李崇斌， 孫　發(fā)， 肖躍海， 田　源

(1.河北省胸科醫(yī)院 泌尿外科， 河北 石家莊　050041; 2.貴州醫(yī)科大學附院 泌尿外科， 貴州 貴陽　550004)

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燃煤型氟中毒大鼠睪丸雄激素結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白表達的變化*

李崇斌1， 孫發(fā)2**， 肖躍海2， 田源2

(1.河北省胸科醫(yī)院 泌尿外科， 河北 石家莊050041; 2.貴州醫(yī)科大學附院 泌尿外科， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 研究燃煤型氟中毒大鼠睪丸雄激素結(jié)合蛋白(ABP)和轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)表達的改變。方法： 105只雄性SD大鼠為研究對象，隨機分為對照組、低氟組、中氟組、高氟組、低氟加營養(yǎng)組、中氟加營養(yǎng)組及高氟加營養(yǎng)組，各染毒組喂飼含不同比例的地氟病區(qū)煤烘玉米的飼料(加營養(yǎng)組添加豆粉)，構(gòu)建燃煤型氟中毒動物模型；各組動物于喂養(yǎng)90、120及180 d分3批處死，觀察氟斑牙、尿氟，免疫組織化學法觀察睪丸ABP和Tf表達的變化。結(jié)果： 大鼠氟斑牙分度和尿氟含量隨時間及染毒劑量增加逐漸加重(高氟組>高氟加營養(yǎng)組>中氟組>中氟加營養(yǎng)組>低氟組>低氟加營養(yǎng)組，180 d>120 d>90 d)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或0.01)；與對照組比較，各染毒組ABP和Tf表達均減少，且隨染毒劑量的增加和時間的延長，表達愈加減少(P<0.05或P<0.01)；在180 d時，同階段同劑量染毒大鼠，加營養(yǎng)組ABP和Tf表達水平較高(P<0.05)。結(jié)論： 在燃煤型氟中毒大鼠睪丸中，隨染毒劑量增加和染毒時間延長，ABP和Tf表達均減少；降低攝氟量及改善營養(yǎng)狀況，可改善燃煤型氟中毒對大鼠睪丸ABP和Tf表達的影響。

[關鍵詞]燃煤型氟中毒； 睪丸； 雄激素結(jié)合蛋白； 轉(zhuǎn)鐵蛋白； 免疫組織化學

氟中毒是一種全身中毒性疾病，不僅對骨骼、神經(jīng)等系統(tǒng)有嚴重影響，研究發(fā)現(xiàn)氟中毒對男性生殖系統(tǒng)也有較大的損傷作用，可導致生殖功能下降，甚至不育[1-3]。燃煤型氟中毒作為慢性氟中毒的一種特殊類型，嚴重影響男性的生殖健康。雄激素結(jié)合蛋白(ABP)和轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)作為一種特殊的中間轉(zhuǎn)運蛋白，在睪丸生精和雄性激素內(nèi)分泌功能中有發(fā)揮重要作用。本實驗通過研究燃煤型氟中毒大鼠睪丸中ABP和Tf表達變化，探討燃煤型氟中毒對睪丸生殖功能的損害機制，為研究燃煤型氟中毒對男性生殖系統(tǒng)的損傷機制提供科學的實驗依據(jù)。

1材料和方法

1.1主要儀器、試劑

Water Purifier超純水機 (四川沃特爾科技發(fā)展有限公司)，H-7650透射電鏡(日本日立)，PXJ-1B型數(shù)字式離子計(江蘇江分電分析儀器有限公司)，10%中性甲醛液，氟化鈉(成都市聯(lián)合化工試劑研究所)，去離子水(貴州醫(yī)科大學公共衛(wèi)生實驗室提供)，ABP、Tf免疫組化試劑盒(武漢博士德)。

1.2實驗動物分組

雄性SD大鼠105只，體質(zhì)量110～130 g，根據(jù)體重均衡、隨機分為對照組、低氟組、中氟組、高氟組、低氟加營養(yǎng)組、中氟加營養(yǎng)組及高氟加營養(yǎng)組，共7組，每組15只。對照組喂飼不含煤烘玉米的正常飼料，低、中、高氟組喂飼含25% 、50% 、75%病區(qū)煤烘玉米的飼料；低氟加營養(yǎng)組、中氟加營養(yǎng)組及高氟加營養(yǎng)組除喂養(yǎng)病區(qū)煤烘玉米外，還在飼料中添加豆粉。測定低氟、中氟、高氟組飼料含氟20、40及60 mg/kg。各組實驗動物飼料配方及含氟量見表1。實驗第90、120、180天以股動脈放血法處死動物[15]。

表1　各實驗組動物飼料配方及含氟量(mg/kg)

(1)對照組玉米含氟量均值為1.3 mg/kg,病區(qū)煤烘玉米含氟量均值為80 mg/kg

1.3檢測指標

分別于實驗90、120及180 d時觀察下列指標。

1.3.1氟斑牙氟斑牙分度標準：Ⅰ度(輕度)為牙表面黃白相間，白堊條紋清晰；Ⅱ度(中度)為牙表面呈無光澤粉筆樣白色；Ⅲ度(重度)為牙表面出現(xiàn)小溝、裂紋或部分脫落，牙齒呈鋸齒狀嚴重缺損。

1.3.2尿氟代謝籠收集處死大鼠前1 d的 12 h尿液，用氟離子選擇電極法測定尿氟含量。

1.3.3ABP及Tf表達以股動脈放血法處死動物，低溫環(huán)境下迅速取出睪丸并固定于10%中性甲醛溶液中，常規(guī)制成病理切片，以SP法行ABP和Tf免疫組織化學染色，陰性對照以PBS代替一抗，具體操作步驟按照試劑盒說明書。細胞質(zhì)著棕黃色者為ABP、Tf表達陽性。每個標本取5張切片，每張切片400倍鏡下隨機選取5個視野，在統(tǒng)一亮度、飽和度、對比度及增益條件下拍照，所得圖片以image pro-plus6.0分析染色結(jié)果，計算光密度(optical density，OD)值。

1.4統(tǒng)計學方法

2結(jié)果

2.1氟斑牙

各染氟組大鼠在90 d開始出現(xiàn)氟斑牙，其分度隨時間及染毒劑量逐漸加重(高氟組>高氟加營養(yǎng)組>中氟組>中氟加營養(yǎng)組>低氟組>低氟加營養(yǎng)組，180 d>120 d>90 d)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)，對照組未發(fā)現(xiàn)氟斑牙，180 d高氟組大鼠均為重度氟斑牙。

2.2尿氟

各染氟組大鼠尿氟含量隨時間及染毒劑量逐漸增高，高氟組>高氟加營養(yǎng)組>中氟組>中氟加營養(yǎng)組>低氟組>低氟加營養(yǎng)組>對照組，180 d>120 d>90 d(P<0.05或P<0.01)，對照組各階段尿氟含量正常。

2.3ABP和Tf表達

免疫組織化學染色結(jié)果顯示，與對照組相比，各染氟組ABP和Tf表達均減少，且隨染氟劑量的增加和時間的延長，表達愈加減少(P<0.05或P<0.01)。180 d各劑量染毒加營養(yǎng)組與同劑量、同階段染毒組相比ABP及Tf表達均較高(P<0.05)。見表1及圖1。

表2　各組大鼠睪丸組織ABP及Tf的OD值(×10-2)

與同時點對照組相比，(1)P<0.05，(2)P<0.01；(3)與同劑量染氟組90 d、120 d比較，P<0.05；(4)與同時點、同劑量染毒組比較，P<0.05

注：A～D分別為180 d 時對照組、高氟組、中氟組及低氟組ABP表達，E～H分別為180 d 時對照組、高氟組、中氟組及低氟組Tf表達圖1　各組大鼠睪丸組織ABP及Tf表達(SP,×100)Fig.1　The expression of ABP and Tf in coal-burning fluorosis rat testis

3討論

至今，已從形態(tài)學到內(nèi)分泌再到基因、分子水平證實氟對男性生殖功能有慢性毒性作用，甚至可導致男性不育[4-8]。ABP和Tf是反映睪丸支持細胞(Sertoli細胞)分泌功能的兩個客觀指標。雄激素結(jié)合蛋白由睪丸支持細胞分泌，特異性地與睪酮結(jié)合并將其運送至整個生殖管道，使生精小管內(nèi)維持較高濃度的睪酮水平，促進精子的產(chǎn)生和成熟，并為生精細胞的生長、發(fā)育及成熟提供適宜的內(nèi)環(huán)境。轉(zhuǎn)鐵蛋白是由肝臟和睪丸支持細胞合成并分泌的。肝臟合成的轉(zhuǎn)鐵蛋白經(jīng)血液運行到睪丸內(nèi)，通過血睪屏障與睪丸支持細胞膜上的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合形成復合物，脫離細胞膜進入細胞內(nèi)的受體配體解偶聯(lián)室，經(jīng)酸化后鐵從轉(zhuǎn)鐵蛋白上脫落下來，以鐵蛋白的形式貯存于支持細胞，而轉(zhuǎn)鐵蛋白與其受體復合物返回細胞表面，與受體解偶聯(lián)后經(jīng)淋巴循環(huán)重新入血。睪丸支持細胞合成的轉(zhuǎn)鐵蛋白與細胞內(nèi)貯存的鐵結(jié)合后以頂端分泌的形式分泌至生精小管管腔內(nèi)，主要被粗線期精母細胞及早期圓形精子細胞的受體所捕獲，釋放鐵并貯存起來，鐵離子供生精細胞利用，促進精子的生成及活力，而不含鐵的轉(zhuǎn)鐵蛋白返回生精小管管腔液中再循環(huán)。由此可見，ABP與Tf對精子的生長、發(fā)育、成熟及精子活力有重要作用，ABP與Tf的合成及分泌減少，可影響生精小管內(nèi)的睪酮水平及鐵離子的含量，使生精細胞的生長發(fā)育障礙，精子活力下降，導致男性生殖功能下降甚至不育。在睪丸組織中，ABP與Tf均由Sertoli細胞分泌，其分泌減少提示Sertoli細胞受到損害。本課題組同期對燃煤型氟中毒大鼠睪丸的超微結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，睪丸支持細胞滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴張甚至呈空泡樣，線粒體減少，脂滴數(shù)量減少，溶酶體增多[7]；同時發(fā)現(xiàn)睪丸間質(zhì)細胞的損傷，導致睪酮的分泌與合成下降，導致生精小管內(nèi)睪酮水平降低，精子生成障礙，并出現(xiàn)一系列的低雄激素的表現(xiàn)。

關于氟對睪丸ABP與Tf表達的影響，國內(nèi)外報道甚少。徐蕊等[9-10]研究發(fā)現(xiàn)，體外分離的Sertoli細胞，低濃度的氟(2.5 mg/L或5 mg/L)作用下ABP的表達升高(P<0.05)；更高氟濃度(10 mg/L、20 mg/L)ABP的表達降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本實驗以雄性SD大鼠為研究對象，通過喂飼含不同比例的病區(qū)煤烘玉米的飼料復制了燃煤型氟中毒動物模型，研究發(fā)現(xiàn)，各染毒組ABP和Tf表達均減少，且隨染毒劑量的增加和時間的延長，表達更低，加營養(yǎng)組與同階段、同劑量染毒組相比，ABP及Tf表達有所增加。

綜上，燃煤型氟中毒可損傷睪丸支持細胞結(jié)構(gòu)及功能，使雄激素結(jié)合蛋白及轉(zhuǎn)鐵蛋白合成及分泌減少，可能為氟中毒損傷男性生殖功能的機制之一，減少毒物的攝入及改善營養(yǎng)狀況，可在一定程度上減輕氟中毒對男性生殖功能的損害。然而，燃煤型氟中毒對男性生殖功能的損害是多方面的，其機制有待于進一步研究。

4參考文獻

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[10]徐蕊,崔留欣.氟對大鼠睪丸支持細胞雄激素結(jié)合蛋白和抑制素B的影響[D].鄭州:鄭州大學碩士研究生論文, 2011.

(2015-11-25收稿，2016-02-22修回)

中文編輯： 周凌； 英文編輯： 劉華

Effects of Coal-burning Fluorosis on Androgen Binding Protein and Transferrin Expressed in Rat Testis

LI Chongbin1, SUN Fa2, XIAO Yuehai2, TIAN Yuan2

(1.DepartmentofUrology,HebeiProvincialChestHospital,Shijiazhuang050041,Hebei,China； 2.DepartmentofUrology,theAffiliatedHospitalofGuiyangMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To study effects of coal-burning fluorosis on expression of androgen binding protein (ABP) and transferrin (Tf) in rat testis. Methods: The male SD rats were randomly divided into 7 groups, including control group, low-dose fluoride group, middle-dose fluoride group, high-dose fluoride group, low-dose fluoride supplemented with nutrition group，middle-dose fluoride supplemented with nutrition group and high-dose fluoride supplemented with nutrition group. The experimental groups were fed with the fodder with different proportions of corn dried by burning coal coming from endemic fluorosis areas to establish the animal model of coal-burning fluorosis(soybean flour was added in nutrition-involved groups). All rats were killed by femoral arterial exsanguination at three times (90 d, 120 d, 180 d), followed by examinations of dental fluorosis, fluorine in urine. Immunohistochemical method was adopted to observe and analyze the changes of expression of ABP and Tf in rat testis. Results: The severity of dental fluorosis and the fluorine content in urine increased gradually along with the increase of exposure dose and time, and the differences between each group were statistically significant(P<0.05 or 0.01). Compared with the control groups, ABP and Tf expression in other experimental groups decreased significantly and with the increase of exposure dose and time, ABP and Tf expression decreased further(P<0.05 or 0.01). At day 180, compared with other groups of the same exposure dose and time, ABP and Tf expression level was relatively higher. Conclusions: With the exposure dose and exposure time extended, ABP and Tf expressed decreasingly in coal-burning fluorosis rat testis. Reducing fluorine intake and improving nutritional status could improve the expression of ABP and Tf in coal-burning fluorosis rat testis.

[Key words]coal-burning fluorosis; testis; androgen binding protein; transferrin; immunohistochemistry

[中圖分類號]R599.5

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)03-0284-04

*[基金項目]中科院“西部之光”項目[黔科合計西光(2011)4003]； 貴州省科技廳國際合作項目(黔科合外G字2012-7015)； 貴州省省長基金[黔省專合字(2010)81]； 貴州省高層次人才基金(TZJF-2011年-27號)； 貴陽市科技局項目[筑科合(2012103)]

**通信作者 E-mail:sfguizhou@163.com

網(wǎng)絡出版時間：2016-03-17網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160317.1031.026.html