)

1.1材料與儀器

黑沙蒿藥材，購自內(nèi)蒙古，經(jīng)深圳清華大學(xué)研究院深圳創(chuàng)新中藥及天然藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室王乃利教授鑒定為菊科植物Artemisia ordosicaKrasch的全草；硅膠，日本關(guān)東化學(xué)。試劑為分析純或化學(xué)純。

LC-6A型高效液相色譜儀、SPD-6A型紫外可見光檢測儀、UV-160型紫外可見分光光度計(jì)，島津；FTIR-300型紅外光譜儀，JASCO；Mercury-300型核磁共振儀，Varian；M-200型質(zhì)譜儀，日立；SG80型硅膠制備柱(10mm×2.5mm)，資生堂；Model-3550型酶標(biāo)儀，Bio-Rad。

1.2提取與分離

取黑沙蒿3kg陰干后粉碎，用80%甲醇浸泡提取4次，減壓回收溶劑后得浸膏611g，上DiaionHP-20 色譜柱，分別用40%甲醇、70%甲醇、100%甲醇、1∶1的醋酸乙酯-甲醇溶液洗脫， 得到6組分，6組分再反復(fù)經(jīng)過硅膠柱色譜及制備高效液相色譜純化得到化合物Ⅰ～Ⅵ。

1.3抑制大鼠巨噬細(xì)胞生成NO的活性測試

6種化合物抑制大鼠巨噬細(xì)胞生成NO的活性測試參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行。空白組為未加樣品、LPS、INF-γ的細(xì)胞培養(yǎng)液，陰性對照組為未加樣品的細(xì)胞培養(yǎng)液，陽性對照組為槲皮素。

2結(jié)果與討論

2.1結(jié)構(gòu)鑒定

化合物Ⅰ：黃色粉末，鹽酸-鎂粉反應(yīng)陽性。C17H14O8，EIMS，m/z:346[M+]；1HNMR(300 MHz，DMSO-d6)，δ:12.43(1H，s，C5-OH)，9.46(3H，brs，C3，C3′，C4′-OH)，7.73(1H，d，J=2.1 Hz，H-2′)，7.57(1H，dd，J=8.4 Hz、2.1 Hz，H-6′)，6.89(1H，d，J=8.4 Hz，H-5′)，6.83(1H，s，H-8)，3.92(3H，s，C6-OCH3)，3.74(3H，s，C7-OCH3)；13CNMR(300 MHz，DMSO-d6)數(shù)據(jù)見表1?；衔铫竦纳鲜龉庾V學(xué)數(shù)據(jù)同文獻(xiàn)[4]中所提供的3，5，3′，4′-四羥基-6，7-二甲氧基黃酮的光譜學(xué)數(shù)據(jù)基本一致。

化合物Ⅱ：白色粉末，鹽酸-鎂粉反應(yīng)陽性。C16H14O6，EIMS，m/z:167[M]+；1HNMR(300 MHz，DMSO-d6)，δ:12.08(1H，s，C5-OH)，9.03(2H，brs，C3′，C4′-OH)，6.87(1H，s，H-2′)，6.73(2H，d，J=0.9 Hz，H-6′,5′)， 6.08(1H，d，J=2.1 Hz，H-8)，6.06(1H，d，J=2.1 Hz，H-6)，5.41(1H，dd，J=3.0 Hz、12.3 Hz，H-2)，2.70(1H，dd，J=3.0 Hz、17.1 Hz，H-3b)，3.23(1H，dd，J=12.6 Hz、17.1 Hz，H-3a)，3.78(3H，s，C7-OCH3)；13CNMR(300 MHz，DMSO-d6)數(shù)據(jù)見表1?；衔铫虻纳鲜龉庾V學(xué)數(shù)據(jù)同文獻(xiàn)[5]中所提供的5，3′，4′-三羥基-7-甲氧基二氫黃酮的光譜學(xué)數(shù)據(jù)基本一致。

化合物Ⅲ：黃色粉末，鹽酸-鎂粉反應(yīng)陽性。C16H12O6，HREIMS：[M]+，300.0633(requires 300.0634)；EIMS，m/z(rel int):301[M+1]+(18.6)，300[M]+(100)，285[M-Me]+(85)，284(11)，283(17)，282[M-H2O]+(75)，258(14)，257[M-43]+(82)，254(20)，153(13)，139(32)，121(12)，119(35)，118(14)?；衔铫蟮纳鲜鲑|(zhì)譜數(shù)據(jù)同文獻(xiàn)[6]中所提供的5，7，4，-三羥基-6-甲氧基黃酮的光譜學(xué)數(shù)據(jù)基本一致。

化合物Ⅳ：褐色結(jié)晶，鹽酸-鎂粉反應(yīng)陽性。1HNMR(300 MHz，DMSO-d6)，δ：12.13(1H，s，C5-OH)，7.30(2H，d，J=8.7 Hz，H-2′,6′)，6.78(2H，d，J=8.7 Hz，H-3′,5′)，5.87(1H，s，H-6)，5.87(1H，s，H-8)，2.67(1H，dd，J=3.0 Hz、17.4 Hz，H-3b)，3.27(1H，dd，J=12.9 Hz、17.4 Hz，H-3a)，5.42(1H，dd，J=12.9 Hz、3.0 Hz，H-2)；13CNMR(300 MHz，DMSO-d6)數(shù)據(jù)見表1?；衔铫舻纳鲜龉庾V學(xué)數(shù)據(jù)同文獻(xiàn)[5]中所提供的5，7，4′-三羥基二氫黃酮的光譜學(xué)數(shù)據(jù)基本一致。

化合物Ⅴ：黃色粉末，鹽酸-鎂粉反應(yīng)陽性。1HNMR(300 MHz，acetone-d6)，δ:7.34(2H，d，J=8.4 Hz，H-2′,6′)，6.82(2H，d，J=8.4 Hz，H-3′,5′)，6.06(1H，d，J=2.1 Hz，H-6)，6.01(1H，d，J=2.1 Hz，H-8)，4.55(1H，d，J=11.7 Hz，H-3)，4.99(1H，d，J=12.9 Hz，H-2)；13CNMR(300 MHz，acetone-d6)數(shù)據(jù)見表1?；衔铫醯纳鲜龉庾V學(xué)數(shù)據(jù)同文獻(xiàn)[7]中所提供的3，5，4′-三羥基-7-甲氧基二氫黃酮的光譜學(xué)數(shù)據(jù)基本一致。

化合物Ⅵ：黃色粉末，鹽酸-鎂粉反應(yīng)陽性。1HNMR(300 MHz，acetone-d6)，δ:7.44(2H，d，J=8.7 Hz，H-2′,6′)，6.96(2H，d，J=8.4 Hz，H-3′,5′)，5.93(1H，d，J=2.1 Hz，H-6)，5.88(1H，d，J=2.1 Hz，H-8)，4.54(1H，d，J=11.4 Hz，H-3)，5.01(1H，d，J=11.4 Hz，H-2)；13CNMR(300 MHz，acetone-d6)數(shù)據(jù)見表1?；衔铫龅纳鲜龉庾V學(xué)數(shù)據(jù)同文獻(xiàn)[8]中所提供的3，5，7-三羥基-4′-甲氧基二氫黃酮的光譜學(xué)數(shù)據(jù)基本一致。

表1

化合物Ⅰ～Ⅵ的13CNMR數(shù)據(jù)

Tab.1

13CNMR Data of compounds Ⅰ～Ⅵ

化合物Ⅲ～Ⅵ為首次從黑沙蒿中分離得到。

2.2抑制大鼠巨噬細(xì)胞生成NO的活性測試結(jié)果(表2)

表2

6種化合物體外抑制大鼠巨噬細(xì)胞

生成NO的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.2

Results of inhibitory effect of 6 compounds on

由表2可知，化合物Ⅰ～Ⅲ對大鼠巨噬細(xì)胞中NO的生成具有較強(qiáng)的抑制活性，IC50分別為36.7 μmol·L-1、38.6 μmol·L-1、35.7 μmol·L-1，三者的活性均較槲皮素(IC50為25.6 μmol·L-1)稍弱。

3結(jié)論

采用硅膠柱色譜法和高效液相色譜法從黑沙蒿中提取分離出6種黃酮類化合物，通過EIMS、1HNMR、13CNMR對化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定，并測定了6種化合物體外抑制大鼠巨噬細(xì)胞生成NO的活性。結(jié)果表明，6種化合物分別為：3，5，3′，4′-四羥基-6，7-二甲氧基黃酮(Ⅰ)、5，3′，4′-三羥基-7-甲氧基二氫黃酮(Ⅱ)、5，7，4′-三羥基-6-甲氧基黃酮(Ⅲ)、5，7，4′-三羥基二氫黃酮(Ⅳ)、3，5，4′-三羥基-7-甲氧基二氫黃酮(Ⅴ)、3，5，7 -三羥基-4′-甲氧基二氫黃酮(Ⅵ)；其中，化合物Ⅲ～Ⅵ為首次從黑沙蒿中分離得到，化合物Ⅰ～Ⅲ對大鼠巨噬細(xì)胞生成NO具有較強(qiáng)的抑制活性。

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Chemical Constituents fromArtemisiaOrdosicaKrasch and Their Bioactivities

ZHONG Yang1,FENG Xue-song2,LIU Ya-ru1

(1.DepartmentofChemistry,SchoolofFundamentalSciences,ChinaMedicalUniversity，Shenyang110122,China；2.DepartmentofPharmaceuticalAnalysis,SchoolofPharmacy,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110122,China)

Abstract：Six kinds of flavonoids were extracted and isolated from Artemisia ordosica Krasch by silica gel column chromatography and high performance liquid chromatography(HPLC).Their structures were identified by EIMS,1HNMR and (13)CNMR,and their activities of inhibiting the formation of NO in rat macrophages in vitro were determined.Results showed that six kinds of flavonoids were 3,5,3′,4′-tetrahydroxy-6,7-dimethoxyflavone(Ⅰ),5,3′,4′-trihydroxy-7-methoxyflavanone(Ⅱ),5,7,4′-trihydroxy-6-methoxyflavone(Ⅲ),5,7,4′-trihydroxyflavanone(Ⅳ),3,5,4′-trihydroxy-7-methoxyflavanone(Ⅴ) and 3,5,7-trihydroxy-4′-methoxyflavanone(Ⅵ).Among them,compounds Ⅲ～Ⅵ were firstly isolated from Artemisia ordosica Krasch,and compounds Ⅰ～Ⅲ exhibited strong inhibitory activities for the formation of NO in rat macrophages.

Keywords：Artemisia ordosica Krasch;flavonoid;bioactivity;rat macrophage

中圖分類號：R 284.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1672-5425(2016)03-0036-03

作者簡介：鐘陽(1987-)，女，遼寧沈陽人，助教，研究方向：藥物化學(xué)；通訊作者：劉雅茹，教授，E-mail：704544116@qq.com。

收稿日期：2015-11-20